Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

Resumen

Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.

Resumen

Las células granulosas del ovario (GC) son la mayor fuente de síntesis de estradiol. Inducida por el aumento preovulatorio de hormona luteinizante (LH), las células de la teca y, en particular, de la capa de células de la granulosa profundamente cambian sus características morfológicas, fisiológicas y moleculares y forman el corpus de la producción de progesterona lúteo que se encarga de mantener el embarazo. Modelos de celulares de cultura son herramientas esenciales para el estudio de los mecanismos reguladores subyacentes implicados en la transformación folliculo-lútea. El protocolo presentado se centra en el procedimiento de aislamiento y criopreservación de GC bovina de folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm). Con esta técnica, puede obtenerse una población casi pura de GC. El procedimiento de criopreservación facilita enormemente el tiempo de gestión de la cultura de célula de trabajo independiente de una fuente de tejido (ovarios) de primaria directa. Este protocolo describe un modelo de cultura de célula libre de suero que imita el estado activo estradiol de GC bovina. Condiciones importantes que son esenciales para un cultivo exitoso celular activo esteroide se discuten en el protocolo. Está demostrado que aumentar la densidad de placas de las células induce una respuesta específica como lo indica una producción de perfil y de la hormona de expresión de gen alterado. Además, este modelo proporciona una base para futuros estudios sobre diferenciación de GC y otras aplicaciones.

Introducción

Luteinización y ovulación exitosa dependen de alteraciones moleculares finamente afinadas y bien orquestadas en tipos de la célula folicular somáticos diversos. Puesto que los detalles de estos procesos de desarrollo no se entienden todavía completamente, más aclaración se requiere. Métodos in vivo son elaborados y costosos y, en particular, no mecanismos moleculares específicos de la dirección que se producen durante la Foliculogénesis. Por lo tanto, modelos reduccionistas en vitro se necesitan además, para proporcionar la penetración en datos de celulares y moleculares. Diferentes estudios describen la cultura de los folículos todo en el contexto de en vitro fecundación técnicas^1,2,3. Porque los investigadores están interesados en los mecanismos de diferenciación, muchos estudios se centran en GC folicular. Estas células, directamente asociadas con el ovocito, son las principales fuentes de producción de estrógeno y, por lo tanto, juegan un papel esencial en la Foliculogénesis y luteinización⁴.

Inmortalizado células de especies diferentes se han desarrollado líneas de GC. La mayoría de ellos, sin embargo, no muestra suficiente hormona esteroide producción⁵. Hasta ahora, sólo uno de células de bovino que GC ha sido establecida⁶, pero esta línea perdió su actividad esteroidogénica después de varios pasajes⁷. Por lo tanto, desde la esteroidogénesis y, en particular, producción de estradiol es un rasgo esencial de la funcionalidad de la GC, es conveniente estudiar estos aspectos en modelos de cultura de célula primaria. En estudios previos, se demostró que sólo se puede observar una producción considerable de estradiol bajo condiciones de cultivo libre de suero^8,9. Además, la suplementación de un precursor de la síntesis de estradiol es otro requisito previo, GC no expresan la enzima necesaria que puede convertir progesterona androstenediona¹⁰. Además, el efecto sinérgico de la FSH y el IGF-1 suplementación en vitro revelaron una actividad optimizada de la aromatasa, la enzima dominante del estradiol síntesis¹¹. En el presente Protocolo, también se describen otros factores importantes que tienen un impacto sustancial en el modelo de cultura de la GC. En particular, la célula galjanoplastia densidad tiene enormes efectos sobre el resultado del experimento¹². Además, se pudo establecer una técnica de criopreservación de GC bovina que no interfiere significativamente con la fisiología de la GC en la cultura. Esta técnica ayuda a mejorar la organización del trabajo de la cultura de célula y a optimizar la densidad de placas preferido.

Protocolo

Nota: Los ovarios bovinos se obtuvieron de un matadero comercial. La colección de subproductos de matadero no requiere una aprobación ética según la ley alemana.

1. condiciones de trabajo y preparativos

1. Para garantizar la esterilidad, realizar todos los medios y preparación de tejido, así como toda cultura de trabajo en un laboratorio de cultura de célula especializada utilizando un banco de flujo laminar.
2. Preparar 1 x de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina para el transporte de los ovarios.
   Nota: La duración máxima entre recibir los ovarios y aislar el GC es de 2 horas en este montaje.

2. aislamiento de células de la Granulosa bovina

1. Lave los ovarios varias veces en PBS 1 x (con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina) para quitar la sangre de la superficie antes de iniciar el procedimiento de aislamiento. Utilizar un vaso de precipitados, coloque los ovarios dentro, llenar con PBS 1 x y descartar el PBS otra vez.
   1. Repita este paso de lavado 3 – 4 x, hasta que los ovarios se limpian de sangre restante.
2. Limpie un ovario con un laboratorio para limpiar con alcohol al 70%, para reducir posibles contaminaciones.
3. Con una jeringa de 3 mL y una aguja de 18 G, Aspire la GC por punción de los folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm, mide con una regla) y el líquido folicular en un tubo de centrífuga de 50 mL.
   Nota: Para humedecer la jeringa, tome una pequeña cantidad de PBS 1 x (con 100 UI penicilina estreptomicina de 0,1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina). Esto ayuda a recoger pequeñas cantidades de líquido folicular y evita que las células se pegue dentro de la jeringa.
4. Después de pinchar varios folículos, enjuague la jeringa y aguja con 1 x PBS para la limpieza intermedia.

3. criopreservación de las células

1. Utilizar la tinción de azul de tripano y contar las células en un hemocitómetro.
   1. Para contar el número de células viables, preparar un tubo con 1,5 μl de una solución de 0.25% azul de trypan.
      Nota: Las células vivas permanecerá sin mancha porque azul trypan sólo puede acceder a la barrera de la célula de células muertas, que luego aparecen en azul.
   2. Añadir 15 μl de la suspensión de células de la granulosa a la solución de azul de tripano y mezclar suavemente.
   3. Coloque la mezcla en ambas cámaras un hemocitómetro. Contar el número de la vida (p. ej., mancha) las células en una gran plaza por cámara.
      Nota: Aunque se observan algunas células de la sangre, se puede distinguir por su tamaño muy pequeño.
   4. Calcular el número de células vivas con la media de ambos cuadrados de cámara según las directrices generales; la proporción de las células vivas puede variar entre los ovarios pero debe exceder 60%¹³.
2. Toma una muestra de la piscina de la célula de granulosa recientemente aisladas como referencia para su posterior análisis.
   1. Dependiendo de la cuenta de célula de la GC aislado, reservar un número adecuado de células como muestras de referencia de RNA, DNA o proteína preparación.
      Nota: Para el aislamiento de RNA y la posterior evaluación de la expresión génica, las 1 x 10⁵ células son suficientes, mientras que otros análisis posteriores podrían requerir un número de células diferentes, generalmente más alta.
   2. Coloque una o varias partes alícuotas de las células de referencia en un fresco tubo y centrifugar durante 1 minuto a temperatura ambiente y velocidad máxima (12.000 x g) para obtener un precipitado de células. Deseche el sobrenadante.
   3. Inmediatamente choque-congelación de las muestras en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a-80 ° C.
3. Llevar a cabo la criopreservación como sigue.
   1. Preparar el medio de congelación con 80% de suero de ternero fetal (FCS) y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO).
   2. Para suavemente de la pelotilla de la GC, centrifugar el GC por 3 min a temperatura ambiente y x 500 g.
   3. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 100% FCS (p. ej., 1 mL) hasta no más celulares macizos son visibles.
   4. Agregar 1 volumen (por ejemplo, 1 mL) del medio de congelación preparado para la suspensión de células y transferir la mezcla a un frasco de criogénico.
      Nota: La concentración final de los medios de protección de cryo será 90% FCS y 10% DMSO.
   5. Coloque el frasco criogénico en un recipiente de congelación (disponible comercialmente) especializado que impide la congelación rápida. La velocidad de enfriamiento de las muestras no debe exceder-1 ° C/min transferencia el recipiente congelación en un congelador de-80 ° C durante al menos 4 h.
   6. Para un almacenaje más largo, coloque los frascos criogénicos en contenedores de ultra baja temperatura (por ejemplo, contenedores de nitrógeno líquido de fase).
      Nota: El protocolo se puede detener aquí, como la criopreservación permite un almacenaje más largo.

4. preparación de medios de comunicación y cultura placas para cultivo celular

1. Capa celular placas con 0,02% de colágeno R.
   Nota: Colágeno R es conocido por ser esencial para una mejor sujeción de GC en cultura.
   1. Preparar una solución de R 0.02% colágeno con agua purificada apta para cultivo celular.
   2. Añadir 150 μL por pocillo de una placa de 24 pocillos (= 2 cm2/pozo) y asegurar que toda la superficie de la cultura está bien cubierta con la solución de colágeno I.
   3. Deje que la solución seque con la tapa abierta durante unas horas o toda la noche en la campana de flujo laminar.
   4. Cuando las placas estén completamente secas, les irradiar con luz ultravioleta durante 10-15 min minimizar la contaminación.
   5. Si es necesario, almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 meses.
2. Preparar los medios de comunicación y suplementos para el trabajo de la cultura bajo una campana de flujo laminar. Para una recuperación exitosa de la GC, tienen que ser procesados inmediatamente después de descongelarla.
3. Preparar los siguientes medios.
   1. Suplemento medio esencial mínimo de α (α-MEM) con 2 mM L-glutamina, bicarbonato de sódico 0,084%, 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM HEPES, selenito de sodio de 4 ng/mL, 5 transferrina μg/mL, 10 ng/mL insulina y 1 mM no esenciales aminoácidos.
   2. Además, agregar estreptomicina penicilina y 0.1 mg/mL 100 UI a los medios de comunicación.
      Nota: Los antibióticos, una vez calentados, son estables durante aproximadamente 48 horas. Por lo tanto, alícuota la cantidad deseada de los medios de comunicación para la creación de cultura y medios de comunicación previsto intercambiar. Caliente previamente sólo las alícuotas de los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua. Los medios preparados pueden conservarse a 4 ° C durante no más de 3 meses.
   3. Para inducir la actividad esteroide en GC bovino cultivada, suplemento del α-MEM además con 20 ng/mL hormona folículo-estimulante (FSH), 50 ng/mL R³ IGF-1 y 2 μm androstenediona.
      Nota: Siempre complementar estos componentes poco antes del inicio de un cambio de cultura o los medios de comunicación. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación para soluciones FSH y el IGF-1, ya que esto podría comprometer la actividad esteroide.

5. trabajo de la cultura de la célula

1. Descongelar las células rápidamente en un baño de agua a 37 ° C durante 3 – 4 minutos y transferir la suspensión de células a 37 ° C con α-MEM (sin suplemento de hormona). Para la centrifugación, se recomienda un volumen final de 10 mL.
2. Centrifugue la GC por 3 min a temperatura ambiente y a 500 x g. Deseche el sobrenadante. Agregar a precalentado y suplido α-MEM y resuspender las células con cuidado.
3. Semilla de la GC en una densidad de 1 x 10⁵ o 1 x 10⁶ células por pocillo en un volumen final de 500 μl. incluye repeticiones técnicas de al menos tres pozos de cultura por condición.
4. Incubar el cultivo de células en una incubadora a 37 ° C con 5% CO₂ para el 8 d.
5. Realizar un intercambio de medios de comunicación todos los días. Reemplazar sólo las dos terceras partes de los medios de cultivo para reducir el estrés y facilitar la adaptación de las células a los medios de comunicación fresco.
   Nota: El GC forman un fenotipo típico de fibroblasto-como después de unos días en la cultura y tienden a agrupan. En la cultura de alta densidad celular, grupos más grandes se encuentran más frecuentemente en comparación con la cultura de densidad normal GC (figura 1, izquierda vs derecha panel).

6. posterior análisis de células de la Granulosa cultivadas

1. Para realizar el análisis de la hormona esteroide, recoger los medios de comunicación y congelar a-20 ° C. Utilizar métodos apropiados para analizar la concentración de estradiol y progesterona en el pasado los medios de comunicación [por ejemplo, radioinmunoanálisis (RIA)]¹⁴.
2. Para el posterior análisis de moléculas diferentes (RNA, DNA, proteínas, etc.), lyse las células directamente en la placa de cultivo con un agente lisis apropiado según lo recomendado por el proveedor.
   Nota: Para la mayoría de los procedimientos de aislamiento, es posible dejar el protocolo, como las células sometidas a lisis pueden conservarse a-20 ° C hasta 1 semana. Para un almacenaje más largo, las células deben ser mantenidas a-80 ° C.
3. Para determinar la abundancia de transcripción, sintetizar cDNA y medir en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (qPCR) la reacción en cadena técnicas¹⁵transcripciones específicas. Una evaluación estadística debe incluir al menos tres réplicas de culturas diferentes de la célula, originadas de preparaciones de diferentes celulares (Replica biológica).

Resultados

GC plateado 1 x 10⁵ células/pozo pantalla un aspecto fibroblasto-como típico ya que forman una extensión celular comparable a fibroblastos y tienden a crear clústeres (Figura 1a y 1C). Aumento de la densidad de placas por 10 veces a 1 x 10⁶ células/pocillo no cambió la morfología pero más racimos de célula pueden observarse (Figura 1b y 1D, flechas). Como ya se indica en una publicación anterior, la capa de colágeno de los platos de la cultura en gran medida mejora la fijación de las células¹³.

Criopreservación de inicial no cambió considerablemente las características fisiológicas de las células en cultivo en comparación con los cultivados directamente de muestras recién aisladas. Esto se muestra en la figura 2 como la abundancia de transcripción (medida por qPCR) de marcador varios genes no difirió al comparar células cultivadas derivadas de piscinas ya sea congelados o recién aislados.

La figura 3 muestra resultados representativos de los análisis de hormonas esteroideas (medido por RIA) en GC bovino cultivada en normal y alta densidad. La concentración de estradiol es disminuyó significativamente en la cultura de alta densidad en comparación con la cultura de densidad normal, mientras que la producción de progesterona tiende a ser mayor.

Un análisis comparativo de varios genes (medido por qPCR) en alta vs densidad normal culturas reveló un efecto significativo (figura 4). CYP19A1, codificación de la enzima clave de la biosíntesis de estradiol aromatasa, así como el receptor de gonadotropinas FSHR, fueron significativamente regula. En contraste, los genes RGS2 y VNN2 demostraron una significativa para arriba-regulación. Estos resultados sugieren claramente que induce procesos específicos de la diferenciación celular mediante el aumento de la célula de densidad de la galjanoplastia.

Figura 1: cultivo de células de la granulosa bovina en normal (paneles de la izquierda) y alta densidad celular (paneles de la derecha). (y c) las células cultivadas con una densidad de 1 x 10⁵ células/pozo muestran un fenotipo típico de fibroblasto-como. (b y d) GC cultivada en una chapado alta densidad (1 x 10⁶ células/pocillo) tienden a formar racimos de célula grande (flechas) con mayor frecuencia en comparación con las células bajo una densidad normal (panel izquierdo). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: comparación de células cultivadas directamente después de aislamiento y criopreservación de. Las células fueron cultivadas con una densidad de 1 x 10⁵ células por pocillo. La expresión génica de varias transcripciones de marcador se evaluó y no reveló ninguna diferencia entre las células cultivadas con o sin una criopreservación inicial. El boxplot muestra la mediana de n = 3. De Student dos colas t-test, p-los valores están incluidos. Esta figura se reproduce de Baufeld y Vanselow¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: concentración de hormonas esteroides en células de la granulosa cultivadas en placas diferentes densidades. La concentración de estradiol (E2) disminuyó significativamente cuando los GC fueron cultivadas en una alta densidad celular, mientras que la concentración de progesterona (P4) sólo tendió a ser mayor. La concentración de la hormona fue corregida para que el contenido de ADN normalizar para un número diferente de células. La media y SEM de n = 3 se muestran. p > 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. Esta figura se reproduce de Baufeld et al. ¹⁵. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Abundancia de transcripciones claves funcionales en células de la granulosa cultivadas en una normal frente a una densidad de placas alta. GC bovino cultivada bajo condiciones libre de suero para el 8 d reveló una regulación específica de varios genes del marcador seleccionado. El boxplot muestra la mediana de n = 3 réplicas individuales. p < 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El modelo de cultura de célula presentado ofrece una herramienta para analizar granulosa célula diferenciación in vitro. Varios estudios demostraron que un cultivo libre de suero es un requisito para mantener la actividad esteroide cultivada bovina GC o GC de otras especies^8,9. Además, cubriendo la placa de cultivo con componentes de la matriz extracelular (p. ej., colágeno I)¹³, mejoró la fijación de las células considerablemente. Otra característica importante es el período de cultivo prolongado. Recientemente, se ha demostrado que una cultura a largo plazo es necesaria para obtener suficiente actividad esteroidogénica y una expresión equilibrada de granulosa célula identidad marcadores¹⁷. Parece que la GC requiere tiempo para recuperarse del estrés físico durante el procedimiento de aislamiento.

Los suplementos de los medios de comunicación FSH, IGF-1 y la androstenediona son conocidos por inducir la actividad de la aromatasa en cultivan GC. Sobre todo, los suplementos con androstenediona es absolutamente necesario, como el GC necesita un precursor para la síntesis de estradiol. Esto ha sido publicado previamente^11,18 y, por lo tanto, no fue más investigado durante el presente estudio. Sin embargo, una adaptación de la FSH, IGF-1 y las concentraciones de androstenediona puede ser necesaria para otros montajes experimentales.

La técnica de criopreservación descrita aquí puede ayudar a mejorar la organización de los experimentos de cultivo de tejidos por lo que los hace más independientes de la fuente variable con los ovarios. Según pruebas previas, la criopreservación no afecta el fenotipo de GC o la producción de esteroides en la cultura. Además, la abundancia de las transcripciones de marcador en las células cultivadas no reveló diferencias significativas comparando muestras preparadas de células recién aisladas con los previamente sometidos a criopreservación¹⁶.

Un parámetro fundamental para el modelo actual de la cultura de GC es la célula placas de densidad. Como se muestra en los Resultados de representante, aumentando la densidad de placas indujo cambios notables de las características fisiológicas y moleculares. Varios genes se regulan de manera específica, que se asemejan a los cambios que son inducidos por la estimulación de la LH en vivo^4,19. El hecho de que un aumento de la densidad celular puede conducir a procesos de diferenciación como en GC bovino cultivada debe considerarse meticulosamente en este modelo de GC en vitro para evitar resultados contradictorios entre repeticiones. Por lo tanto, resultados contradictorios con otros estudios podrían atribuirse a las densidades celulares diferentes y deben ser examinadas más de cerca.

El modelo de cultura descrito aquí se reveló que no responden a la LH, como los transcritos del receptor de la LHCGR están cerca del límite de detección. Por lo tanto, una simulación de la oleada de LH por igual la situación en vivo no pudo inducir diferenciación¹³. Sin embargo, este modelo proporciona una herramienta útil para el estudio activo estradiol GC en cultivo primario, en particular como no funcional bovinas líneas de GC existen en la actualidad.

Diferentes protocolos de tratamiento pueden probarse en el actual modelo de cultura de la GC que ayudan a desentrañar los mecanismos de regulación de la producción de esteroides o diferenciación de GC. Factores más, solos que están involucrados en procesos de desarrollo pueden analizarse por separado. Por lo tanto, este modelo de cultura proporciona una base para muchas aplicaciones diferentes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 ml syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 ml)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/ml)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol