Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Résumé

On décrit un modèle de culture à long terme des cellules de la granulosa bovine dans des conditions sans sérum. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les effets de divers facteurs et conditions comme placage à différentes densités sur les caractéristiques de la production d’oestrogène les cellules granuleuses bovine.

Résumé

Cellules de la granulosa ovarienne (GC) sont la principale source de la synthèse de l’estradiol. Induite par l’augmentation pré-ovulatoire l’hormone lutéinisante (LH), les cellules de la thèque et, en particulier, de la couche de cellules de la granulosa profondément modifier leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires et forment le corpus de la production de progestérone jaune qui est responsable du maintien de la grossesse. Modèles de culture de cellules sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes de régulation sous-jacents impliqués dans la transformation folliculo-lutéale. Le protocole présenté met l’accent sur la méthode d’isolement et la cryoconservation des bovin GC de follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm). Avec cette technique, on trouvera une population presque pure de GC. La procédure de cryoconservation facilite grandement le temps de gestion de la culture cellulaire fonctionner indépendamment de la fourniture de tissus (ovaires) direct primaire. Ce protocole décrit un modèle de culture sans sérum cellulaire qui imite le statut d’estradiol active de GC bovine. Des conditions importantes qui sont essentielles pour une culture réussie stéroïde-actif cellulaire sont discutées dans tout le protocole. Il est démontré qu’augmentant la densité de placage des cellules induit une réponse spécifique comme indiqué par une production de profil et de l’hormone d’expression gène altéré. En outre, ce modèle offre une base pour poursuivre ses études sur la différenciation des GC et autres applications.

Introduction

Luteinization et ovulation réussie dépendent des altérations moléculaires finement à l’écoute et bien orchestrées dans types de différentes cellules folliculaires somatique. Étant donné que les détails de ces processus de développement ne sont pas encore bien compris, outre des précisions sont nécessaires. Des approches in vivo sont complexes et coûteuses et, en particulier, ne sont pas des mécanismes moléculaires spécifiques adresse qui se produisent au cours de la folliculogenèse. Par conséquent, réductionniste dans vitro modèles sont nécessaires en outre, pour donner un aperçu des détails cellulaires et moléculaires. Différentes études décrivent la culture des follicules ensemble dans le contexte de in vitro fertilization techniques^1,2,3. Parce que les chercheurs s’intéressent aux mécanismes de la différenciation, de nombreuses études se concentreront sur GC folliculaire. Ces cellules, directement associées à l’ovocyte, sont les principales sources de production d’oestrogènes et, ainsi, jouent un rôle essentiel tout au long de la folliculogenèse et luteinization⁴.

Immortalisée cell lines de GC ont été développés de différentes espèces. La plupart d'entre eux, cependant, ne montre pas une suffisante hormone stéroïde production⁵. Jusqu'à présent, qu’une seule lignée de bovins que GC a été établie⁶, mais cette ligne a perdu son activité stéroïdogène après plusieurs passages⁷. C’est pourquoi, depuis la stéroïdogenèse et, en particulier, production d’estradiol est une caractéristique essentielle de la fonctionnalité de GC, il est conseillé d’étudier ces aspects dans les modèles de culture de cellules primaires. Dans des études antérieures, il a été démontré qu’une production considérable d’estradiol ne peut être observée sous des conditions de culture sans sérum^8,9. Plus loin, lorsqu’il s’agit d’un précurseur de la synthèse de l’estradiol est une autre condition préalable, comme le GC ne parviennent pas à exprimer l’enzyme nécessaire qui peut convertir la progestérone en androstènedione¹⁰. De plus, l’effet synergique de FSH et IGF-1 supplementation in vitro ont démontré une activité optimisée de l’aromatase, l’enzyme clé de l’estradiol de synthèse¹¹. Dans le présent protocole, les autres facteurs importants qui ont un impact important sur le modèle de culture de GC sont également décrites. En particulier, la cellule placage densité a des effets considérables sur les résultats de l’expérience de¹². En outre, une technique de cryoconservation de GC bovine qui n’interfère pas significativement avec la physiologie de la GC dans la culture pourrait être créée. Cette technique permet d’améliorer l’Organisation des travaux de culture de cellules et d’optimiser la densité placage préféré.

Protocole

Remarque : Les ovaires Bovine ont été obtenues dans un abattoir commercial. La collecte des sous-produits de l’abattoir n’exige pas une approbation éthique selon le droit allemand.

1. Conditions de travail et préparations

1. Afin de garantir la stérilité, effectuer tous les supports et préparation du tissu, mais aussi toute la culture travaille dans un laboratoire de culture de cellules spécialisées à l’aide d’un banc de flux laminaire.
2. Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), additionnée de 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine pour le transport des ovaires.
   Remarque : La durée maximale entre la réception des ovaires et isoler le GC est de 2 h dans ce set-up.

2. isolement des cellules de la Granulosa Bovine

1. Laver les ovaires plusieurs fois dans du PBS 1 x (avec 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine) pour enlever le sang de la surface avant de commencer la procédure d’isolement. Utiliser un bécher, placer les ovaires à l’intérieur, remplissez-le avec du PBS 1 x et jeter les PBS à nouveau.
   1. Répétez cette étape de lavage 3 – 4 x, jusqu'à ce que les ovaires sont nettoyés de tout sang restant.
2. Essuyer un ovaire utilisant un laboratoire imbibé d’alcool à 70 %, afin de minimiser les contaminations possibles.
3. Avec une seringue de 3 mL et une aiguille 18 G, aspirer la GC par ponction des follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm, mesuré avec une règle) et mettre en commun le liquide folliculaire dans un tube à centrifuger 50 mL.
   Remarque : Pour humidifier la seringue, prendre une petite quantité de PBS 1 x (avec 100 UI la pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine). Cela aide à percevoir de petits montants de liquide folliculaire et empêche les cellules de s’en tenir à l’intérieur de la seringue.
4. Après perforation de plusieurs follicules, rincer la seringue et l’aiguille avec 1 x PBS pour le nettoyage intermédiaire.

3. la cryoconservation des cellules

1. Utiliser une coloration bleu trypan et compter les cellules sous un hémocytomètre.
   1. Pour compter le nombre de cellules viables, préparer un tube avec 1,5 µL d’une solution de bleu de trypan de 0,25 %.
      Remarque : Les cellules vivantes restera sans tache parce que le bleu trypan ne peut accéder à la barrière cellulaire des cellules mortes, qui apparaissent alors en bleu.
   2. Ajoutez 15 µL de la suspension de cellules de la granulosa à la solution de bleu de trypan et mélanger doucement.
   3. Placer le mélange dans les deux chambres un hémocytomètre. Compter le nombre de vie (p. ex., non souillées enregistré) de cellules dans une grande place par chambre.
      Remarque : Bien que certaines cellules sanguines peut être vu, ils se distingués par leur très petite taille.
   4. Calculer le nombre de cellules vivantes avec la moyenne des deux carrés de chambre selon les orientations générales ; la proportion de cellules vivantes peut varier entre ovaires mais devrait dépasser 60 %¹³.
2. Prélever un échantillon provenant du pool de cellules de granulosa fraîchement isolées comme une référence pour une analyse ultérieure.
   1. Selon le nombre d’éléments du CG isolé, mis de côté un nombre adéquat de cellules sous forme d’échantillons de référence pour ARN, ADN ou préparation de protéine.
      Remarque : Pour l’ARN et l’évaluation ultérieure de l’expression génique, 1 x 10⁵ cellules sont suffisantes, alors que d’autres analyses subséquentes peuvent nécessiter le nombre de cellules différentes, généralement plus élevés.
   2. Placez une ou plusieurs parties aliquotes des cellules de référence dans un nouveau tube et il Centrifuger pendant 1 min à température ambiante et la vitesse maximale (12 000 x g) pour obtenir un culot cellulaire. Jeter le surnageant.
   3. Immédiatement-congélation des échantillons dans l’azote liquide. Conserver l’échantillon à-80 ° C.
3. Effectuer la cryoconservation comme suit.
   1. Préparer le milieu de congélation à l’aide de 80 % de sérum de veau foetal (FCS) et 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO).
   2. Pour doucement à pellets le GC, centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et 500 x g.
   3. Retirez le surnageant soigneusement et doucement remettre les cellules en suspension dans 100 % FCS (p. ex., 1 mL) jusqu'à ce qu’aucune cellule plus massifs sont visibles.
   4. Ajouter 1 volume (p. ex., 1 mL) du médium gel préparé à la suspension cellulaire et transférer le mélange dans un flacon cryogénique.
      Remarque : La concentration finale des médias cryo-protection sera 90 % FCS et 10 % DMSO.
   5. Placez la cuvette cryogénique dans un conteneur de congélation (disponible dans le commerce) spécialisé qui empêche la congélation rapide. Le taux de refroidissement des échantillons ne doit pas dépasser-1 ° C/min. transfert du conteneur congélation dans un congélateur-80 ° C pendant au moins 4 h.
   6. Pour une conservation plus longue, placez les coupes cryogéniques dans les conteneurs d’ultra basse température (par exemple, conteneurs d’azote liquide phase).
      Remarque : Le protocole peut être arrêté ici, car la cryoconservation permet une conservation plus longue.

4. préparation des supports et plaques de Culture pour la Culture cellulaire

1. Enduire les plaques de culture cellulaire avec 0,02 % collagène R.
   Remarque : Le collagène R est connu pour être indispensable pour une meilleure saisie des GC dans la culture.
   1. Préparer une solution de R de collagène de 0,02 % à l’eau purifiée pour culture cellulaire.
   2. Ajouter 150 µL / puits dans une plaque 24 puits (= 2 cm2/bien) et s’assurer que la surface entière de la culture est bien couvert avec la solution de collagène R.
   3. Laissez la solution sécher avec le couvercle ouvert pendant quelques heures ou toute la nuit dans la hotte à flux laminaire.
   4. Lorsque les plaques de culture sont complètement sèches, elles irradient avec lumière UV pendant 10-15 min minimiser la contamination.
   5. Si nécessaire, stocker les plaques à 4 ° C pendant 2 mois.
2. Préparer les médias et les suppléments pour la culture sous une hotte à flux laminaire. Pour une récupération réussie de la GC, elles doivent être traitées immédiatement après décongélation.
3. Préparer les supports suivants.
   1. Compléter un milieu essentiel α-Minimal (α-MEM) avec 2 mM de L-glutamine, bicarbonate de sodium de 0,084 %, 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 20 mM HEPES, sélénite de sodium 4 ng/mL, 5 transferrine µg/mL, 10 ng/mL d’insuline et des acides aminés non essentiels 1 mM.
   2. En outre, ajouter 100 UI la pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine aux médias.
      Remarque : Les antibiotiques, une fois réchauffés, sont stables pendant environ 48 heures. Par conséquent, aliquote la quantité désirée de médias pour la mise en place de la culture et des médias prévues d’échange. Réchauffez seulement les aliquotes de médias à 37 ° C dans un bain d’eau. Les supports préparés peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 3 mois.
   3. Pour induire l’activité stéroïde en élevage bovin GC, Supplément le α-MEM en outre avec l’hormone de 20 ng/mL folliculo - stimulante (FSH), 50 ng/mL R³ IGF-1 et 2 µM androstènedione.
      NOTE : Toujours compléter ces composants peu avant le début d’un échange de culture ou des médias. Éviter les cycles de gel-dégel répétés pour des solutions mères FSH et d’IGF-1, car cela pourrait compromettre l’activité stéroïde.

5. cellule Culture travail

1. Décongeler les cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C pendant 3 à 4 min et transférer la suspension cellulaire à 37 ° C préchauffé α-MEM (sans supplément d’hormone). Pour la centrifugation, un volume de 10 mL est recommandé.
2. Centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et à 500 x g. Jeter le surnageant. Ajouter le α-MEM préchauffé et complétée et remettre en suspension les cellules soigneusement.
3. Semences du GC à une densité de 1 x 10⁵ ou 1 x 10⁶ cellules / puits dans un volume final de 500 µL. incluent réplicats techniques d’au moins trois puits de culture par l’État.
4. Incuber la culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 8 jours.
5. Effectuer un échange de médias tous les deux jours. Remplacer seulement les deux tiers des milieux de culture pour réduire le stress et pour faciliter l’adaptation des cellules pour les supports neufs.
   Remarque : Le CG forment un phénotype typique de fibroblastes-comme après quelques jours de culture et ont tendance à se regrouper ensemble. Dans la culture de cellule haute-densité, clusters plus importants sont trouvent plus fréquemment par rapport à la culture de densité normale GC (Figure 1, panneau de droite gauche vs ).

6. analyse des cellules de la Granulosa cultivées

1. Pour effectuer une analyse des hormones stéroïdiennes, recueillir les médias et le congeler à-20 ° C. Utiliser des méthodes appropriées pour analyser la concentration d’estradiol et de progestérone dans le médias usé [par exemple, le dosage radio-immunologique (RIA)]¹⁴.
2. Pour l’analyse ultérieure des molécules cibles différentes (ARN, ADN, protéines, etc.), lyser les cellules directement dans la boîte de Petri avec un agent de lyse approprié tel que recommandé par le fournisseur.
   Remarque : Pour la plupart des procédures d’isolement, il est possible d’arrêter le protocole ici, comme les cellules lysées peuvent être stockés à-20 ° C pendant 1 semaine. Une conservation plus longue, les cellules doivent être conservés à-80 ° C.
3. Pour déterminer l’abondance de la transcription, synthèse de cDNA et mesurer les transcriptions précises par quantitative Real-Time polymerase chain réaction (qPCR) techniques¹⁵. Une évaluation statistique doit inclure au moins trois répétitions de cultures de cellules différentes, originaires de préparations de cellules différentes (réplique biologique).

Résultats

GC plaqué à 1 x 10⁵ cellules/puits Visualisez une apparence typique de fibroblastes car elles constituent un prolongement cellulaire comparable aux fibroblastes et ont tendance à construire des clusters (Figure 1 a et 1C). Augmente la densité bordé par un facteur 10 à 1 x 10⁶ cellules/puits n’a pas changé la morphologie mais on peuvent observer plusieurs agrégats cellulaires (Figure 1 b et 1D, flèches). Comme déjà indiqué dans une publication précédente, la couche de collagène de la vaisselle de la culture a largement amélioré l’attachement des cellules¹³.

Cryoconservation initiale n’a pas considérablement changé les caractéristiques physiologiques des cellules en culture par rapport à celles cultivées directement des échantillons fraîchement isolées. Cela est montré dans la Figure 2 que l’abondance de transcription (mesuré par qPCR) du marqueur plusieurs gènes ne différaient pas quand en comparant des cellules dérivées de piscines soit congelés soit fraîchement isolées.

La figure 3 montre des résultats représentatifs de l’analyse de l’hormone stéroïde (mesuré par RIA) en GC bovine cultivée à normal vs haute densité. La concentration d’estradiol est significativement diminuée dans la culture haute densitée par rapport à la culture de densité normale, alors que la production de progestérone ont tendance à être plus élevé.

Une analyse comparative de plusieurs gènes (mesuré par qPCR) en haute - vs densité normale cultures révèle un effet significatif (Figure 4). CYP19A1, codant l’enzyme clé de l’aromatase biosynthèse d’estradiol, ainsi que le récepteur de gonadotrophine FSHR, étaient significativement diminuées. En revanche, les gènes RGS2 et VNN2 ont montré une régulation significative. Ces résultats indiquent clairement que les procédés spécifiques de la différenciation cellulaire sont induits en augmentant la cellule densité de placage.

Figure 1 : cultivé des cellules de la granulosa bovin normal (panneaux de gauche) et haute densité cellulaire (panneaux de droite). (a et c) cellules cultivées à une densité de 1 x 10⁵ cellules/puits affichent un phénotype typique de fibroblastes-like. (b et d) GC cultivé à une densité de placage haut (1 x 10⁶ cellules/puits) tendance à former des grappes de grandes cellules (flèches) plus fréquemment par rapport à des cellules dans une densité normale (panneau de gauche). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : comparaison des cellules cultivées directement après l’isolement et après cryoconservation. Les cellules sont cultivées à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits. L’expression des gènes de plusieurs transcriptions de marqueur a été évaluée et a révélé aucune différence entre les cellules cultivées avec ou sans une cryoconservation initiale. La boxplot montre la médiane de n = 3. De l’étudiant à deux t-test, les p-valeurs sont incluses. Cette figure est reproduite de Baufeld et Véronique¹⁶. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : concentration d’hormones stéroïdes dans les cellules de la granulosa cultivées à placage à différentes densités. La concentration d’oestradiol (E2) diminue significativement quand GC ont été cultivées à une densité cellulaire élevée, alors que la concentration de progestérone (P4) seulement tendance à être plus élevé. La concentration de l’hormone a été corrigée pour le contenu en ADN normaliser pour nombre de cellules différentes. La moyenne et la SEM de n = 3 sont indiquées. p > 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. Cette figure est reproduite de Baufeld et al. ¹⁵. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Abondance de fonctionnels clés transcrits dans les cellules de la granulosa cultivées à une normale par rapport à une densité placage haut. Bovine GC cultivée dans des conditions sans sérum pendant 8 jours ont révélé un règlement spécifique de plusieurs gènes sélectionnés. La boxplot affiche la valeur médiane de n = 3 répétitions individuelles. p < 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le modèle de culture cellulaire présenté fournit un outil pour analyser la granulosa de différenciation cellulaire in vitro. Plusieurs études ont montré qu’une culture sans sérum est une condition sine qua non pour maintenir l’activité stéroïde en élevage bovin GC ou GC autres espèces^8,9. En outre, revêtement de la boîte de Pétri avec les composants de la matrice extracellulaire (p. ex., collagène R)¹³, la fixation des cellules considérablement améliorée. Une autre caractéristique importante est la période de culture prolongée. Récemment, il a été démontré qu’une culture à long terme est nécessaire pour obtenir une activité stéroïdogène suffisante et une expression équilibrée de la granulosa cellule identité marqueurs¹⁷. Il semble que le GC nécessite le temps de récupérer du stress physique au cours de la procédure d’isolement.

Les suppléments de médias FSH, IGF-1 et l’androstènedione sont connus pour induire l’activité d’aromatase dans culture GC. En particulier, la supplémentation en androstènedione est absolument nécessaire, comme le GC besoin un précurseur pour la synthèse de l’estradiol. Cela a été publié précédemment^11,18 et, par conséquence, n’a pas encore examiné au cours de la présente étude. Cependant, une adaptation des concentrations de l’androstènedione, IGF-1 et FSH peut être nécessaire pour les autres montages expérimentaux.

La technique de cryoconservation décrite ici peut aider à améliorer l’Organisation des expériences de culture de tissu en les rendant plus indépendantes de l’alimentation variable avec les ovaires. Selon des analyses précédentes, cryoconservation n’affecte pas le phénotype GC ou la production de stéroïdes dans la culture. En outre, l’abondance des transcriptions de marqueur dans les cellules cultivées n’a pas révélé des différences significatives en comparant les échantillons préparés à partir des cellules fraîchement isolées avec ceux précédemment soumises à la cryoconservation¹⁶.

Un paramètre déterminant pour le présent modèle de culture de GC est la cellule densité de placage. Comme en témoignent les Résultats de représentant, augmentant la densité placage induit des changements remarquables caractéristiques physiologiques et moléculaires. Plusieurs gènes sont régulés de manière spécifique, ressemblant à des changements qui sont induits par la stimulation de LH en vivo^4,19. Le fait qu’une augmentation de la densité cellulaire peut piloter des processus de différenciation-comme dans l’élevage bovin GC est à considérer méticuleusement ce modèle de in vitro GC afin d’éviter des résultats contradictoires entre les répétitions. Par conséquent, des résultats contradictoires avec d’autres études pourraient être attribuées à des densités cellulaires différentes et doivent être examinées de plus près.

Le modèle de culture décrit ici révélé être irrecevable à LH, comme les transcriptions du récepteur LHCGR sont proches de la limite de détection. Par conséquent, une simulation de la LH tant la situation in vivo n’a provoqué aucune différenciation¹³. Néanmoins, ce modèle fournit un outil utile pour étudier l’estradiol active GC en culture primaire, en particulier car aucune fonctionnelle bovine GC lignes existent à l’heure actuelle.

Protocoles de traitement différents peuvent être testés dans le présent modèle de culture GC qui contribuent à élucider les mécanismes de régulation de la production de stéroïdes ou de différenciation de la GC. En outre, seul des facteurs qui participent au processus de développement peuvent être analysés séparément. Par conséquent, ce modèle de culture fournit une base pour de nombreuses applications.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 ml syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 ml)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/ml)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol