Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Özet

Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Özet

Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.

Giriş

Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri^1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization⁴boyunca önemli bir rol oynamaktadır.

GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi⁵göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır⁶kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar⁷' den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları^8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion¹⁰' a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez¹¹anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre¹²deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.

Protokol

Not: Sığır yumurtalıklar ticari bir mezbaha elde edilmiştir. Mezbaha yan topluluğu Alman yasalarına göre etik bir onay gerektirmez.

1. çalışma koşulları ve hazırlıkları

1. Kısırlık garantilemek için tüm medya gerçekleştirmek ve doku hazırlık yanı sıra tüm kültür bir laminar akış Bank kullanarak bir özel hücre kültür laboratuarda çalışıyorum.
2. 1 x 100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve yumurtalık taşıtlar için 0,5 µg/µL amfoterisin ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) hazırlayın.
   Not: Bu kurulum içinde 2 h yumurtalık alma ve GC yalıtma arasında maksimal süresi kadardır.

2. izolasyon sığır Granulosa hücre

1. Yalıtım yordamına başlamadan önce yüzeyden herhangi bir kan kaldırmak için yumurtalıklarda birkaç kez 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) yıkayın. Bir ölçek kullanın, yumurtalık içinde yer, 1 x PBS ile doldurun ve PBS tekrar atmak.
   1. Yumurtalık kalan herhangi bir kan temizlenir bu kadar yıkama 3 – 4 x, tekrarlayın.
2. Bir yumurtalık mümkün contaminations en aza indirmek için % 70 alkol ile batırılmış bir laboratuvar silin kullanarak silin.
3. 3 mL şırınga ve bir 18 G iğne ile küçük ve orta boyutlu köklerinin delinme tarafından GC Aspire edin (< cetvelle ölçülür 6 mm) ve bir 50 mL santrifüj tüpü foliküler sıvı Havuzu.
   Not: şırınga nemlendirmek için 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) küçük bir miktar alır. Bu Folliküler sıvı az miktarda toplamak için yardımcı olur ve hücre şırınga yapışmasını önler.
4. Birkaç köklerinin delinme sonra şırınga ve iğne ara temizlik için 1 x PBS ile yıkayın.

3. hücre dondurma

1. Trypan mavi boyama kullanın ve bir hemasitometre altında hücreleri saymak.
   1. Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak.
      Not: trypan mavi mavi görünür ölü hücreleri hücre bariyer sadece erişebildiğinden canlı hücreler günahı kalır.
   2. 15 µL granulosa hücre süspansiyon trypan mavi ekleyin ve onları hafifçe karıştırın.
   3. Karışımı bir hemasitometre her iki odasında yerleştirin. Yaşam saymak (günahıÖrneğin,) bir büyük kare başına odası hücrelerde.
      Not: her ne kadar bazı kan hücreleri görülebilir, onlar onların çok küçük boyutuna göre ayrılır.
   4. Genel esaslarına göre her iki odası kareler ortalaması ile canlı hücreler sayısını hesaplamak; canlı hücreler oranını yumurtalık arasında değişebilir ama %60¹³aşmalıdır.
2. Bir örnek daha ayrıntılı bir çözümleme için bir başvuru olarak taze izole granulosa hücre havuzundan al.
   1. İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara.
      Not: sonraki diğer analizleri farklı, genellikle yüksek hücre sayıları gerektirebilir RNA izolasyon sonraki gen ifadesinin değerlendirilmesi için 1 x 10⁵ hücreleri yeterli, olanlardır.
   2. Bir veya daha fazla aliquots başvuru hücre taze bir tüp içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında ve hücre Pelet elde etmek için en yüksek hızı (12.000 x g) 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
   3. Hemen şok-örnekleri sıvı azot kıpırdama. Örnek-80 ° C'de depolayın
3. Dondurma aşağıdaki gibi yapın.
   1. Dondurucu orta % 80 fetal buzağı serum (FCS) ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hazırlayın.
   2. Yavaşça GC cips için GC için oda sıcaklığında ve 500 x g3 dk santrifüj kapasitesi.
   3. Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın ve yavaşça hücreleri resuspend yok daha fazla hücre kadar % 100 FCS (Örneğin, 1 mL) içinde kümeleri görülebilir.
   4. 1 birim (Örneğin, 1 mL) hazır dondurma Orta hücre süspansiyon ekleyin ve karışımı kriyojenik bir şişe aktarın.
      Not: Soğutucu koruma medya son konsantrasyonu % 90 FCS ve % 10 DMSO olacaktır.
   5. Kriyojenik şişeyi hızlı donma engelleyen bir uzman (ticari olarak mevcut) dondurma kapsayıcısına getirin. Soğutma hızı örnekleri-1 ° C/dak Transfer dondurma konteyner içine en az 4 h için-80 ° C dondurucu aşmaması gerekir.
   6. Daha uzun depolama için kriyojenik şişeleri Ultra düşük sıcaklık kaplarda (Örneğin, sıvı faz azot konteynerler) yerleştirin.
      Not: protokol, burada, dondurma daha uzun depolama sağlar gibi durdurulabilir.

4. medya ve kültür plakaları için hazırlanması hücre kültürü

1. Hücre kültür plakaları %0.02 kollajen R. ile kat
   Not: Kollajen R GC geliştirilmiş bir ek olarak kültür için gerekli olduğu bilinmektedir.
   1. Arıtılmış su hücre kültürü için uygun bir %0.02 kollajen R çözümle hazırlayın.
   2. İyi ücret 150 µL bir 24-şey tabak içinde eklemek (= 2 cm2/de) ve kültürünün bütün yüzeyi de kolajen R çözüm ile kaplıdır.
   3. Bir kaç saatliğine açık kapaklı kuru veya laminar akış mahallede bir gecede çözüm ver.
   4. Kültür plaka tamamen kuru olduğunda, onları kirlenme en aza indirmek 10-15 dk için UV ışığıyla ışınlatayım.
   5. Gerekirse, plakayı 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.
2. Medya ve kültür iş laminar akış başlık altında için ek hazırlamak. GC başarılı bir kurtarma için onlar hemen çözdürme sonra işlenmek üzere var.
3. Aşağıdaki ortam hazırlamak.
   1. 2 mM L-glutamin, %0.084 sodyum bikarbonat, % 0,1 sığır serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Sodyum selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insülin ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ile α-Minimal gerekli ortam (α-MEM) ek.
   2. Ayrıca, 100 IU penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ortamına Ekle.
      Not: bir kez ısındı, antibiyotikler, yaklaşık 48 saat için stabildir. Bu nedenle, aliquot kültür set-up için medya ve planlanan medya istenilen miktarda Döviz. Yalnızca medya aliquots 37 ° c su banyosu içinde önceden ısıtmak. Hazırlanan medya artık 3 aydan fazla için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
   3. Steroid kültürlü sığır GC etkinliğinde ikna etmek için α-MEM Ayrıca 20 ng/mL folikül - uyarıcı hormon (FSH) ile 50 ng/mL R³ IGF-1 ve 2 µM androstenedion takviyesi.
      Not: Her zaman kısa bir süre önce bir kültür veya ortam değişimi başlangıcı bu bileşenler ek. Bu steroid etkinlik tehlikeye atabilir FSH ve IGF-1 hisse senedi çözümleri için tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.

5. hücre kültür çalışma

1. Hücreleri hızlı bir şekilde su banyosu için 3-4 dk 37 ° C'de erimek ve hücre süspansiyon 37 ° C önceden ısıtılmış α-MEM (olmadan hormon takviyesi) içine aktarın. Santrifüjü için son hacmi 10 mL önerilir.
2. 3 dakika oda sıcaklığında ve 500 x gde GC santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Önceden ısıtılmış ve desteklenmiştir α-MEM ekleyin ve hücreleri dikkatle resuspend.
3. Tohum GC, 1 x 10⁵ veya iyi başına 1 x 10⁶ hücre yoğunluğu son hacmi 500 µL. Teknik çoğaltır koşul başına en az üç kültür Wells içerir.
4. 8 d için bir kuluçka-37 ° c % 5 CO₂ hücre kültüründe kuluçkaya.
5. Ortam değişimi her geçen gün gerçekleştirmek. Sadece üçte iki kültür ortamının stresi azaltmak için ve taze medya hücrelere uyarlaması kolaylaştırmak için değiştirin.
   Not: GC kültür birkaç gün sonra tipik bir fibroblast benzeri fenotip oluşturmak ve birlikte küme eğilimindedir. Yüksek hücre yoğunluğu kültüründe daha büyük kümeler normal yoğunluk GC Kültür (Şekil 1, doğru kapı aynası sol vs ) ile karşılaştırıldığında daha sık bulunmuştur.

6. daha sonraki analiz kültürlü Granulosa hücre

1. Steroid hormon analizi gerçekleştirmek için ortam toplamak ve -20 ° C'de dondurmak Harcanan medya [Örneğin, radioimmunoassay (RIA)]¹⁴östradiol ve progesteron konsantrasyon çözümlemek için uygun yöntemleri kullanın.
2. Farklı hedef molekülleri (RNA, DNA, protein vb.)sonraki analiz için uygun bir lysing Ajan ile kültür çanak doğrudan hücrelerde tedarikçi tarafından önerildiği gibi koşullar.
   Not: lysed hücreleri-20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir çoğu yalıtım yordamları için burada, protokolü durdurmak mümkündür. Daha uzun depolama için hücreleri-80 ° C'de tutulmaları gerekir
3. Transkript bereket belirlemek, cDNA sentez ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri¹⁵tarafından belirli transkript ölçmek için. İstatistiksel değerlendirme farklı hücre kültürleri, farklı hücre hazırlıkları (biyolojik çoğaltır) kökenli en az üç çoğaltmalar içermelidir.

Sonuçlar

GC fibroblastlar için karşılaştırılabilir bir hücre uzantısı biçimi olarak tipik bir fibroblast benzeri görünüm 1 x 10⁵ hücreleri/iyi göstermek vasıl kaplama ve kümeleri (Şekil 1a ve 1 c) oluşturmak eğilimindedir. Kaplama yoğunluğu tarafından 10 kat artan 1 x 10⁶ hücreler/iyi morfolojisi değişmedi ama daha fazla hücre kümeleri (Şekil 1b ve 1 d, oklar) görülebilir. Zaten gösterildiği gibi bir önceki yayın, kollajen kaplama kültür yemekleri büyük ölçüde hücreleri¹³eki geliştirilmiş.

İlk dondurma hücre kültürü ile karşılaştırıldığında bu doğrudan taze izole örnekleri kültürlü fizyolojik özellikleri önemli ölçüde değişmedi. Bu Şekil 2 ' de (qPCR tarafından ölçülen) transkript bereket birkaç işaretleyicinin genlerin ne zaman karşılaştırmak kültürlü hücreleri dondurulmuş ya da taze izole havuzlarından türetilmiş farklı değil gösterilir.

Şekil 3 sığır GC normal vs yüksek yoğunluklu kültürlü temsilcisi (RIA tarafından ölçülen) steroid hormon analizi sonuçlarını gösterir. Progesteron üretimi daha yüksek olma eğilimi ise estradiol konsantrasyonunu normal yoğunluk kültüre göre yüksek yoğunluklu kültüründe önemli ölçüde azalır.

Genlerin (qPCR tarafından ölçülen) çeşitli kültürlerde yüksek - vs normal yoğunluk karşılaştırmalı analizi önemli etkisi (Şekil 4) saptandı. CYP19A1anahtar enzim estradiol biyosentezi aromataz yanı sıra gonadotropin reseptör FSHR, kodlama, önemli ölçüde aşağı-düzenlenmiş. Buna ek olarak, RGS2 ve VNN2 genler önemli bir up-regülasyon gösterdi. Bu sonuçlar açıkça hücresel farklılaşma belirli işlemleri yoğunluk kaplama hücre artırarak indüklenir öneririz.

Şekil 1: kültürlü sığır granulosa hücreleri normal (sol kapı aynası) ve yüksek hücre yoğunluğu (doğru kapı aynası). 1 x 10⁵ hücreleri/iyi bir yoğunluk kültürlü (a ve c) hücreler tipik bir fibroblast benzeri fenotip görüntülenir. (b ve d) GC büyük hücre kümeleri (oklar) formu eğilimi bir yüksek kaplama yoğunluğuna (1 x 10⁶ hücreler/de) daha sık hücreleri normal yoğunluk (sol panelde) altında karşılaştırıldığında kültürlü. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: yalıtım hemen sonra ve sonra dondurma kültürlü hücreleri karşılaştırılması. Hücreleri de başına 1 x 10⁵ hücre yoğunluğu, kültürlü. Birkaç işaret transkript gen ekspresyonu değerlendirildi ve kültürlü hücreleri ile veya olmadan bir ilk dondurma arasında hiçbir fark ortaya koymuştur. Kutu çizimi n sayılarının gösterir = 3. İki kuyruklu öğrenci t-testi, p-dahil değerlerdir. Bu rakam tekrar Baufeld ve Vanselow¹⁶oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Steroid hormon konsantrasyonu granulosa hücrelerinde farklı kaplama yoğunlukları kültürlü. Progesteron (P4) konsantrasyon sadece daha yüksek olma eğilimi ise estradiol (E2) toplama ne zaman GC yüksek hücre yoğunluğu kültürlü önemli ölçüde azalmıştır. Hormon konsantrasyonu farklı hücre sayıları için normalize etmek DNA içeriği için giderilmiştir. Ortalama ve SEM n = 3 gösterilir. p > 0.05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam Baufeld ve ark. çoğaltılamaz ¹⁵. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Kültürlü granulosa hücrelerinde fonksiyonel anahtar transkript bolluk bir normal vs yüksek kaplama yoğunluğu. Sığır GC 8 d için serum serbest koşullarda kültürlü belirli bir düzenleme birkaç seçili marker gen saptandı. Kutu çizimi n sayılarının görüntüler 3 bireysel çoğaltır =. p < 0,05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler^8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)¹³bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri¹⁷dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.

FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce^11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.

Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma¹⁶için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.

Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde^4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.

Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma¹³ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.

Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/mL)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 mL syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 mL)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/mL)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol