細胞のエストロゲン産生主ウシ顆粒の組織培養モデル

要約

無血清条件下でウシ顆粒膜細胞の長期培養モデルを説明します。このモデルにより、エストロゲン産生特性の異なるめっき密度として多様な因子と条件の効果を研究に研究をウシ顆粒膜細胞。

要約

卵巣顆粒膜細胞 (GC) は、エストラジ オールの合成の主要なソースです。排卵黄体形成ホルモン (LH) のサージによって誘導される細胞、莢の特に、顆粒膜細胞層の深く、形態学的、生理学的、および分子の特性を変更し、プロゲステロン生産コーパスを形成黄体は妊娠を維持するために責任があります。細胞モデルは、濾胞黄体の変換に関与する基になる機構を研究する重要なツールです。提案するプロトコルは中規模包 (< 6 mm) から牛の GC の凍結と分離のプロシージャに焦点を当てください。この手法では、GC のほぼ純粋な人口を取得できます。凍結保存プロシージャ大幅に細胞培養の管理は直接プライマリ組織 (卵巣) 供給の独立して動作時間を容易します。このプロトコルでは、ウシの GC のエストラジ オール アクティブ状態を模した無血清細胞培養モデルについて説明します。成功したステロイド アクティブ培養に欠かせない重要な条件は、プロトコルを通して説明します。変更された遺伝子の発現プロファイルとホルモン生産によって示されているように、セルのメッキ密度の増加に特定の応答を誘導することを示した。さらに、このモデルは、GC の分化に関するさらなる研究のための基礎および他のアプリケーションに提供します。

概要

成功した排卵と黄体は、細かく調整・うまく仕組まれた分子変異が別体濾胞細胞の種類によって異なります。これらの発達のプロセスの詳細はまだ完全に理解されない、さらに明確化が必要です。生体内でのアプローチは手の込んだ、高価な、特に、アドレス特定の分子機構卵胞発育中に発生する失敗します。したがって、ベイストの in vitroモデルはさらに、細胞と分子の詳細洞察力を提供するために必要です。さまざまな研究では、体外受精技術^1,2,3のコンテキスト内の全体の卵胞の文化について説明します。研究者は分化のメカニズムに興味があるので、多くの研究卵胞 GC に焦点を当てます。卵子に直接関連付けられているこれらの細胞はエストロゲン産生の主要な源であるし、したがって、卵胞発育と黄体化⁴全体で重要な役割を果たします。

GC の行は、異なる種から開発されている細胞を不死化。しかし、それらのほとんどは十分なステロイド ホルモン生産⁵を表示されません。これまでのところ、GC がされているウシの 1 つだけセルライン確立⁶が、この行はいくつかの通路⁷後ステロイド産生活性を失った。したがって、以来ステロイド生合成機能や、特定のエストラジ オール産生が GC 機能の基本的な特徴、一次電池文化モデルのこれらの面を研究することをお勧めします。以前の研究でかなりのエストラジ オール産生できますのみ無血清培養条件^8,9の下で観察されることを示した。さらに、エストラジ オールの合成の前駆体の補充は、別の前提条件 GC 失敗アンドロステンジオン¹⁰にプロゲステロンを変換することができます必要な酵素を表現します。また、FSH と IGF-1 補充の in vitroの相乗効果は、エストラジ オール合成¹¹の鍵酵素アロマターゼの最適化活動を明らかにしました。この議定書で GC 文化モデルの相当な影響がある他の重要な要因についても述べる。特に、密度をめっきセルには、実験¹²の結果に途方もない効果があります。さらに、文化の GC の生理学と大幅に干渉しない牛の GC の凍結保存技術が確立でした。細胞文化仕事の組織を改善するために、最寄りのメッキ密度を最適化するために、このテクニックが役立ちます。

プロトコル

注: ウシ卵巣は商業の屠殺場から得られました。屠畜副産物のコレクションでは、ドイツの法律によると倫理的な承認は必要ありません。

1. 労働条件と準備

1. 無菌性を保証するには、すべてのメディアを実行し、層流ベンチを使用して専門にされた細胞文化ラボですべての文化と同様に、ティッシュの準備作業します。
2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) 100 IU ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL と卵巣の輸送のための 0.5 μ g/μ L アムホテリシン補足 × 1 を準備します。
   注: 卵巣の受信と GC を分離する最大期間はこのセットアップで 2 h です。

2. ウシ顆粒膜細胞の分離

1. 血を表面から分離手順を開始する前に削除する (100 IU ペニシリン、0.1 mg/mL ストレプトマイシン 0.5 μ g/μ L アムホテリシンと) 1 × PBS で数回卵巣を洗います。ビーカーを使用、卵巣内に配置、1 × PBS でそれを埋める、PBS をもう一度破棄します。
   1. 3-4 x まで卵巣の任意の残りの血液を清掃はこの洗浄工程を繰り返します。
2. 可能な汚染を最小限に抑えるために 70% アルコールを浸したラボ ワイプを使用して 1 つの卵巣を拭いてください。
3. 3 mL 注射器、18 G 針で穿刺卵胞の中規模によって GC を吸引 (< 6 mm の定規で測定)、し、プールを 1 つ 50 mL 遠心管中の卵胞液。
   注記: 注射器を湿らせて、(100 IU ペニシリン、0.1 mg/mL ストレプトマイシン 0.5 μ g/μ L アムホテリシンと) 1 × PBS の少し時間がかかります。これは卵胞液の少量を収集するのに役立ち、シリンジ内付着細胞を防ぎます。
4. いくつかの卵胞を穿刺後注射器と中間洗浄の 1x PBS で針をすすいでください。

3. 細胞の凍結保存

1. トリパン ブルー染色を使用し、診断の下のセルをカウントします。
   1. 実行可能なセルの数をカウントするには、0.25% トリパン ブルー溶液の 1.5 μ L でチューブを準備します。
      注: 生きているセルは、トリパン ブルーは青で表示されますし、死んだ細胞の細胞壁をしかアクセスできないために無染色保持されます。
   2. トリパン ブルー溶液に顆粒膜細胞懸濁液の 15 μ L を追加し、優しく混ぜます。
   3. 診断の両院で混合物を配置します。生活の数を数える商工会議所あたり 1 つの大きな正方形のセル (例えば、無染色)。
      注: いくつかの血液の細胞を見ることができるものの、サイズが非常に小さいことに区別できます。
   4. 一般のガイドラインに従って両方の商工会議所の正方形の平均値を持つ生細胞数を計算します。生きている細胞の割合は卵巣によって異なりますが、60¹³を超えない。
2. さらに分析の参考として新鮮単離顆粒膜細胞のプールからのサンプルを取る。
   1. 分離の GC の細胞数、に応じて脇細胞数の適切な標準試料として RNA、DNA、蛋白質の準備を。
      注: RNA の隔離および遺伝子発現の後の評価は、1 x 10 の⁵セル、十分ですが、他のそれに続く分析は、異なる、一般的に高いセル番号を必要があります。
   2. 新鮮なチューブで参照セルの 1 つまたは複数の因数を置き、常温、細胞ペレットを取得する最大速度 (12,000 × g) 1 分間遠心します。上清を捨てます。
   3. すぐにショックで凍結、液体窒素で。-80 ° C のサンプルを格納します。
3. 凍結をとおり実行します。
   1. 80% 牛胎児血清 (FCS) と 20% ジメチルスルホキシド (DMSO) を使用して凍結媒体を準備します。
   2. GC をペレット優しく、するために遠心分離機の室温および 500 x gで 3 分の GC。
   3. 慎重に上澄みを除去し、細胞を再懸濁します優しくないより多くの細胞まで (例えば、1 mL) 100% の FCS で塊が表示されます。
   4. 細胞懸濁液を準備凍結媒体の 1 ボリューム (例えば、1 mL) を追加し、極低温バイアルに混合物を転送します。
      注: 低温保護メディアの最終濃度は 90% の FCS と 10 %dmso になります。
   5. 急速凍結を防ぐ特殊な (市販) 冷凍コンテナーに、セラムを配置します。サンプルの冷却速度-1 ° C/分、少なくとも 4 時間-80 ° C のフリーザーに転送凍結コンテナーを超えてはいけません。
   6. 長期保管のためには、超低温容器 (例えば、液体窒素容器) にセラム チューブを配置します。
      注: プロトコルを停止できますここでは、凍結により長期保存として。

4. メディアおよび培養皿の細胞培養のための準備

1. 0.02% コラーゲン R. コート細胞培養皿
   注: コラーゲン R 文化で GC の改良された添付ファイルのために不可欠であると知られています。
   1. 精製水の細胞培養に適した 0.02% コラーゲン R 溶液を準備します。
   2. 24 ウェル プレートで 150 μ L/ウェルを追加 (= 2 cm2/よく) 文化の全体の表面はよくコラーゲン R ソリューションでカバーはしています。
   3. 解決策は蓋が数時間開いたまま乾燥または層流フードの一晩をみましょう。
   4. 培養皿が完全に乾燥できたらは、汚染を最小限に抑えるために 10-15 分のために紫外線を照射します。
   5. 必要に応じて、最大 2 ヶ月の 4 ° C でプレートを格納します。
2. メディアと文化層流フードの下での作業のためのサプリメントを準備します。GC の正常な回復のためには、解凍後すぐに処理する必要が彼ら。
3. 次のメディアを準備します。
   1. 2 ミリメートル L グルタミン、0.084% 炭酸水素ナトリウム、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA)、20 mM HEPES、4 ng/mL のナトリウム亜セレン酸、5 μ G/ml トランスフェリン、10 ng/mL インスリンと 1 mM 非必須アミノ酸と α 最小必須培地 (α-MEM) を補足します。
   2. また、メディアに 100 IU のペニシリンと 0.1 mg/mL のストレプトマイシンを追加します。
      注: 一度暖め、抗生物質は、約 48 時間の安定しています。したがって、分注文化の組み立てのためのメディアと計画の希望の金額を交換します。37 の ° C の水浴中にメディアの因数だけは事前に暖かい。準備されたメディアは、もはや 3 ヶ月以上のための 4 ° C で保存できます。
   3. 培養ウシ GC でステロイドの活動を誘発するには、20 ng/mL 卵胞刺激ホルモン (FSH) とあわせて α MEM、50 ng/mL R³ IGF-1 および 2 μ M アンドロステンジオンを補います。
      注: は、常に文化やメディア交換の発症直前にこれらのコンポーネントを補います。ステロイドの活動を危険にさらす可能性がありますこの FSH と IGF-1 の貯蔵液の凍結融解繰り返しを避けてください。

5. 細胞培養ワーク

1. 3-4 分の 37 ° C で水バースの迅速に細胞を融解し、37 ° C に予め温めておいた α MEM (ホルモンを補う) なしに細胞懸濁液を転送します。遠心分離、10 mL の最終巻をお勧めします。
2. 500 × g室温で 3 分の GC を遠心します。上清を捨てます。予め温めておいたと補われた α MEM を追加し、セルを慎重に再懸濁します。
3. 500 μ L の最終巻で 1 x 10 の⁵または 1 × 10⁶細胞/ウェルの密度でシード GC には、1 つの条件の少なくとも 3 つの文化井戸の技術的な複製が含まれます。
4. 8 d のため 5% CO₂と 37 ° C でインキュベーターで培養を孵化させなさい。
5. メディア交換他の毎日を実行します。ストレスを軽減して細胞の新鮮なメディアへの適応を容易にするための培地の 3 分の 2 のみを交換してください。
   注: GC 文化で数日後典型的な線維芽細胞のような表現型を形成し、一緒にクラスター化する傾向があります。高密度培養大規模なクラスターが通常密度 GC 文化 (図 1、左対右パネル) と比較してよりよく見つかります。

6 培養顆粒膜細胞の後続の分析

1. ステロイド ホルモンの分析を実行するには、メディアを収集し、-20 ° C の凍結適切な方法を使用すると、使用済みメディア [例えばラジオイムノアッセイ (RIA)]¹⁴のエストラジ オールとプロゲステロンの濃度を分析します。
2. 別のターゲット分子 (RNA、DNA、蛋白質、等) の後続の分析、サプライヤーによって推薦されるよう lysing エージェントが適切な培養皿に直接細胞を溶解します。
   注: ほとんどの分離のプロシージャの不可能だここでは、プロトコルを停止する分離細胞を 1 週間の-20 ° C で保存できるよう長期保管のため、細胞保管-80 ° C
3. トラン スクリプトの豊かさを決定するには、cDNA を合成し、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) テクニック¹⁵特定の転写産物を測定します。統計的評価は異なる細胞培養、由来の異なる細胞製剤 (生物的複製) の少なくとも 3 つの複製を含める必要があります。

結果

GC 1 x 10 の⁵細胞/ウェルの表示で典型的な線維芽細胞のような外観としてメッキ彼らを形成する線維芽細胞に匹敵するセルの拡張 (図 1 a 1 c) クラスターを構築する傾向があります。によるメッキ密度を 10 倍増やす 1 x 10⁶細胞/ウェルの形態を変更していないが (図 1 bと1 d矢印) より多くの細胞塊を観察できます。既に、前の文書で示されてとして培養皿のコラーゲン コーティングは主細胞¹³の添付ファイルを改善しました。

初期凍結新鮮単離試料から直接培養に比べて培養細胞の生理的特性をかなり変えなかった。これは、冷凍や新鮮単離のプールに由来する培養細胞を比較するとき、遺伝子は認められなかったいくつかのマーカーの (qPCR 測定) トラン スクリプトの豊かさとして図 2に示すです。

図 3は、通常対高密度培養ウシ GC でステロイド ホルモンの分析 (RIA で測定) の代表の結果を示します。一方、プロゲステロンの生産は高い傾向が標準密度培養と比較して高密度培養でエストラジ オールの濃度が大幅に低下します。

高速対標準密度の文化 (qPCR によって測定される) 複数の遺伝子の比較解析では、大きな影響を与える (図 4) を明らかにしました。CYP19A1は、 FSHR、性腺刺激ホルモン受容体と同様に、エストラジ オール生合成アロマターゼの重要酵素がダウン規制大幅。対照的に、 RGS2とVNN2遺伝子は重要なアップレギュレーションを示した。これらの結果は明らかに細胞分化の特定のプロセスが密度をめっきセルを増やすことによって誘導されることをお勧めします。

図 1: 通常 (左のパネル)、高細胞密度 (右側のパネル) で牛の顆粒膜細胞を培養します。1 x 10 の⁵細胞/ウェルの密度で培養(とc)のセルには、線維芽細胞のような典型的な表現型が表示されます。(b 、 d)GC は、通常の密度 (左側のパネル) の下のセルと比較すると多く大細胞クラスター (矢印) を形成する傾向が高いめっき密度 (1 x 10⁶細胞/ウェル) で培養します。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 直接分離と凍結保存後の培養細胞の比較。セルは、ウェルあたり 1 x 10 の⁵セルの密度で培養しました。いくつかのマーカーの転写産物の発現を評価した培養細胞初期凍結の有無の違いは認められなかった.箱型図に示しますnの中央値 = 3。2-スチューデントの両側t-テスト、 p-値に含まれます。この図は¹⁶Baufeld と vanselow-投稿日時再現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 異なるめっき密度で培養顆粒膜細胞のステロイド ホルモン濃度。エストラジ オール (E2) 濃度は有意に低下した GC が高い細胞密度で培養したときプロゲステロン (P4) 濃度のみ高くなる傾向にあったに対し。ホルモン濃度は異なるセルの番号を正規化する DNA の内容に修正しました。平均値とnの SEM = 3 が表示されます。p > 0.05, 2 スチューデントの両側t-テストします。この図は Baufeldらから再現します。¹⁵.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: する通常対で培養顆粒膜細胞の機能キー転写物の豊富なめっき密度。8 d のための無血清条件下で培養したウシの GC では、いくつかの選択したマーカー遺伝子の特定の規制を明らかにしました。Nの中央値を表示、箱型図 3 各レプリケートします。p < 0.05, 2 スチューデントの両側t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

提示された細胞培養モデルは、顆粒膜細胞分化体外を分析するためのツールを提供します。いくつかの研究は、無血清培養ある培養ウシ GC または他種^8,9GC でステロイドの活動を維持するための前提条件であることを示した。さらに、細胞外基質 (例えばコラーゲン R)¹³のコンポーネントと培養皿をコーティング、細胞の付着が大幅に改善。もう一つの重要な特徴は、長期培養期間です。最近では、長期培養は充分なステロイド ホルモン産生活性と顆粒膜細胞アイデンティティ マーカー¹⁷のバランス式を取得する必要があるれています。それは GC が分離のプロシージャの間に物理的なストレスから回復する時間を必要と表示されます。

FSH、IGF-1、アンドロステンジオンはアロマターゼ活性を誘導するために知られているメディアのサプリメントは、GC を培養しました。特に、アンドロステンジオンと補給が絶対に必要、GC として必要があります前駆体エストラジ オール合成。これはずっと以前^11,18を公開し、したがって、さらに検討されなかった本研究中。ただし、FSH、IGF-1、アンドロステンジオン濃度の適応その他の実験のセットアップの必要があります。

ここで説明した凍結技術は複数の卵巣が付いているさまざまな供給から独立したことで組織培養実験の組織を改善するために助けることができます。以前テストによると凍結は GC 表現型またはステロイド生産文化を影響しません。また、培養細胞のマーカーの転写物の豊かさは、以前凍結¹⁶を受けると新鮮単離細胞から調製したサンプルを比較差を明らかにしなかった。

現在の GC 文化モデルの重要なパラメーターは、密度をめっきセルです。代表結果で示すように、生理学的・分子的特性の顕著な変化を誘発メッキ密度を増加させます。いくつかの遺伝子は、^4,19 vivo にLH の刺激によって誘導される変化と類似した特定の方法で調整されます。セル密度の上昇が培養ウシ GC で差別化のようなプロセスを運転できるという事実は複製間の矛盾した結果を避けるために細心の注意この GCの in vitroモデルで考慮します。したがって、他の研究と矛盾する結果は異なるセル密度に起因するかもしれないより綿密に検証する必要があります。

文化モデル記述されているここで LH に対応することを明らかにした受容体LHCGRの成績としては検出限界の近くにあります。したがって、同様の LH サージのシミュレーション体内状況は¹³分化を誘導するために失敗しました。それにもかかわらず、このモデルは、初代培養におけるエストラジ オール アクティブ GC の研究に有用なツールを提供します、特にとして機能的なウシ GC ラインが現時点では存在します。

ステロイド生産または GC の分化の調節機構を解明するのに役立ちます現在の GC 文化モデルでは、異なる治療プロトコルをテストできます。発達過程に関与しているさらに、単一の要因は個別に分析できます。したがって、この文化モデルは、多くの異なるアプリケーションのための基礎を提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 ml syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 ml)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/ml)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol