기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

요약

혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.

초록

난소 granulosa 셀 (GC)는 estradiol 합성의 주요 소스입니다. Preovulatory 황 호르몬 (LH) 서 지에 의해 유도 된 세포는 티크의 및, 특히, granulosa 셀 계층의 뿌리깊은 그들의 형태, 생리, 및 분자 특성 변경 및 황 체 호르몬 생성 신체를 형성 임신을 유지 하기 위한 책임이 있다는 luteum 셀 문화 모델 folliculo-luteal 변환에 관련 된 기본 규제 메커니즘 연구 필수 도구입니다. 제시 프로토콜 격리 절차 및 중간 소형 낭 (< 6 m m)에서 소 GC의 cryopreservation에 집중 한다. 이 기술로, GC의 거의 순수한 인구를 얻을 수 있습니다. Cryopreservation 절차는 크게 시간 세포 배양의 관리는 직접 기본 조직 (난소) 공급의 독립적인 작동을 지원 합니다. 이 프로토콜에서는 소 GC의 estradiol 액티브 상태를 모방 하는 혈 청 무료 셀 문화 모델을 설명 합니다. 성공적인 스테로이드 활성 세포 배양에 필수적인 중요 한 조건은 프로토콜에 걸쳐 설명 되어 있습니다. 그것은 그 세포의 도금 밀도 증가 유도 특정 응답 변경된 진 식 프로필과 호르몬 생산에 의해 표시 된 대로 설명 했다. 또한,이 모델은 GC 차별화에 대 한 추가 연구를 위한 기초 및 다른 응용 프로그램을 제공합니다.

서문

성공적인 배 란과 luteinization 정밀 하 게 조정 하 고 잘 조율 된 분자 변경 다른 체세포 follicular 셀 형식에 따라 달라 집니다. 이러한 개발 프로세스의 세부 정보는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 때문에, 더 정화가 필요 합니다. Vivo에서 접근 정교 하 고 비용이 많이 드는 이며, 특히 folliculogenesis 동안 발생 하는 주소 특정 분자 메커니즘을 실패 합니다. 따라서, reductionistic 생체 외에서 모델 필요 또한, 세포질이 고 분자 세부 사항에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 다른 연구는 체 외 수정 기술^1,2, 에서 ³의 맥락에서 전체 낭의 문화를 설명합니다. 연구원은 차별화의 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 많은 연구 follicular GC에 초점. 직접 oocyte와 관련 된 이러한 셀 스 트로 겐 생산의 주요 소스 이며, 따라서, folliculogenesis 및 luteinization⁴에 걸쳐 필수적인 역할.

셀 라인 GC의 다른 종에서 개발 되었습니다 불후 그러나 그들의 대부분은, 충분 한 스테로이드 호르몬 생산⁵표시 되지 않습니다. 지금까지, 하나의 셀 라인 GC 되었습니다 소의 설립⁶, 그러나이 선 여러 구절⁷후 steroidogenic 활동을 잃었다. 따라서,부터 steroidogenesis 그리고, 특히에서, estradiol 생산 GC 기능의 필수적인 기능입니다, 그리고 그것은 이러한 측면에서 1 차 셀 문화 모델을 공부 하는 것이 좋습니다. 이전 학문에서는, 그것은 상당한 estradiol 생산 세럼 무료 문화 조건^8,9아래만 관찰 될 수 있는 시연 했다. 더욱, estradiol 종합의 선구자의 보충은 또 다른 필수 구성 요소, GC androstenedione¹⁰프로 변환할 수 있습니다 필요한 효소를 표현 하지 못하는. 또한, FSH 및 IGF-1 보충에서 체 외에서 의 시너지 효과 estradiol 합성¹¹의 주요 효소 aromatase의 최적화 된 활동을 밝혔다. 현재 프로토콜에서 GC 문화 모델에 상당한 영향을 미칠 다른 중요 한 요인은 또한 설명 합니다. 특히, 셀 밀도 도금 실험¹²의 결과에 엄청난 영향을 있다. 또한, GC 생리학 문화에 크게 방해 하지 않는 소 GC의 cryopreservation 기술 수립 될 수 있습니다. 이 기술은 세포 문화 작품의 조직 개선 하 고 선호 도금 밀도 최적화 하기 위해 도움이 됩니다.

프로토콜

참고: 소 난소 상업 도살에서 얻은 했다. 도살 장 부산물의 컬렉션은 독일 법 윤리적인 승인이 필요 하지 않습니다.

1. 근무 조건 및 준비

1. 무 균을 보장 하기 위해 모든 미디어를 수행 하 고 조직 준비 뿐만 아니라 모든 문화 층 류 벤치를 사용 하 여 특수 세포 문화 연구소에서 일 합니다.
2. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4) 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스와 난소의 수송을 위한 0.5 µ g / µ L 암포 보충 x 1을 준비 합니다.
   참고: 난소를 수신 하 고 GC 분리 사이 최대 기간은이 설정에서 2 h입니다.

2입니다. 격리 소 Granulosa 셀의

1. 격리 절차를 시작 하기 전에 모든 혈액은 표면에서 제거 하 난소 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS에 여러 번 씻는 다. 비 커를 사용 하 여, 내부 난소, 1 x PBS, 그것을 채워 놓고 다시 PBS를 삭제 합니다.
   1. 난소는 모든 나머지 혈액에서 청소 될 때까지 3-4 x,이 세 단계를 반복 합니다.
2. 가능한 오염 최소화를 70% 알코올로 흠뻑 실험실 지우기를 사용 하 여 하나의 난소를 닦아냅니다.
3. 3 mL 주사기와 18 G 바늘 중간 소형 낭 puncturing 의해 GC 발음 (< 통치자로 측정 6 m m), 고 한 50 mL 원심 분리기 튜브에 소 낭 모양 액체 풀.
   참고: 주사기, 축 축 하 게 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS의 작은 금액을 소요. 이 적은 양의 소 낭 모양 액체를 수집 하는 데 도움이 하 고 셀 주사기 안에 집착 하지 않도록 합니다.
4. 여러 낭 puncturing 후 주사기와 바늘 1 x PBS와 함께 중간 청소 린스.

3입니다. 셀의 cryopreservation

1. Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 고는 hemocytometer 아래 셀.
   1. 실행 가능한 세포의 수를 계산 하는 0.25 %trypan 블루 솔루션의 1.5 µ L 튜브 준비.
      참고: 살아있는 세포 유지 됩니다 흠 없는 trypan 블루 파란색 표시는 죽은 세포의 셀 벽에만 액세스할 수 있기 때문에.
   2. Trypan 블루 솔루션 granulosa 셀 서 스 펜 션의 15 µ L을 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.
   3. hemocytometer의 두 약 실 전부에 있는 혼합물을 놓습니다. 생활의 수를 계산 (예:, 흠 없는) 셀 챔버 당 하나의 큰 광장에.
      참고: 일부 혈액 세포를 볼 수 있습니다, 하지만 그들은 구분할 수 있습니다 그들의 매우 작은 크기.
   4. 일반 지침;에 따라 두 챔버의 의미와 살아있는 세포의 수를 계산 살아있는 세포의 비율 난소 사이 다를 수 있습니다 있지만 60¹³를 초과 한다.
2. 추가 분석에 대 한 참조로 갓 격리 granulosa 셀 풀에서 샘플을 가져가 라.
   1. 격리 된 GC의 세포 수에 따라 정해 적절 한 수의 셀 참조 샘플으로 RNA, DNA, 또는 단백질 준비.
      참고: RNA 분리 및 유전자 발현의 후속 평가, 1 x 10⁵ 세포는 충분 한, 반면 다른 후속 분석 다른, 일반적으로 더 높은 셀 숫자를 해야 할 수도 있습니다.
   2. 신선한 튜브에 참조 셀의 하나 또는 여러 개의 aliquots를 배치 하 고 실내 온도 셀 펠 렛을 얻기 위해 최대 속도 (12000 x g)에서 1 분 동안 원심. 폐기는 상쾌한.
   3. 즉시 충격-동결 샘플 액체 질소. -80 ° c.에 샘플 저장
3. Cryopreservation는 다음과 같이 수행 합니다.
   1. 80% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 냉동 매체를 준비 합니다.
   2. 부드럽게 작은 GC를 위해서는 실내 온도와 500 x g3 분 동안 GC 원심.
   3. 상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 부드럽게 셀 resuspend 덩어리 아니 더 많은 셀까지 100 %FCS (예를 들어, 1 mL)에서 볼 수 있습니다.
   4. 셀 서 스 펜 션에 준비 된 냉동 매체의 1 볼륨 (예:, 1 mL)을 추가 하 고 극저온 유리병에 혼합물을 전송.
      참고: 곳을 알아내는 보호 미디어의 최종 농도 90 %FCS 10 %DMSO 있을 것입니다.
   5. 극저온 유리병 급속 동결을 방지 하는 전문된 (상용) 냉동 컨테이너에 배치 합니다. 샘플의 냉각 속도-1 ° C/분 이상 4 h-80 ° C 냉동 고로 전송 냉동 컨테이너를 넘지 말아야 한다.
   6. 긴 저장을 위해 (예를 들면, 액체 단계 질소 용기) 초 저온 용기에 극저온 튜브를 놓습니다.
      참고: 프로토콜 수 있습니다 중지 여기는 cryopreservation 긴 저장 허용.

4. 세포 배양에 대 한 미디어와 문화 접시의 준비

1. 0.02% 콜라겐 R. 코트 세포 배양 배지
   참고: 콜라겐 R 문화에서 GC의 향상 된 첨부 파일에 대 한 필수적인 것으로 알려져 있다.
   1. 순화 된 물 세포 배양에 적합 한 0.02% 콜라겐 R 솔루션을 준비 합니다.
   2. 24-잘 접시에 잘 당 150 µ L를 추가 (= 2 cm2/잘) 그 문화권의 전체 표면 잘 덮여 콜라겐 R 솔루션을 확인 하십시오.
   3. 뚜껑을 열고 몇 시간 동안 건조 또는 층 류 두건에 하룻밤 솔루션을 보자.
   4. 배양 배지는 완전히 건조, 오염을 최소화 하기 위해 10-15 분 동안 UV 빛 들을 비추는.
   5. 필요한 경우 최대 2 개월까지 4 ° C에서 접시를 저장.
2. 미디어와 문화 일 층 흐름 후드에 대 한 보충을 준비 합니다. GC의 성공적인 복구, 그들은 녹고 후 즉시 처리 해야 합니다.
3. 다음 미디어를 준비 합니다.
   1. Α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 2 mM L-글루타민, 0.084% 나트륨 중 탄산염, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL 나트륨 selenite, 5 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 인슐린 1 m m 비 본질적인 아미노산을 보충 한다.
   2. 또한, 미디어 100 IU 페니실린과 0.1 mg/mL 스를 추가 합니다.
      참고: 일단 예 열, 항생제 약 48 h에 대 한 안정적입니다. 따라서, aliquot 문화권 설정에 대 한 미디어 및 계획 된 미디어의 원하는 금액 교환 합니다. 미리 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 미디어 aliquots만. 4 ° C에서 3 개월 이상 준비 된 미디어를 저장할 수 없습니다.
   3. 교양된 소 GC에서 스테로이드 활동을 유도 하는 α-MEM 20 ng/mL 뿌리-자극 호르몬 (FSH)과 또한, 50 ng/mL R³ IGF-1, 그리고 2 µ M androstenedione 보충.
      참고: 항상 이러한 구성 요소는 문화 또는 미디어 교환의 발병 직전 보충. 이 스테로이드 활동을 손상 시킬 수도 있는 FSH 및 IGF-1 재고 솔루션에 대 한 반복된 및 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.

5. 세포 문화 작업

1. 3-4 분 동안 37 ° C에 물 목욕에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 37 ° C (호르몬 보충) 없이 미리 따뜻하게 α-MEM에 세포 현 탁 액을 전송. 원심 분리, 10 mL의 최종 볼륨을 사용 하는 것이 좋습니다.
2. 500 x g와 실내 온도에 3 분 동안 GC 원심 폐기는 상쾌한. 미리 예 열 하 고 보충 α-MEM을 추가 하 고 셀을 신중 하 게 resuspend.
3. 500 µ L. 마지막 볼륨에서 1 x 10⁵ 또는 잘 당 1 x 10⁶ 세포의 조밀도에 씨 GC 조건 당 적어도 3 개의 문화 우물의 기술 복제를 포함합니다.
4. 8 d 5% CO₂ 와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 품 어.
5. 미디어 교환 매일 수행 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 고 신선한 미디어 셀의 적응을 쉽게 하기 위해 문화 미디어의 2/3만을 교체 합니다.
   참고: GC 문화에 몇 일 후에 전형적인 구와 같은 표현 형을 형성 하 고 함께 클러스터 해 경향이 있다. 높은 세포 조밀도 문화에 더 큰 클러스터는 일반 밀도 GC 문화 (그림 1, 왼쪽 대 오른쪽 패널)에 비해 더 자주 발견 된다.

6. 이후 분석 교양된 Granulosa 셀의

1. 스테로이드 호르몬 분석을 수행 하려면 미디어를 수집 하 고-20 ° c.에 그것을 동결합니다 적절 한 메서드를 사용 하 여 보낸된 미디어 [예: 방사 면역 검정 법 (RIA)]¹⁴에 estradiol과 progesterone 농도 분석.
2. 다른 대상 분자 (RNA, DNA, 단백질, 등)의 후속 분석을 위해 공급 업체에서 권장 하는 대로 적절 한 lysing 에이전트와 문화 접시에 직접 세포를 lyse.
   참고: 대부분의 격리 절차에 대 한 이건 여기, 프로토콜을 막을 수로 lysed 세포-20 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 긴 저장을 위해 셀-80 ° c.에 유지 되어야 한다
3. 사본을 풍부를 확인 하려면 cDNA를 합성 하 고 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기법¹⁵특정 성적을 측정 한다. 통계 평가 다른 세포 준비 (생물 복제)에서 유래 하는 다른 세포 배양의 적어도 3 개의 복제를 포함 해야 합니다.

결과

GC 도금 1 x 10⁵ 셀/잘 표시 전형적인 구와 같은 모습으로 그들은 섬유 아 세포에 비해 세포 확장을 형성 (그림 1a 및 1c) 클러스터를 구축 하는 경향이 있다. 의해 도금 밀도 10 배 증가 1 x 10⁶ 셀/잘 형태를 변경 하지 않은 하지만 더 많은 셀 클러스터 (그림 1b 및 1 d, 화살표) 관찰 될 수 있다. 같이 이미 이전 게시, 문화 요리 콜라겐 코팅은 크게 셀¹³의 첨부 파일 개선.

초기 cryopreservation 갓 격리 된 샘플에서 직접 경작 하는 그에 비해 문화에 세포의 생리 적 특성을 상당히 변화 하지는 않았다. 이 때 냉동 또는 신선한 고립 된 수영장에서 파생 된 배양된 세포를 비교 유전자 차이가 없 여러 마커의 사본 풍부 (정량 측정)로 그림 2 에 표시 됩니다.

그림 3 정상 대 높은 밀도에서 교양 소 GC에서 스테로이드 호르몬 분석 (RIA로 측정)의 대표적인 결과 보여준다. Estradiol 농도 호르몬 생산 경향이 높은 반면 정상 밀도 문화에 비해 고밀도 문화에 크게 감소 됩니다.

높은- 대 정상 밀도 문화에서 (정량에 의해 측정 되는) 몇몇 유전자의 비교 분석 (그림 4) 상당한 효과를 밝혔다. CYP19A1, estradiol 생 합성 aromatase FSHR, 생식 샘 자극 호르몬 수용 체의 주요 효소를 인코딩 했다 크게 다운-규제. 대조적으로, RGS2 및 VNN2 유전자는 상당한 업 레 귤 레이 션 보였다. 이러한 결과 명확 하 게 밀도 도금 하는 세포를 증가 시켜 세포 분화의 특정 프로세스 유도 된다 건의 한다.

그림 1: 정상 (왼쪽된 패널)과 높은 세포 밀도 (오른쪽 패널)에서 소 granulosa 셀 교양. 1 x 10⁵ 셀/잘의 밀도에서 경작 하는(및 c) 셀 표시 전형적인 구와 같은 표현 형. (b 와 d) 정상적인 밀도 (왼쪽된 패널)에서 세포에 비해 더 자주 큰 셀 클러스터 (화살표)를 형성 하는 경향이 높은 도금 밀도 (1 x 10⁶ 셀/잘)에서 경작 하는 GC 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: cryopreservation 그리고 격리 후 직접 경작 하는 세포의 비교. 셀 잘 당 1 x 10⁵ 세포의 밀도에 교양 있었다. 몇 가지 마커 성적 유전자 발현 평가 되었다 고 배양된 세포 또는 초기 cryopreservation 없이 차이 밝혀. boxplot 보여줍니다 n 의 중앙값 = 3. 양측 스튜던트 t-테스트, p-값이 포함 되어 있습니다. 이 그림은 Baufeld 및 Vanselow¹⁶에서 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 스테로이드 호르몬 농도 granulosa 셀 다른 도금 밀도에서 경작에. Estradiol (e 2) 농도 감소 크게 GC 높은 세포 조밀도에 교양 있었다 때 황 체 호르몬 (P4) 농도 경향이 높은 반면. 호르몬 농도 DNA 콘텐츠를 다른 핸드폰 번호에 대 한 표준화에 대 한 수정 되었습니다. 평균 및 SEM을 n = 3이 표시 됩니다. p > 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림은 Baufeld 그 외 여러분 에서 재현 ¹⁵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: granulosa 셀에 기능 키 성적표의 풍부한 경작는 정상적인 대 에서 높은 도금 밀도. 8 d에 대 한 혈 청 자유로운 조건에서 배양 소 GC 몇몇 선택 된 마커 유전자의 특정 규정을 밝혔다. boxplot 표시 n 의 중앙값 = 3 개별 복제. p < 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

제시 셀 문화 모델 granulosa 셀 차별화 시험관을 분석 하는 도구를 제공 합니다. 여러 연구 결과 혈 청 무료 재배 경작된 소 GC 또는 다른 종^8,9의 GC에서 스테로이드 활동을 유지 하기 위해 필수 보여주었다. 또한 기질 (예를 들어, 콜라겐 R)¹³의 구성 요소와 문화 접시 코팅, 크게 향상의 셀 첨부 파일. 또 다른 중요 한 기능은 장기 문화 기간입니다. 최근에, 그것은 장기 문화는 충분 한 steroidogenic 활동과 granulosa 셀 정체성 마커¹⁷의 균형된 식을 얻기 위해 필요한 증명 되었습니다. 그것은 GC 물리적 스트레스 로부터 격리 절차 동안 복구 시간을 필요로 나타납니다.

FSH, IGF-1, androstenedione 알려져 있습니다에서 aromatase 활동을 유도 하기 위해 미디어 보충 교양 GC. 특히, androstenedione와 보완은 절대적으로 필요한, GC로 필요 전조 estradiol 합성 합니다. 이것은 계속 이전^11,18 에 게시 하 고, 따라서 하지 추가 조사는 현재 연구 중. 그러나, FSH, IGF-1, 그리고 androstenedione 농도의 적응은 다른 실험 설정에 대 한 필요할 수 있습니다.

여기에 설명 된 cryopreservation 기술을 더 난소와 다양 한 공급에서 독립 함으로써 조직 배양 실험 기구를 개선 하기 위해 도울 수 있다. 이전 테스트에 따르면 cryopreservation GC 형 또는 스테로이드 생산 문화에 미치지 않는다. 또한, 경작된 한 세포에 표식 증명서의 풍부는 이전 cryopreservation¹⁶에 들어서는 그 갓 고립 된 세포에서 준비 하는 샘플을 비교 하는 중요 한 차이점이 공개 하지 않았다.

현재 GC 문화 모델에 대 한 중요 한 매개 변수는 밀도 도금 하는 셀입니다. 대표 결과같이 생리 및 분자 특성의 놀라운 변화를 유도 도금 밀도 증가. 몇몇 유전자는 LH 자극 vivo에서^4,19에 의해 유도 되는 변화를 닮은 특정 방식으로 통제 된다. 한 증가 셀 밀도 교양된 소 GC 차별화와 같은 프로세스를 구동할 수 있다 사실 꼼꼼하게 복제 사이 충돌 하는 결과 피하기 위해이 GC 모델 체 외에 간주 있다. 따라서, 다른 연구 결과와 모순 된 결과 다른 셀 밀도를 관찰 수 있습니다 그리고 더 면밀 하 게 조사 해야 합니다.

설명 된 문화 모델 LH에 응답 하지 않는 것을 여기 공개 LHCGR 수용 체의 성적으로는 검출 한계. 따라서, 모두 LH 서 지의 시뮬레이션 vivo에서 상황 차별화¹³유도를 하지 못했습니다. 그럼에도 불구 하 고, estradiol-액티브 GC 주 문화에서를 공부 하는 유용한 도구를 제공 하는이 모델, 현재 존재 하는 특히 더로 기능 소 GC 라인.

스테로이드 생산 또는 GC 차별화의 규제 메커니즘을 해명 하는 데 도움이 현재 GC 문화 모델에서 다른 치료 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 개발 프로세스에 관련 된 추가, 단일 요소를 개별적으로 분석할 수 있습니다. 따라서,이 문화 모델은 많은 다른 응용 프로그램에 대 한 기반을 제공합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 ml syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 ml)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/ml)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol