Культура ткани модель эстроген производителей первичного говядину гранулезы ячейки

Резюме

Описывается модель долгосрочного культуры клеток гранулезы говядину сыворотки свободных условиях. Эта модель позволяет исследователям для изучения влияния различных факторов и условий как плотности различных покрытий на характеристики эстроген производителей клетки гранулезы говядину.

Аннотация

Клетки гранулезы яичников (GC) являются основным источником эстрадиола синтеза. Индуцированные перенапряжения preovulatory лютеинизирующего гормона (ЛГ), клеток теки и, в частности, слоя клеток гранулезы глубоко изменить их морфологические, физиологические и молекулярные характеристики и сформировать корпус прогестерон производство желтое тело, которое отвечает за ведение беременности. Модели культуры клеток являются важнейшими инструментами для изучения основных регулирующих механизмов, участвующих в folliculo лютеиновой трансформации. Представленные протокол фокусируется на процедуры изоляции и криоконсервацию говядину GC от малых до средних размеров фолликулов (< 6 мм). С помощью этого метода можно получить почти чисто населения GC. Процедура криоконсервация значительно облегчает время управления культуры клеток работать независимо от подачи ткани (яичники) прямой первичной. Этот протокол описывает модель культуры сыворотки свободных клеток, которая имитирует эстрадиол активный статус крупного рогатого скота GC. Важные условия, которые необходимы для успешного стероид активной клеточной культуры, обсуждаются на протяжении всего протокола. Доказано, что увеличение плотности покрытия клеток вызывает конкретный ответ как указано измененный ген выражение профиль и гормон производства. Кроме того эта модель обеспечивает основу для дальнейших исследований на GC дифференциации и других приложений.

Введение

Успешный овуляции и luteinization зависят от тонко настроены и хорошо спланированных молекулярные изменения в типах различных соматических фолликулярных клеток. Поскольку детали этих процессов развития пока еще полностью не поняты, дальнейших разъяснений не требуется. В естественных условиях подходы являются сложной и дорогостоящей и, в частности, не адрес конкретные молекулярные механизмы, которые происходят во время фолликулогенез. Таким образом упрощенное в vitro модели Кроме того, необходимо обеспечить проницательность в клеточном и молекулярном детали. Различные исследования описывают культуру всего фолликулов в контексте в пробирке оплодотворение методы^1,2,3. Потому что ученые заинтересованы в механизмы дифференцировки, многие исследования сосредоточены на фолликулярную GC. Эти клетки, непосредственно связанные с ооцитов, являются основными источниками эстрогена производства и, таким образом, играть важную роль на протяжении фолликулогенез и luteinization⁴.

Увековечен клеток линии GC были разработаны из разных видов. Большинство из них, однако, не показывают достаточно стероидных гормонов производства⁵. Пока только одну ячейку строки говядину, GC был создан⁶, но эта линия потерял свою стероидогенных деятельность после нескольких проходов⁷. Таким образом начиная с стероидогенеза и, в частности, производство Эстрадиол является важнейшей особенностью GC функциональность, целесообразно изучить эти аспекты в модели культуры главной ячейки. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что производство значительные эстрадиола может наблюдаться только под сыворотки свободной культуры условий^8,9. Далее, предшественником синтеза Эстрадиол является еще одной предпосылкой, как GC не выразить необходимого фермента, который может конвертировать прогестерона в андростендион¹⁰. Кроме того синергетический эффект ФСГ и IGF-1 добавок в vitro показали оптимизированный активность ароматазы, ключевого фермента эстрадиола синтез¹¹. В настоящем Протоколе также описываются другие важные факторы, оказывающие существенное влияние на модели культуры GC. В частности клетка, покрытие плотность имеет огромное воздействие на результаты эксперимента¹². Кроме того может быть создана методика криоконсервирования говядину GC, который не вмешиваться GC физиологии в культуре значительно. Эта техника помогает улучшить организацию работы культуры клеток и оптимизации плотности предпочтительным покрытие.

протокол

Примечание: Говядину яичники были получены из коммерческих бойни. Коллекция скотобойни побочные продукты не требуют этического одобрения согласно немецкому закону.

1. условия труда и подготовки

1. Для обеспечения стерильности, выполняют все средства массовой информации и подготовка тканей, а также все культуры работы в специализированных клеток культуры лаборатории с использованием скамейке ламинарного потока.
2. Подготовка 1 x фосфатный буфер (PBS, рН 7,4) дополняется 100 МЕ пенициллин, стрептомицин 0,1 мг/мл и 0,5 мкг/мкл амфотерицин для перевозки яичников.
   Примечание: Максимальная продолжительность между получением яичников и изолировать GC-2 h в этой настройке.

2. изоляция клетки гранулезы говяжьи

1. Вымойте яичников в однократном ПБС (с 100 МЕ пенициллин, стрептомицин 0,1 мг/мл и 0,5 мкг/мкл амфотерицин) несколько раз для удаления любых крови от поверхности до начала процедуры изоляции. Используйте стакан, место яичников внутри, заполнить его с ПБС и отбросить PBS снова.
   1. Повторите этот шаг Стиральная x 3 – 4, пока не яичников очищаются от любых оставшихся крови.
2. Протрите один яичник, используя уничтожить лаборатории, пропитанной 70% спирта, для сведения к минимуму возможных загрязнений.
3. С 3 мл шприц и игла 18 G, аспирационная GC, проколов малого среднего размера фолликулов (< 6 мм, измерить линейкой) и бассейн фолликулярной жидкости в одной центрифуги Тюбик 50 мл.
   Примечание: Смочить шприц, взять небольшое количество ПБС (с 100 МЕ пенициллин, стрептомицин 0,1 мг/мл и 0,5 мкг/мкл амфотерицин). Это помогает собрать небольшое количество фолликулярной жидкости и предотвращает прилипание внутри шприца клетки.
4. После прокола нескольких фолликулов, промойте шприц и игла с ПБС для промежуточной очистки.

3. криоконсервирования клеток

1. Использование Трипановый синий окрашивание и подсчитать количество ячеек под Горяева.
   1. Чтобы подсчитать количество жизнеспособных клеток, подготовьте трубка с 1,5 мкл раствора 0,25% Трипановый синий.
      Примечание: Живые клетки останется безупречная, потому что Трипановый синий можно получить доступ только к барьер клеток мертвых клеток, которые затем появляются синие.
   2. 15 мкл суспензии клеток гранулезы к решению Трипановый синий и осторожно перемешать.
   3. Поместите смесь в обеих палатах Горяева. Подсчитать количество жизни (например, безупречная) клетки в один большой площади на камеру.
      Примечание: Хотя можно увидеть некоторые клетки крови, могут быть распознаны по их очень маленький размер.
   4. Рассчитать количество живых клеток с среднего обоих квадратов камеры согласно общим руководящим принципам; доля живых клеток яичников, могут различаться, но должна превышать 60%¹³.
2. Взять образец из пула клеток гранулезы свежевыделенных как отправной точкой для дальнейшего анализа.
   1. В зависимости от клеток количество изолированной GC отложите соответствующее количество клеток как образцов для РНК, ДНК или белка подготовка.
      Примечание: Для изоляции РНК и последующей оценки экспрессии генов, 1 x 10⁵ клетки являются достаточно, тогда как другие последующие анализы могут потребовать номера разные, как правило, выше ячейки.
   2. Место в трубу свежие аликвоты один или несколько ссылочных ячеек и центрифуги за 1 мин при комнатной температуре и максимальная скорость (12000 x g) для получения гранул ячейки. Выбросите супернатант.
   3. Сразу же шок замораживание образцов в жидком азоте. Магазин образец-80 ° c.
3. Выполняйте криоконсервации.
   1. Подготовьте замораживание среднего с использованием 80% плода телячьей сыворотки (FCS) и 20% диметилсульфоксида (ДМСО).
   2. Для того чтобы нежно pellet GC, центрифуга GC для 3 мин при комнатной температуре и 500 x g.
   3. Тщательно удалить супернатант и нежно ресуспензируйте клетки в 100% FCS (например, 1 мл) до не более клеток сгустки являются видимыми.
   4. Добавьте 1 тома (например, 1 мл) подготовленный замораживания среды суспензию клеток и передача смеси криогенных флакона.
      Примечание: Конечная концентрация крио защита средств массовой информации будет 90% FCS и 10% ДМСО.
   5. Место криогенных флакона в специализированных (коммерчески доступных) замораживание контейнер, который предотвращает быстрое замораживание. Скорость охлаждения образцов не должно превышать передачи контейнере замораживания в морозильной камере-80 ° C для по крайней мере 4 h-1 ° C/мин.
   6. Для более длительного хранения место криогенных флаконов в контейнерах ультра-низкой температуры (например, контейнеры азота жидкой фазы).
      Примечание: Протокол может быть остановлено здесь, как криоконсервация позволяет более длительного хранения.

4. подготовка средств массовой информации и культуры пластин для культуры клетки

1. Слой клеток культуры пластин с 0,02% коллагена р.
   Примечание: Коллаген R известно быть существенно важное значение для улучшения насадку GC в культуре.
   1. Приготовляют раствор 0,02% коллагена R с очищенной водой для клеточной культуры.
   2. 150 мкл в колодец в пластине 24-ну (= 2 см2/а) и убедитесь, что вся поверхность культуры хорошо покрыта раствором коллагена R.
   3. Пусть решение сухой с крышкой, открытой на несколько часов или на ночь в Ламинарный шкаф.
   4. Когда культура пластин полностью сухой, облучить их с УФ-излучения для 10 – 15 минут, чтобы свести к минимуму загрязнение.
   5. При необходимости Храните пластины на 4 ° C на срок до 2 месяцев.
2. Подготовка средств массовой информации и добавки для культуры работы под капотом ламинарного потока. Для успешного восстановления GC они должны быть обработаны сразу после оттаивания.
3. Подготовьте следующие средства массовой информации.
   1. Дополнить α-минимальным необходимым среднего (α-MEM) с 2 мм L-глютамином, 0,084% бикарбоната натрия, 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 20 мм HEPES, селенит натрия 4 нг/мл, 5 мкг/мл трансферрин, 10 нг/мл инсулина и 1 мм несущественные аминокислот.
   2. Кроме того добавьте 100 МЕ пенициллин и 0,1 мг/мл стрептомицина средств массовой информации.
      Примечание: Антибиотики, однажды утепленные, являются стабильными для около 48 часов. Таким образом аликвота необходимое количество средств массовой информации для настройки культуры и планируемых обмен. Предварительно теплой только СМИ аликвоты до 37 ° C на водяной бане. Подготовленных средствами массовой информации можно хранить при 4 ° C не более 3 месяцев.
   3. Чтобы побудить стероидных деятельность в культивированный говядину GC, дополнение α-MEM дополнительно с 20 нг/мл фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), 50 нг/мл R³ ИФР-1 и 2 мкм андростендион.
      Примечание: Всегда дополняют эти компоненты незадолго до начала обмена культуры или СМИ. Избегайте повторные циклы замораживания оттаивания для фондовых решения ФСГ и IGF-1, как это может подорвать действие стероидов.

5. клетки культуры работы

1. Оттепель клетки быстро в водяной бане при 37 ° C для 3-4 мин и передачи суспензию клеток в подогретым α-MEM 37 ° C (без вкладыша гормон). Для центрифугирования рекомендуется окончательный объём 10 мл.
2. Центрифуга GC для 3 мин при комнатной температуре и на 500 x g. Выбросите супернатант. Добавьте подогретым и дополнениями α-MEM и Ресуспензируйте тщательно клетки.
3. Семя GC на плотности 1 х 10⁵ или 1 х 10⁶ клеток на хорошо в окончательном объеме 500 мкл. включают в себя технические реплицирует по крайней мере три культуры скважин в состояние.
4. Инкубации клеточной культуры в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO₂ для 8 d.
5. Выполните обмен средств массовой информации каждый день. Замените только две трети культуры средств массовой информации для уменьшения стресса и облегчить адаптацию клеток свежим средствам массовой информации.
   Примечание: GC образуют типичный фенотип фибробластоподобных через несколько дней в культуре и склонны кластера вместе. В культуре высокая плотность клеток большие кластеры находятся более часто по сравнению с нормальной густоты GC культуры (рис. 1, левая против правой панели).

6. последующий анализ клетки культивировали гранулезы

1. Для выполнения анализа стероидных гормонов, собирать средства массовой информации и заморозить ее при-20 ° C. Используйте соответствующие методы для анализа концентрации эстрадиола и прогестерона в провел СМИ [например, радиоиммуноанализ (РИА)]¹⁴.
2. Для последующего анализа различных целевых молекул (РНК, ДНК, белки, и т.д.) Лизируйте клетки непосредственно в культуры блюдо с соответствующей лизировать агентом как рекомендованный поставщик.
   Примечание: Для большинства процедур изоляции, это можно остановить протокол здесь, как лизированных клетки могут храниться при температуре-20 ° C до 1 недели. Для более длительного хранения клетки должны храниться при температуре-80 ° C.
3. Чтобы определить изобилие стенограмма, синтеза cDNA и измерения конкретных стенограммы количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) методы¹⁵. Статистическая оценка должна включать по меньшей мере три параллельные мероприятия различных клеточных культур, возникла из различных клеточных препаратов (биологические репликация).

Результаты

GC покрытием в 1 х 10⁵ клеток/хорошо дисплей типичный вид фибробластоподобных как они формируют расширением клетки, сопоставимы с фибробластов и, как правило, для создания кластеров (рис. 1a и 1 c). Увеличение плотности покрытия в 10 раз до 1 x 10-⁶ клеток/хорошо не изменить морфологию но больше кластеры клеток может наблюдаться (рис. 1b и 1 d, стрелки). Как уже показано в предыдущей публикации коллаген покрытие культуры блюд во многом улучшить вложение клетки¹³.

Первоначальный криоконсервирования значительно не изменять физиологические характеристики клеток в культуре по сравнению с тех, кто непосредственно культивированный свежевыделенных образцов. Это показано на рисунке 2 как изобилие Стенограмма (измеряется ПЦР) несколько маркера, что гены не отличается при сравнении культивируемых клеток производных от замороженных или свежевыделенных бассейнов.

Рисунок 3 показывает представитель результаты анализа стероидных гормонов (измеряется RIA) в бычий GC, культивируемых в нормальной против высокой плотности. Концентрации эстрадиола в высокой плотности культуре, по сравнению с нормальной плотности культуры, заметно снизилась, в то время как производство прогестерона, как правило, выше.

Сравнительный анализ нескольких генов (измеряется ПЦР) в высоко - против нормальной плотности культур показали значительный эффект (рис. 4). CYP19A1, кодирование ключевого фермента ароматазы биосинтез эстрадиола, а также гонадотропин рецепторов FSHR, значительно вниз регулировались. В отличие от генов RGS2 и VNN2 показали значительные вверх регулирование. Эти результаты ясно показывают, что конкретные процессы клеточной дифференцировки индуцированной путем увеличения покрытия плотность клеток.

Рисунок 1: культивированный клетки гранулезы говядину в нормальной (левой панели) и плотность высокая клеток (правой панели). ( c) клетки и культивировали на плотности 1 х 10⁵ клеток/хорошо отображается типичный фибробластоподобных фенотип. (b и d) GC, культивируемых на высокой обшивка плотности (1 х 10⁶ клеток/а), как правило, в форме больших клеток кластеры (стрелки) более часто по сравнению с клетки под нормальной густоты (левая панель). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: сравнение клетки культивировали непосредственно после изоляции и после криоконсервирования. Клетки были культивированный на плотности 1 х 10⁵ клеток на хорошо. Выражение гена нескольких маркер стенограммы оценивалась и показали никакой разницы между культивируемых клеток с или без первоначального криоконсервирования. Boxplot показывает средний n = 3. Два-Стьюдента t-теста, p-значения включены. Эта цифра воспроизводится от Baufeld и Vanselow¹⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: концентрация стероидных гормонов в клетках гранулезы, культивируемых на покрытие различных плотностей. Концентрации эстрадиола (Е2) значительно сократилось, когда GC были культивированный на плотность высокой клеток, тогда как концентрация прогестерона (P4) только, как правило, выше. Концентрация гормона был исправлен для содержание ДНК для нормализации для числа различных клеток. Среднее и SEM n = 3 отображаются. p > 0,05, два-Стьюдента t-теста. Эта цифра воспроизводится от Baufeld и др. ¹⁵. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Обилие функциональных ключей стенограммы в клетки гранулезы культивировали в нормальной против высокой обшивка плотность. Говядину GC, культивированный сыворотки свободных условиях для 8 d выявили конкретные правила нескольких выбранных маркерных генов. Boxplot отображает средний n = 3 отдельных реплицирует. p < 0,05, два-Стьюдента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Представлена ячеечная модель культуры предоставляет инструмент для анализа клеток гранулезы дифференциации в пробирке. Несколько исследований показали, что сыворотка бесплатно выращивание предпосылкой для поддержания стероидных деятельность в культивированный говядину GC или GC другие виды^8,9. Кроме того покрытие культуры блюдо с компонентов внеклеточного матрикса (например, коллагеновая R)¹³, значительно улучшились вложение клеток. Еще одной важной особенностью является период длительного культуры. Недавно было продемонстрировано, что долгосрочные культуры необходимо получить достаточно стероидогенных активности и сбалансированных выражение гранулезы ячейки личность маркеры¹⁷. Похоже, что GC требуется время, чтобы оправиться от физического стресса во время процедуры изоляции.

Средства массовой информации добавки, ФСГ, IGF-1 и андростендион известны побудить активность ароматазы в культивированный GC. Особенно добавки с андростендион является абсолютно необходимым, как GC нужно прекурсором для синтеза эстрадиола. Это был ранее опубликован^11,18 и, таким образом, далее не изучалось в ходе настоящего исследования. Однако адаптация ФСГ, IGF-1 и андростендион концентрации может быть необходимым для других экспериментальных установок.

Криоконсервация метод, описанный здесь может помочь улучшить организацию экспериментов культуры ткани, делая их более независимыми от различной питания с яичников. По данным предыдущих испытаний, криоконсервация не влияет на GC фенотип или стероидов производства в культуре. Кроме того обилие маркер стенограммы в культивируемых клеток не выявило значительные различия, сравнения образцов, приготовленных из свежевыделенных клеток с теми, кто ранее подвергался криоконсервирования¹⁶.

Важным параметром для нынешней модели культуры GC является покрытие плотности. Как показали Результаты представитель, увеличение плотности покрытия индуцированной значительные изменения физиологических и молекулярных характеристик. Некоторые гены регулируются определенным образом, напоминающие изменений, вызванных стимуляции LH в естественных условиях^4,19. Тот факт, что увеличение плотность ячеек можно доехать дифференциация подобных процессов искусственного говядину GC должна тщательно рассматриваться в этой GC в vitro модели, чтобы избежать противоречивых результатов между реплицирует. Таким образом противоречивые результаты других исследований могут быть отнесены к плотности различных клеток и следует изучить более внимательно.

Культура модели, описанной здесь выявлено не реагировать на LH, как стенограммы рецептора LHCGR являются близко к пределу обнаружения. Таким образом имитирует ЛГ всплеск так ситуацию в естественных условиях удалось побудить дифференциация¹³. Тем не менее эта модель обеспечивает полезный инструмент для изучения эстрадиол активные GC в первичной культуре, в частности, не функциональные говядину GC линии существуют в настоящее время.

Различные клинические протоколы могут испытываться в нынешней модели культуры GC, которые помогут разгадать механизмы регулирования стероидов производства или GC дифференциации. Кроме того, один факторы, которые вовлечены в процессы развития могут анализироваться отдельно. Таким образом эта культура модель обеспечивает основу для множества различных приложений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+	Merck-Millipore	L 182-05	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2213	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/ml)	Merck-Millipore	A 2612	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 ml syringe (Omnifix Luer)	Braun	4616025V
18 G needle	Roth	C724.1
fetal calf serum	Merck-Millipore	S 0115	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 ml)	TPP Faust	TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container	Corning	432004
culture dish, 24-well, flat bottom	TPP Faust	TPP 92424
collagen R (0.2 %)	Serva	47254
α-MEM	Merck-Millipore	F 0915	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM)	Merck-Millipore	K 0282	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate	Merck-Millipore	L 1713	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA	Sigma	A3311
HEPES	Merck-Millipore	L 1603	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite	Sigma	S9133	dissolved in sterile water
transferrin	Sigma	T1283	dissolved in sterile water
insulin (10 mg/ml)	Sigma	I0516	dissolved in 1x PBS
NEA	Merck-Millipore	K 0293	originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH	Sigma	F4021	we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1	Sigma	I1146	we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA
androstenedione	Sigma	46033	we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol