Medición de la concentración de iones en la capa de límite marchara con pipeta abierta de Patch-Clamp: implicaciones en el Control de los canales iónicos por líquido fluyen

Resumen

Canales del ion Mechanosensitive se estudian a menudo en términos de sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo fluido con grabación de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados de flujo de fluido-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneo. Aquí, ofrecemos métodos para prevenir y corregir estos errores con una base teórica.

Resumen

Flujo de fluidos es un importante estímulo ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la vasodilatación inducida por el flujo de fluido. Aunque no se entienden totalmente los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas para flujo líquido/fuerza, fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente. Por lo tanto, sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos ha sido estudiada mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados y la interpretación de los datos pueden ser erróneas. Aquí, presentamos la evidencia experimental y teórica para errores relacionados con el flujo de líquido y proporciona métodos para estimar, prevenir y corregir estos errores. Cambios en Unión potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl. flujo de fluidos podría entonces cambiar el metal líquido cruce potencial de aproximadamente 7 mV. Por el contrario, midiendo el cambio de voltaje inducido por el flujo de fluidos, se estimó la concentración de iones en la capa de límite inviolables. En la condición estática, las concentraciones de iones real junto a la Ag/AgCl referencia electrodo o ion canal entrada en la superficie de la membrana de la célula pueden llegar a tan bajos como 30% de en la condición de flujo. Colocando una agarosa 3 M puente KCl entre el electrodo de referencia y líquido de baño puede haber evitado este problema de desplazamiento potencial de cruce. Sin embargo, el efecto de marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula no podría fijarse de este modo. Presentamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara con una pipeta abierta abrazadera del remiendo, haciendo hincapié en la importancia de utilizar un puente de sal de agarosa mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de ion. Por lo tanto, este nuevo enfoque, que tenga en cuenta las concentraciones reales de iones en la capa de límite inviolables, puede proporcionar la penetración útil en el diseño experimental y la interpretación de los datos relacionados con la regulación de la tensión de esquileo líquido de los canales iónicos .

Introducción

Flujo de fluidos es una importante señal ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos como la vasodilatación inducida por el flujo de líquido y fluido cortante fuerza dependiente vascular remodelación y desarrollo^{1,2, 3,4,5}. Aunque los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas a fuerza de esquileo del flujo de fluidos no se entienden completamente, se cree que fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente a respuestas inducidas por el flujo de fluidos^{5 , 6 , 7 , 8}. por ejemplo, activación del rectificador endotelial interno Kir2.1 y Ca^{2 +}-K activada⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) canales después de Ca^{2 +} afluencia de flujo de fluidos se ha sugerido para contribuir a líquido vasodilatación inducida por el flujo^6,7,8. Por lo tanto, muchos canales del ion, especialmente activado mecánicamente o - inhibición canales, han sido estudiadas en términos de flujo fluido/seguridad sensibilidad a la fuerza con la técnica de patch-clamp^{6,9,10 , 11}. sin embargo, dependiendo del protocolo experimental realizado durante la grabación-abrazadera del remiendo, los resultados y la interpretación de los datos de flujo líquidos-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneas^10,11.

Una fuente de artefactos inducidos por el flujo de fluido en grabación de patch-clamp es de la Unión potencial entre el baño líquido y de electrodo de referencia Ag/AgCl¹¹. Se cree generalmente que la ensambladura del metal líquido potencial entre el baño líquido y el electrodo de Ag/AgCl es constante la concentración de Cl^– del líquido del baño se mantenga constante, teniendo en cuenta la respuesta química entre la solución del baño y el electrodo de Ag/AgCl que:

AG + Cl^–↔ AgCl + electrón (e^–) (ecuación 1)

Sin embargo, en un caso donde la reacción electroquímica general entre la solución de baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (ecuación 1) se procede de izquierda a derecha, la concentración de Cl^– del baño líquido adyacente a Ag/AgCl de referencia electrodo (capa límite marchara^12,13,14,15) puede ser mucho menor que en la mayor parte del baño de solución, a menos que suficiente transporte convencionales está garantizada. Utilizando un electrodo de Ag/AgCl viejo o no ideales con cloración inadecuada de Ag puede aumentar ese riesgo. Este artefacto relacionados con el flujo de fluido en el electrodo de referencia, de hecho, puede ser excluido, simplemente colocando un puente convencional de agarosa-sal entre el baño líquido y referencia electrodo, ya que el artefacto se basa en alteraciones en Cl verdadero^– concentración junto a la del electrodo de Ag/AgCl¹¹. El protocolo presentado en este estudio describe cómo prevenir los cambios potenciales relacionadas con el flujo de salida y medir las concentraciones de iones real en la capa de límite inviolables.

Después de colocar una agarosa puente KCl entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl, hay otro factor fundamental que debe considerar: solo como referencia de Ag/AgCl actúa como un electrodo Cl^– , los canales iónicos también pueden funcionar como un electrodo selectivo de iones. La situación de una capa límite inviolables entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl se presenta durante el movimiento de iones entre las soluciones a través de los canales iónicos de la membrana extracelulares e intracelulares. Esto implica que debe tener precaución al interpretar la regulación de iones canales de flujo de fluidos. Como comentamos en nuestro anterior estudio¹¹, el movimiento de iones a través de una solución en la que existe un gradiente electroquímico puede ocurrir por tres mecanismos distintos: difusión, migración y convección, donde la difusión es el movimiento inducida por el gradiente de concentración, la migración es el movimiento impulsado por el gradiente eléctrico y la convección es el movimiento a través de flujo de líquido. Entre estos mecanismos de tres transporte, el modo de convección contribuye más al movimiento de iones¹¹ (> 1.000 veces mayor que la difusión o la migración en la configuración habitual de abrazadera del remiendo). Esto forma la base teórica de por qué conexiones posibles entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl pueden muy bajo diferentes condiciones estática y el flujo de fluido¹¹.

Según la hipótesis propuesta anteriormente, algunos efectos facilitatory del flujo de fluidos en el canal de ion actual pueden inferirse de la restauración convectiva de las concentraciones de iones real junto a la entrada del canal en la superficie de la membrana (capa de límite inviolables) ¹⁰. en este caso, los efectos inducidos por el flujo fluidos en corrientes del canal de iones simplemente han surgido de eventos electroquímicos, no de la regulación de la compuerta de canal de iones. Una idea similar fue sugerida previamente por Barry y colaboradores^12,13,14,15 basado en rigurosas consideraciones teóricas y la evidencia experimental, también conocida como la capa inviolables o efecto del número de transporte. Si algunos canales iónicos tienen suficiente solo canal conductancia y suficientemente largo tiempo abierto para proporcionar suficiente transporte precios a través de los canales (una más rápida tasa de transporte en la membrana que en la superficie de la membrana inviolables), un efecto de capa límite pueden surgir . El transporte dependiente de la convección puede contribuir a las eventual facilitaciones inducida por el flujo de líquido de ion actual^{10,12,13,14,15}.

En este estudio, destacamos la importancia de la utilización de agar o agarosa al puente de sal mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de iones. También proporcionamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara junto a los Ag/AgCl referencia electrodos y membranas canales de iones. Además, la interpretación teórica de fluido modulación inducida por el flujo de corrientes de canal de iones (es decir, convección hipótesis o efecto número de capa marchara transporte) puede proporcionar información valiosa para diseñar e interpretar estudios sobre cortante fuerza-regulación de canales iónicos. Según el efecto de número de transporte de capa límite inviolables, predecimos que corrientes de canal de iones a través de todos los tipos de canales iónicos de membrana pueden facilitarse por el flujo de líquido, independientemente de su sensibilidad biológica a la fuerza de esquileo del flujo de fluidos, pero sólo si los canales iónicos tienen conductancia suficiente de canal único y tiempo abierto. Mayores densidades de corriente de canal de ion puede aumentar el efecto de la capa límite marchara en la superficie de la membrana de la célula.

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Protocolo

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices institucionales de la Universidad Konkuk.

1. agarosa sal puentes entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl

Nota: Agarosa 3M KCl puentes de sal se producen como se ha descrito¹² con variaciones de menor importancia.

1. Formación de puentes
   1. Doblar los tubos capilares de vidrio fuego para formar una forma de U según el caso. El diámetro interior de los capilares debe ser lo bastante grande como para reducir la resistencia durante la grabación de las corrientes de iones grandes. Tubos con un diámetro interno de 2-5 mm son generalmente aceptables.
2. Preparación de solución de agarosa de 3 M KCl
   1. Preparar 100 mL de solución de KCl de 3 M (1 M o 2 M también es aceptable).
   2. Pesar 3 g de agarosa.
   3. Disolver la agarosa en 100 mL de KCl (es decir, 3% de agarosa) sobre una placa caliente entre 90 y 100 ° C.
3. Carga de los puentes con agarosa de KCl de 3 M
   1. Para facilitar la carga, sumerja los puentes de cristal en forma de U en la solución de agarosa-KCl.
      Nota: Es fácil de cavar hacia fuera los puentes de cristal si la solución de agarosa-KCl está contenida en un recipiente poco profundo y amplio.
   2. Mantenerlos durante la noche a temperatura ambiente (RT) para la agarosa y endurecen.
   3. Con cuidado sacar los puentes de cristal agarosa-KCl-cargado de la agarosa-sal conjunto/endurecido.
4. Almacenamiento de los puentes
   1. Prepare suficiente volumen (es decir, 500 mL) de la solución de KCl de 3 M en una botella de cuello ancho.
   2. Guarde los puentes de agarosa-sal preparados en la botella en el refrigerador.

2. aplicación de la fuerza de esquileo del flujo de fluidos a las células en una cámara de sujeción parche

Nota: En la figura 1se muestra un diagrama esquemático del montaje experimental de patch-clamp.

1. Lugar un contenedor cargado con solución de baño (volumen y altura deben ser medidos ya) por encima de la cámara de patch-clamp.
2. Llene la cámara de la abrazadera del remiendo con la solución de baño por aspiración del tubo.
3. Para detener el flujo de fluidos, clip del tubo en el lado del contenedor para bloquear el flujo de fluidos y, a continuación, enganche el tubo en el lado de aspiración para detener la succión al mismo tiempo. Esta es la condición de control "fijos".
4. Para aplicar fuerza de esquileo del flujo de fluidos, Abra ambos tubos a los lados del contenedor y la succión al mismo tiempo.
5. Antes o después de aplicar la fuerza de esquileo del flujo de fluidos a la celda, medir el caudal en mL/min.
6. Calcular el caudal midiendo la disminución en el volumen de líquido en un momento dado.
7. Del caudal medido y geometría (estructura) de la cámara del baño, debe estimarse la fuerza de corte aplicada a la celda por el flujo de fluidos (véase la sección discusión).
8. Alternativamente, para controlar el caudal (para pasos 2.3-2.6), utilizar una bomba de perfusión. En este caso, tenga cuidado asegurar una constante en lugar de un flujo pulsátil.

3. medición de cambios en el potencial de la ensambladura del Metal líquido por flujo de fluidos entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (Figura 3A)

1. Utilizar el electrodo de Ag/AgCl o pellets, que está disponible en los productos confeccionados, sin el puente de sal de agarosa.
2. Preparación de solución salina fisiológica de una sal normal para la sala de baño (p. ej., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 11 mM D-glucosa, pH ajustado a 7,4 con NaOH).
3. Coloque una pipeta de parche que contiene una solución de KCl de 3 M en la cámara para minimizar el cambio de potencial de unión entre la pipeta y soluciones de baño.
4. Fijar el amplificador de voltaje-abrazadera para el modo actual de la abrazadera ("I = 0" o "CC").
5. Después de anular el potencial desplazamiento inicial, medir los cambios en el voltaje inducido por diferentes caudales.
6. Para verificar que los cambios en el voltaje son potenciales de unión de metal líquido, vuelva a examinar el efecto del flujo sobre el potencial de cruce con el puente de sal de agarosa entre la solución del baño y electrodo Ag/AgCl.

4. experimental estimación de la concentración de Cl verdadero^– en la marchara capa adyacente al electrodo de Ag/AgCl bajo condición estática (figura 3B)

1. De los resultados del paso 3, dibujar las relaciones de flujo potencial de cruce y estimar el valor máximo (saturación) de potencial cambio de cruce por el caudal de fluido de supra.
2. Preparar soluciones con diferentes concentraciones de Cl (es decir, 50, 99, 147, 195 y 288 mM de NaCl).
3. Cambiando el Cl^– la concentración en el líquido de baño, dibujar la Unión potencial [Cl^–] relación. Tenga en cuenta que la tasa de líquido debe ser constante y suficientemente alta (> 30 mL / min) para evitar la disminución de la concentración de Cl^– a la del adyacente electrodo de referencia Ag/AgCl.
4. De las curvas de relación de dos, estimar los cambios en la concentración de Cl^– de la cambio del potencial de cruce medido.

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Resultados

Todo celular dependientes de voltaje tipo L de Ca^{2 +} canal (VDCC_L) corrientes se registraron en los miocitos arterial mesentérico de rata enzimáticamente dispersos, como se describió anteriormente¹¹. Los miocitos arteriales se dializaron con una solución de pipeta Cs-ricos en la configuración de perforado de nistatina con solución de baño libre de cationes divalentes para facilitar el flujo de corriente a través de VDCC_L

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Discusión

En este estudio, hemos demostrado un método para medir la real concentración de Cl^– en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl determinando el potencial cruce de metal líquido con una pipeta abierta abrazadera del remiendo con un alta KCl concentración. El cambio en la concentración de Cl^– en la capa límite puede resultar en un cambio de potencial de salida cuando se cambia de estática a las condiciones de flujo de fluido. Simplemente usando una agarosa puente KCl en...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08