Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Riepilogo

Canali ionici mechanosensitive sono spesso studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con registrazione di patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, l'esito il fluidi flusso-regolamenti dei canali ionici possa essere errata. Qui, forniamo metodi per prevenire e correggere tali errori con una base teorica.

Abstract

Flusso del fluido è un importante stimolo ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici, quali vasodilatazione indotta da flusso fluido. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di flusso fluido/taglio completamente non sono capiti, fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating può contribuire criticamente. Di conseguenza, sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici è stato studiato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, i risultati e l'interpretazione dei dati può essere errate. Qui, presentiamo la prova sperimentale e teorica per errori relativi al flusso di fluido e fornisce metodi per la stima, la prevenzione e la correzione di questi errori. Cambiamenti nella giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione sono stati misurati con una pipetta aperta riempita con 3M KCl. flusso del fluido potrebbe quindi spostano la giunzione liquido/metallo potenziali per circa 7 mV. Al contrario, misurando lo spostamento di tensione indotto dal flusso del fluido, abbiamo stimato la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred. In condizioni statiche, le concentrazioni di ione reale adiacente all'ingresso di canale Ag/AgCl riferimento elettrodo o ione alla superficie della membrana cellulare possono raggiungere come basso come approssimativamente il 30% di quello nella condizione di flusso. Ponendo un'agarosi 3M ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione può impedire questo problema di spostamento potenziale di giunzione. Tuttavia, l'effetto di unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare non poteva essere risolto in questo modo. Qui, forniamo un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred con una pipetta aperta patch-clamp, sottolineando l'importanza dell'utilizzo di un sale di agarosio-ponte mentre studiava fluido regolamento indotta da flusso di correnti di ioni. Pertanto, questo nuovo approccio, che prende in considerazione le reali concentrazioni di ioni nello strato limite unstirred, può fornire la comprensione utile il disegno sperimentale ed interpretazione di dati legate alla sollecitazione di taglio fluido regolazione dei canali ionici .

Introduzione

Flusso del fluido è un importante segnale ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici come la vasodilatazione indotta da flusso fluida e fluido shear forza-dipendente vascolare rimodellamento e sviluppo^{1,2, 3,4,5}. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di taglio di flusso del fluido completamente non sono capiti, si ritiene che fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating criticamente può contribuire alle risposte indotta da flusso fluido^{5 , 6 , 7 , 8}. ad esempio, l'attivazione del raddrizzatore inward endoteliale Kir 2.1 e Ca^{2 +}-attivato K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) canali dopo l'afflusso di Ca^{2 +} di flusso del fluido è stata suggerita per contribuire al fluido vasodilatazione indotta da flusso^6,7,8. Di conseguenza, molti canali ionici, soprattutto meccanicamente attivato o - inibiti canali, sono stati studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con il patch-clamp tecnica^{6,9,10 , 11}. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale eseguito durante la registrazione di patch-clamp, risultati e interpretazione dei dati sul flusso fluidi-regolamenti delle scanalature dello ione può essere erronea^10,11.

Dallo svincolo di potenziale tra il liquido del bagno e riferimento Ag/AgCl elettrodi¹¹è una fonte di fluidi indotta da flusso artefatti nella registrazione di patch-clamp. Si ritiene generalmente che la giunzione di liquido/metallo potenziale tra il fluido di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl è costante come la concentrazione di Cl^– del fluido balneazione viene mantenuta costante, considerando la risposta chimica tra la soluzione di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl per essere:

AG + Cl^–↔ AgCl + elettrone (e^–) (equazione 1)

Tuttavia, in un caso dove la reazione elettrochimica nel complesso tra la soluzione di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (equazione 1) procede da sinistra a destra, la concentrazione di Cl^– del fluido balneare adiacente di Ag/AgCl fare riferimento elettrodo (strato limite unstirred^12,13,14,15) può essere molto inferiore a quello nella maggior parte dei balneari soluzione, a meno che non sufficiente convezione trasporto è assicurato. Utilizzando un elettrodo Ag/AgCl vecchio o non ideale con insufficiente clorazione di Ag può aumentare tale rischio. Questo artefatto correlate a flusso fluido presso l'elettrodo di riferimento, infatti, possa essere esclusi semplicemente posizionando un ponte convenzionale dell'agarosi-sale tra il fluido di balneazione e riferimento dell'elettrodo, dal momento che il manufatto si basa sulle alterazioni nella real Cl^– concentrazione adiacente l' elettrodo Ag/AgCl¹¹. Il protocollo presentato in questo studio viene descritto come impedire i cambiamenti di potenziale di giunzione correlate a flusso e misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred.

Dopo aver posizionato un'agarosi ponte di KCl tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl, c'è un altro fattore cruciale da considerare: proprio come il riferimento Ag/AgCl elettrodi agisce come un elettrodo Cl^– , scanalature dello ione possono funzionare anche come un elettrodo iono-selettivi. La situazione di uno strato di contorno unstirred tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl si verifica durante il movimento di ioni tra le soluzioni extracellulare e intracellulare attraverso i canali ionici di membrana. Ciò implica che l'attenzione dovrebbe essere usato quando interpretare il regolamento dello ione di canali di flusso del fluido. Come discusso nel nostro precedente studio¹¹, il movimento di ioni attraverso una soluzione in cui è presente un gradiente elettrochimico può verificarsi tramite tre meccanismi distinti: convezione, dove la diffusione è il movimento, la migrazione e diffusione indotta da gradiente di concentrazione, migrazione è il movimento guidato dal gradiente elettrico, e la convezione è il movimento attraverso il flusso di fluido. Tra questi meccanismi di tre trasporto, modalità convezione contribuisce la maggior parte al movimento di ioni¹¹ (> 1.000 volte maggiore diffusione o migrazione sotto impostazioni solite patch-clamp). Questo costituisce la base teorica del perché giunzione potenziali tra la balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl può molto sotto diverse condizioni statiche e flusso fluido¹¹.

Secondo l'ipotesi proposta sopra, alcuni effetti facilitatory del flusso del liquido sul canale dello ione corrente possono essere dedotta dal restauro convettivo di concentrazioni di ioni reale adiacente all'ingresso del canale sulla superficie di membrana (strato di contorno unstirred) ¹⁰. In questo caso, gli effetti indotta da flusso fluidi sulle correnti di canale ionico sono semplicemente sorti da eventi elettrochimici, non dal regolamento di ioni canale gating. Un'idea simile è stata suggerita in precedenza da Barry e colleghi^12,13,14,15 basato su considerazioni teoriche rigorose e la prova sperimentale, anche conosciuto come lo strato unstirred o trasporto numero effetto. Se alcuni canali ionici hanno sufficiente conduttanza del singolo canale e abbastanza a lungo tempo aperto per fornire sufficiente trasporto velocità attraverso i canali (un più veloce tasso di trasporto nella membrana che in superficie della membrana unstirred), un effetto di strato di contorno possono sorgere . Quindi, il trasporto di convezione-dipendente può contribuire alle eventuali agevolazioni indotta da fluido-flusso di ioni corrente^{10,12,13,14,15}.

In questo studio, sottolineiamo l'importanza di utilizzare un agar o agarosio sale-ponte mentre studiava regolamento indotta da fluido-flusso di correnti di ioni. Forniamo anche un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred adiacente per i canali di ioni Ag/AgCl elettrodi e membrana di riferimento. Inoltre, l'interpretazione teorica di fluido modulazione indotta da flusso di correnti di canale ionico (vale a dire, ipotesi di convezione o effetto numero di unstirred livello trasporto) possa fornire informazioni preziose per la progettazione e interpretare gli studi su il taglio forza-regolamento dei canali ionici. Secondo l'effetto numero di trasporto unstirred strato di contorno, prevediamo che le correnti del canale ionico attraverso tutti i tipi di canali ionici di membrana possono essere facilitate dal flusso del fluido, indipendente della loro sensibilità biologica a forza di taglio di flusso del fluido, ma solo se i canali ionici sono sufficienti monocanale conduttanza e lungo tempo aperto. Maggiore densità di corrente del canale di ioni può aumentare l'effetto di unstirred strato limite sulla superficie della membrana cellulare.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Konkuk University.

1. agarosio sale ponti tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl

Nota: Agarosio 3M KCl sale ponti sono prodotte come precedentemente descritto¹² con variazioni minori.

1. Formazione di ponti
   1. Piegare i tubi capillari di vetro fuoco per formare una forma a U come appropriato. Il diametro interno dei capillari dovrebbe essere abbastanza grande per ridurre la resistenza in serie durante la registrazione correnti di grandi ioni. Tubi con un diametro interno di 2-5 mm sono solitamente accettabili.
2. Preparazione della soluzione di KCl 3M agarosio
   1. Preparare 100 mL di soluzione di KCl 3M (1m o 2m è anche accettabile).
   2. Peso 3 g di agarosio.
   3. Sciogliere l'agarosio in 100 mL di KCl (cioè, 3% di agarosio) su una piastra calda tra 90 e 100 ° C.
3. I ponti con 3M KCl agarosio di caricamento
   1. Per facilitare il carico, immergere i ponti di vetro a forma di U nella soluzione di agarosio-KCl.
      Nota: È facile da scavare i ponti di vetro se la soluzione di agarosio-KCl è contenuta in un contenitore poco profondo e largo.
   2. Tenerli durante la notte a temperatura ambiente (TA) per l'agarosio impostare e indurire.
   3. Accuratamente di scavare i ponti di agarosio-KCl-caricato vetro dal set/indurito dell'agarosi-sale.
4. Memorizzare i ponti
   1. Preparare abbastanza volume (cioè, 500 mL) della soluzione di KCl 3M in un flacone a collo largo.
   2. Memorizzare i ponti di agarosio-sale preparati in bottiglia in frigorifero.

2. applicazione della forza di taglio di flusso del fluido alle cellule in una camera di Patch di bloccaggio

Nota: Un diagramma schematico della disposizione sperimentale patch clamp è illustrato nella Figura 1.

1. Posto in un contenitore caricato con soluzione di balneazione (volume e l'altezza dovrebbe già essere misurati) sopra la camera di patch-clamp.
2. Riempire la camera di patch-clamp con la soluzione di balneazione di suctioning il tubo.
3. Per interrompere il flusso del fluido, il tubo di clip a lato del contenitore di bloccare il flusso del fluido, quindi il tubo di clip sul lato aspirazione per interrompere l'aspirazione allo stesso tempo. Questa è la condizione di controllo "stazionario".
4. Per applicare la forza di taglio di flusso del fluido, aprire entrambi i tubi sul lato aspirazione e contenitore allo stesso tempo.
5. Prima o dopo aver applicato la forza di taglio di flusso del fluido alla cella, misura della portata in mL/min.
6. Calcolare la portata misurando la diminuzione nel volume del liquido in un dato tempo.
7. Dalla portata misurata e la geometria (struttura) della camera di balneazione, la forza di taglio applicata alla cella di flusso di liquido dovrebbe essere stimata (Vedi sezione discussione).
8. In alternativa, per controllare il tasso di flusso (per la procedura 2.3-2.6), è possibile utilizzare una pompa di perfusione. In questo caso, fare attenzione a garantire una costante anziché un flusso pulsatile.

3. misurare i cambiamenti nel potenziale di giunzione metallo liquido di flusso del fluido tra soluzione del bagno ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl (Figura 3A)

1. Utilizzare l'elettrodo Ag/AgCl o pellet, che è disponibile dai prodotti già pronti, senza il ponte salino dell'agarosi.
2. Preparare una soluzione salina fisiologica sale per la camera di balneazione (ad es., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 11 mM D-glucosio; pH regolato a 7.4 con NaOH).
3. Posizionare una pipetta patch contenente una soluzione di KCl 3M in aula per ridurre al minimo lo spostamento potenziale di giunzione tra la pipetta e soluzioni di balneazione.
4. Difficoltà l'amplificatore di tensione-morsetto per la modalità corrente del morsetto ("io = 0" o "CC").
5. Dopo annullando il potenziale di offset iniziale, misurare le variazioni di tensione indotte da varie portate.
6. Per verificare che le variazioni di tensione sono potenziali di giunzione liquido/metallo, ri-esaminare l'effetto del flusso del fluido sul potenziale di giunzione utilizzando il bridge di agarosio-sale tra la soluzione del bagno e un elettrodo Ag/AgCl.

4. sperimentale stima della concentrazione reale Cl^– nello strato Unstirred adiacente all'elettrodo Ag/AgCl sotto condizione statica (Figura 3B)

1. Dai risultati del passaggio 3, disegnare le relazioni di potenziale-portata di giunzione e stimare il valore massimo (saturazione) di MAIUSC potenziale di giunzione dalla portata supra-fluido.
2. Preparare soluzioni con varie concentrazioni di Cl (cioè, 50, 99, 147, 195 e 288 mM di NaCl).
3. Modificando il Cl^– concentrazione nel liquido bagnarsi, disegnare la giunzione potenziali-[Cl^–] relazione. Si noti che il tasso di liquido deve essere costante e sufficientemente elevata (> 30 mL / min) per evitare la diminuzione della concentrazione di Cl^– a quello dell'elettrodo di riferimento Ag/AgCl adiacente.
4. Le curve di due rapporti, stimare i cambiamenti nella concentrazione di Cl^– dal turno di potenziale di giunzione misurato.

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Risultati

A cellula intera tensione-dipendente tipo L Ca^{2 +} canale (VDCC_L) correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto, come descritto in precedenza¹¹. I miociti arteriosi sono stati dializzati con una soluzione di pipetta Cs-ricco sotto la configurazione nistatina-perforato con soluzione di balneazione privo di cationi bivalenti per facilitare il flusso di corrente attraverso VDCC_L

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Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare la concentrazione reale di Cl^– nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl determinando la giunzione metallo liquido potenziale con una pipetta di patch-clamp aperto riempita con un alta KCl concentrazione. Il cambiamento nella concentrazione di Cl^– nello strato limite può causare uno spostamento del potenziale di giunzione quando si passa da statico a condizioni di flusso fluido. Semplicemente utilizzando un'ag...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08