Mesure de la Concentration en ions dans la couche limite stationnaire avec la Pipette ouverte Patch-Clamp : incidences sur le contrôle des canaux ioniques par Fluid Flow

Résumé

Canaux ioniques Mécanosensibles est souvent étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec enregistrement patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, l’issue sur le flux de fluides-règlements des canaux ioniques peut être erronée. Ici, nous fournissons des méthodes pour prévenir et corriger ces erreurs avec une base théorique.

Résumé

Écoulement de fluide est un stimulus environnemental important qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement fluide/shear force ne sont pas totalement comprises, régulation débit liquide de blocage de canal ionique peut contribuer critique. Par conséquent, écoulement fluide/shear force sensibilité des canaux ioniques a été étudiée en utilisant la technique du patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, les résultats et l’interprétation des données peuvent être erronées. Ici, nous présentons des preuves expérimentales et théoriques en erreurs de flux de fluide et fournir des méthodes pour l’estimation et la prévention et la correction de ces erreurs. Changements de potentiel entre l’électrode de référence Ag/AgCl et bain liquide de jonction ont été mesurées avec une pipette ouverte remplie de 3M KCl. écoulement de fluide pourrait alors déplacement le mV potentielle d’environ 7 jonction liquide/métal. À l’inverse, en mesurant le décalage de tension induit par l’écoulement du fluide, nous avons estimé la concentration en ions dans la couche limite stationnaire. À l’état statique, les concentrations d’ions real adjacentes à l’Ag/AgCl référence électrode ion canal d’entrée à la surface de la membrane cellulaire peuvent atteindre le plus bas aussi environ 30 % de ce débit. Placer un gel d’agarose 3M pont de KCl entre l’électrode de référence et fluide de baignade peut avoir empêché ce problème de jonction potentielle changeant. Toutefois, l’effet de la couche stationnaire adjacente à la surface de la membrane cellulaire ne pourrait pas fixée de cette manière. Ici, nous fournissons une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire avec une pipette ouverte patch clamp, mettant l’accent sur l’importance d’utiliser un gel d’agarose sel-pont alors qu’il étudiait les fluide régulation induite par l’écoulement de courants ioniques. Par conséquent, cette approche novatrice, qui prenne en considération les véritables concentrations des ions dans la couche limite stationnaire, peut fournir des observations utiles sur le plan expérimental et interprétation des données liées à la réglementation de la contrainte de cisaillement fluide des canaux ioniques .

Introduction

Écoulement de fluide est un important signal environnemental qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide et cisaillement fluide force dépendant vasculaire remodelage et développement^{1,2, 3,4,5}. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement du fluide force de cisaillement ne sont pas totalement comprises, on croit que régulation débit liquide de blocage de canal ionique critique contribue aux réponses induites par écoulement fluide^{5 , 6 , 7 , 8}. par exemple, l’activation de l’endothélium redresseur entrant Kir2.1 et Ca^{2 +}-activé K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) canaux après l’influx de Ca^{2 +} par l’écoulement du fluide a été suggéré de contribuer au fluide vasodilatation induite par le flux de^6,7,8. Par conséquent, de nombreux canaux ioniques, canaux spécialement activés mécaniquement ou - inhibés, ont été étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec le patch clamp technique^{6,9,10 , 11}. Toutefois, selon le protocole expérimental effectué au cours de l’enregistrement patch clamp, résultats et interprétation des données sur les flux de fluides-règlements des canaux ioniques peuvent être erronée^10,11.

Une source d’artefacts d’induite par le flux de fluide dans l’enregistrement patch-clamp est de la jonction éventuelle entre le fluide de baignoire et d’électrode Ag/AgCl référence¹¹. On croit généralement que la jonction liquide/métal potentielle entre le bain fluide et électrode Ag/AgCl est constante que la concentration en Cl^– du bain liquide est maintenue constante, compte tenu de la réaction chimique entre la solution de trempage et électrode Ag/AgCl pour être :

AG + Cl^–↔ AgCl + électron (e^–) (équation 1)

Toutefois, dans un cas où la réaction électrochimique globale entre la solution de trempage et l’électrode de référence Ag/AgCl (équation 1) procède de gauche à droite, la concentration en Cl^– le liquide de bain adjacente à l’Ag/AgCl référence électrode (couche limite stationnaire^12,13,14,15) peut être beaucoup plus faible que dans la majeure partie de la solution, de baignade, à moins que suffisamment transport par convection est assurée. En utilisant une électrode Ag/AgCl vieux ou non idéales avec chloration insuffisante de l’Ag peut augmenter ce risque. Cet artefact axés sur les flux de fluide à l’électrode de référence, en fait, peut être exclu en plaçant simplement un pont d’agarose-sel classique entre le fluide de la baignade et la référence électrode, étant donné que l’artefact est issu des altérations en véritable Cl^– concentration d’adjacente à électrode Ag/AgCl¹¹. Le protocole présenté dans la présente étude décrit comment empêcher les changements potentiels de jonction axés sur les flux et mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire.

Après avoir placé un gel d’agarose pont de KCl entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl, il y a un autre facteur crucial qui devrait être considéré : tout comme la référence électrode Ag/AgCl agit comme une électrode Cl^– , les canaux ioniques peuvent également fonctionner comme une électrode sélective des ions. La situation d’une couche limite stationnaire entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl se présente pendant le mouvement des ions entre les solutions extracellulaires et intracellulaires par le biais de canaux ioniques membranaires. Cela implique que l’attention doit être utilisé lors de l’interprétation de la réglementation des ions canaux par l’écoulement du fluide. Tel que mentionné dans notre précédente étude¹¹, le mouvement des ions à travers une solution dans laquelle existe un gradient électrochimique peut se produire par l’intermédiaire de trois mécanismes distincts : diffusion, migration et convection, où la diffusion est le mouvement induite par le gradient de concentration, la migration est le mouvement conduit par gradient électrique et convection est le mouvement par le biais de flux de fluide. Parmi ces mécanismes de trois transport, mode convection qui contribue le plus à la circulation des ions¹¹ (> 1 000 fois supérieures à la diffusion ou de la migration sous paramètres habituels patch clamp). Celui-ci constitue la base théorique de pourquoi jonction éventuelle entre le fluide de la baignade et électrode de référence Ag/AgCl peut très sous différentes conditions statiques et les flux de fluide¹¹.

Selon l’hypothèse proposée plus haut, certains effets facilitateur de débit des fluides sur le canal ionique actuel peuvent être déduites de la convection restauration des concentrations en ion réelle adjacentes à l’entrée du canal à la surface de la membrane (couche limite stationnaire) ¹⁰. dans ce cas, les effets d’induite par le flux de fluide sur les courants des canaux ioniques ont simplement découler d’événements électrochimiques, pas de la régulation des processus de blocage de canal ionique. Une idée similaire a été précédemment suggérée par Barry et ses collègues^12,13,14,15 basée sur des considérations théoriques rigoureuses et des preuves expérimentales, également connu sous le nom de la couche stationnaire ou effet numéro de transport. Si certains canaux ioniques ont suffisamment la conductance monocanal et assez longtemps ouverte-le temps de fournir des taux de transport suffisante par tous les canaux (un plus rapide taux de transport dans la membrane que dans la surface de la membrane stationnaire), un effet couche limite peuvent survenir . Ainsi, le transport par convection-dépendante peut contribuer à éventuelles facilitations induite par fluide-flux d’ion actuel^{10,12,13,14,15}.

Dans cette étude, nous insistons sur l’importance d’utiliser une gélose ou agarose sel-pont alors qu’il étudie la régulation induite par fluide-flux des courants ioniques. Nous fournissons également une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire adjacente aux Ag/AgCl référence électrode et membrane canaux ioniques. En outre, l’interprétation théorique de fluide modulation induite par le flux des courants des canaux ioniques (c.-à-d., hypothèse de convection ou effet numéro de transport couche stationnaire) peut fournir des indications précieuses pour la conception et l’interprétation des études sur la force de cisaillement-règlement des canaux ioniques. Selon l’effet numéro de la transport couche limite stationnaire, nous prédisons que les courants des canaux ioniques à travers tous les types de canaux ioniques membranaires peuvent être facilitées par l’écoulement du fluide, indépendamment de leur sensibilité biologique à force de cisaillement du fluide, mais seulement si les canaux ioniques ont suffisamment monocanal conductance et ouvert long-temps. Densités de courant plus élevées ion channel peut augmenter l’effet de la couche limite stationnaire à la surface de la membrane cellulaire.

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Protocole

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de Konkuk University.

1. Agarose sel ponts entre la Solution de bain et l’électrode de référence Ag/AgCl

Remarque : Agarose 3M KCl ponts salins sont produites comme précédemment décrit¹² avec des variations mineures.

1. Formation de ponts
   1. Courber les tubes capillaires de verre feu pour former une U-forme le cas échéant. Le diamètre intérieur des capillaires doit être assez grand pour réduire la résistance série lors de l’enregistrement des courants ioniques grand. Tubes d’un diamètre intérieur de 2 à 5 mm sont généralement acceptables.
2. Préparation de la solution de KCl 3M d’agarose
   1. Préparer 100 mL de solution de KCl 3M (1 M ou 2 M est également acceptable).
   2. Environ 3 g d’agarose.
   3. Dissoudre l’agarose dans 100 mL de KCl (c.-à-d., 3 % d’agarose) sur une plaque chauffante entre 90 et 100 ° C.
3. La passerelle avec 3M KCl agarose d’embarquement
   1. Pour faciliter le chargement, immergez les ponts de verre en forme de U dans la solution de gel d’agarose-KCl.
      Remarque : Il est facile de creuser les ponts de verre si la solution d’agarose-KCl est contenue dans un récipient peu profond et large.
   2. Les garder toute la nuit à température ambiante (RT) pour l’agarose à définir et à durcir.
   3. Déterrer soigneusement les ponts d’agarose-KCl-chargé de verre de la série/durci d’agarose-sel.
4. Stocker les ponts
   1. Préparer assez de volume (p. ex., 500 mL) de la solution de KCl 3M dans une bouteille à col large.
   2. Stockez les ponts d’agarose-sel préparés dans la bouteille au réfrigérateur.

2. application de la Force de cisaillement d’écoulement du fluide aux cellules dans une chambre de serrage Patch

Remarque : Un schéma de l’installation expérimentale de patch clamp est montré dans la Figure 1.

1. Place un conteneur chargé avec solution de baignade (volume et hauteur devraient déjà être mesurés) au-dessus de la chambre de patch clamp.
2. Remplir la chambre de patch clamp avec la solution de trempage par aspiration du tube.
3. Pour arrêter l’écoulement du fluide, couper le tube à côté du conteneur pour bloquer l’écoulement du fluide, puis couper le tube à l’aspiration pour arrêter l’aspiration en même temps. Il s’agit de la condition de contrôle « stationnaire ».
4. Pour appliquer la force de cisaillement d’écoulement du fluide, ouvrir les deux tubes sur les côtés du récipient et d’aspiration en même temps.
5. Avant ou après l’application de la force de cisaillement d’écoulement du fluide à la cellule, mesurer le débit en mL/min.
6. Calculer le débit en mesurant la diminution de volume du liquide pendant une période donnée.
7. Du débit mesuré et de géométrie (structure) de la chambre de bain, la force de cisaillement appliquée à la cellule par l’écoulement du fluide doit être évaluée (voir la section « discussion »).
8. Sinon, pour contrôler la vitesse d’écoulement (pour obtenir la procédure 2,3-2,6), utiliser une pompe à perfusion. Dans ce cas, veillez à assurer une constante plutôt qu’un flux pulsatile.

3. mesurer les changements de potentiel de jonction liquide-métal par l’écoulement du fluide entre Solution bain et électrode de référence Ag/AgCl (Figure 3 a)

1. Utiliser l’électrode Ag/AgCl ou pellet, qui n’existe pas de produits prêts à l’emploi, sans le pont salin d’agarose.
2. Préparer une solution saline normale sel physiologique pour la chambre de bain (p. ex., 143 mM NaCl, KCl, 0,33 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 11 mM D-glucose 5,4 mM ; pH ajusté à 7,4 avec NaOH).
3. Placez une pipette patch contenant une solution de KCl 3M dans la chambre pour réduire au minimum le changement de potentiel de jonction entre la pipette et les solutions de baignade.
4. Difficulté de l’amplificateur de tension-bride pour le mode actuel de la pince ("J’ai = 0 » ou « CC »).
5. Après détruire le potentiel de décalage initial, mesurer les changements de tension induite par différents débits.
6. Pour vérifier que les variations de tension sont des potentiels de jonction liquide/métal, réexaminer l’effet de l’écoulement du fluide sur le potentiel de jonction à l’aide du pont d’agarose-sel entre la solution du bain et électrode Ag/AgCl.

4. experimental Estimation de la Concentration réelle Cl^– dans la couche stationnaire Adjacent à électrode Ag/AgCl dans des conditions statiques (Figure 3 b)

1. Les résultats de l’étape 3, établir les relations de débit potentiel de jonction et estimer la valeur maximale (saturation) de changement potentiel de jonction par le débit de fluide précité.
2. Préparer des solutions de différentes concentrations de Cl (c.-à-d., 50, 99, 147, 195 et 288 mM de NaCl).
3. En changeant le Cl^– concentration dans le liquide du bain, dessiner la relation jonction potentielle-[Cl^–]. Notez que le taux de fluide doit être constante et suffisamment élevé (> 30 mL / min) pour éviter la baisse de concentration de Cl^– à celle de l’électrode de référence Ag/AgCl adjacent.
4. Partir des courbes de deux relation, estimer les variations de concentration de Cl^– depuis le changement de potentiel de jonction mesurée.

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Résultats

Germes entiers dépendants de la tension type L Ca^{2 +} (VDCC_L) courants des canaux ont été enregistrées dans les myocytes artériels mésentérique de rat enzymatiquement dispersés, comme décrit précédemment¹¹. Les myocytes artériels ont été dialysées avec une solution de la pipette Cs-riches dans une configuration de nystatine perforé avec la solution de trempage d’exempt de cations divalents pour faciliter l’écoulement du cou...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer la véritable concentration Cl^– dans la couche stationnaire adjacente à l’électrode de référence Ag/AgCl en déterminant le potentiel de jonction liquide métallique avec une pipette de patch clamp ouvert remplie d’une haute KCl concentration. La variation de concentration Cl^– dans la couche limite peut entraîner un changement de potentiel de jonction lors du passage du statique à des conditions de flux de fluide. Simpl...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08