Измерение концентрации ионов в Unstirred пограничном слое с открытым патч зажим пипетки: последствия управления ионных каналов жидкости потока

Резюме

Mechanosensitive ионные каналы часто изучаются с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим записи. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, итоги по жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным. Здесь мы предлагаем методы для предотвращения и исправления таких ошибок с теоретической основы.

Аннотация

Потока жидкости является важной экологической стимул, который контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатации. Хотя молекулярные механизмы для биологической реакции в жидкости потока/поперечной силы полностью не поняты, жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования может способствовать критически. Таким образом поток жидкости/сдвига силу чувствительности ионных каналов была изучена с помощью метода патча зажим. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, результаты и интерпретации данных может быть ошибочным. Здесь мы представляем экспериментальные и теоретические доказательства для жидкости ошибки, связанные с потоком и предоставляют методы для оценки, предупреждения и исправления этих ошибок. Изменения в стыке потенциальных между Ag/AgCl электрод сравнения и жидкость для купания были измерены с открытым пипетки, заполнены с 3 M KCl. потока жидкости может затем сдвиг потенциал приблизительно 7 mV жидкости/металлические соединения. И наоборот измеряя напряжение сдвига, индуцированный поток жидкости, мы оценили концентрации ионов в unstirred пограничном слое. В статических условиях реальная ионная концентрации, прилегающих к Ag/AgCl ссылка электрода или ионного канала входе на поверхности клеточной мембраны может достигать как низко как примерно 30% в состояние потока. Размещение агарозы 3 M KCl мост между электродом жидкости и ссылка купание может предотвратить эту проблему потенциального перехода перекрестка. Однако эффект unstirred слоя, прилегающих к поверхности клеточной мембраны не может быть исправлена таким образом. Здесь мы предоставляем метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое с открытым патч зажим пипетку, подчеркивая важность использования агарозы соли мост во время учебы жидкости регулирования потока индуцированной ионных токов. Таким образом этот новый подход, который учитывает реальные концентрации ионов в unstirred пограничном слое, может оказаться полезным на экспериментальный дизайн и интерпретации данных, относящиеся к жидкости касательное напряжение регулирования ионных каналов .

Введение

Потока жидкости — важные экологические подсказка, которая контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатацию и жидкости сдвига силы зависимых сосудистой реконструкции и развития^{1,2, 3,4,5}. Хотя молекулярные механизмы биологической реакции на поперечной силы потока жидкости полностью не поняты, считается, что жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования критически может способствовать жидкости потока индуцированной ответы^{5 , 6 , 7 , 8}. Например, активации эндотелиальной внутрь выпрямителя Kir2.1 и Ca^{2 +}-активированные K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) каналы после Ca^{2 +} приток жидкости потока было предложено вносить жидкости поток индуцированной вазодилатация^6,,78. Таким образом, многие каналы иона, особенно механически активированного или - тормозится каналов, были изучены с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим техника^{6,9,10 , 11}. Однако, в зависимости от экспериментальный протокол, выполненных во время фиксации записи, результаты и интерпретации данных о жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным^10,11.

Один источник жидкости потока индуцированной артефактов в патч зажим записи — от перекрестка потенциальных между теплоносителя и ссылка Ag/AgCl электродов¹¹. Считается, что жидкость/металл стыке потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов постоянно как концентрация Cl^– купания жидкости остается неизменной, учитывая химической реакции между купания решения и Ag/AgCl электродов для:

AG + Cl^–↔ AgCl + Электрон (e^–) (уравнение 1)

Однако в случае, где в целом электрохимической реакции между купания решения и ссылка Ag/AgCl электродов (уравнение 1) выполняется слева направо, концентрация Cl^– купания жидкости рядом с Ag/AgCl ссылки электрод (unstirred пограничный слой^12,13,14,15) могут быть намного ниже, чем в основную часть купания решения, если достаточно конвекционный транспорт обеспечивается. Использование старых или неидеальной Ag/AgCl электродов с неадекватным хлорирования Ag может увеличить такой риск. Этот жидкости связанных с потоком артефакт на электрод сравнения, в самом деле, могут быть исключены, просто поместив обычных агарозы солевой мост между купания жидкости и ссылка электрода, так как артефакт основан на изменения в реальном Cl^– концентрация рядом с Ag/AgCl электродов¹¹. Протокол, представленный в настоящем исследовании описывает, как для предотвращения потенциальных изменений связанных с потоком соединения и измерять концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое.

После размещения агарозы KCl мост между купания жидкости и Ag/AgCl электрод сравнения, является другим важным фактором, который следует рассматривать: просто как ссылка Ag/AgCl электродов действует как электрод Cl^– , ионные каналы также может функционировать как ионоселективного электрода. Ситуация unstirred пограничный слой между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка возникает во время движения ионов между внеклеточным и внутриклеточных решения через мембранных ионных каналов. Это означает, что необходимо с осторожностью подходить при интерпретации регулирование ионных каналов потока жидкости. Как указывалось в наших предыдущих исследования¹¹, движение ионов через решения, в котором присутствует электрохимических градиент может происходить через три отдельных механизмов: диффузия, миграция и конвекции, где Диффузия это движение индуцированных градиент концентрации, миграция движение, движимый электрического градиента, и конвекции движения потока жидкости. Среди этих трех транспортных механизмов режим конвекции вносит наиболее движение ионов¹¹ (> 1000 раз больше, чем диффузии или миграции под обычной фиксации параметров). Это формирует теоретические основы, почему Джанкшен потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка может очень под различные статические и жидкости потока условия¹¹.

Согласно гипотезе, предложенных выше, некоторые протекать эффекты потока жидкости на текущий ионного канала может быть выведено из конвективных восстановление реальных ионной концентрации рядом с входной канал на поверхности мембраны (unstirred пограничный слой) ¹⁰. В этом случае жидкости потока индуцированные эффекты у ионных токов канал просто возникли из электрохимических события, не от регулирования ионного канала стробирования. Аналогичная идея было ранее предложено Барри коллег^12,13,14,и¹⁵ на основании строгих теоретических соображений и экспериментальных доказательств, также известный как unstirred слой или номер эффект транспорта. Если некоторые каналы иона имеют достаточно одного канала проводимости и достаточно долго открытым время предоставить достаточные транспортные ставки через каналы (транспорта быстрее в мембранных чем в поверхности unstirred мембраны), пограничный слой эффект может возникнуть . Таким образом конвекции зависимых транспорта может способствовать окончательной жидкости поток индуцированной льгот Ион текущих^{10,12,13,14,15}.

В этом исследовании, мы подчеркиваем важность использования агар или агарозы соли мост во время учебы жидкости поток индуцированной регулирование ионных токов. Мы также предоставляют метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничный слой, прилегающий к Ag/AgCl ссылка электрода и мембранных ионных каналов. Кроме того теоретические интерпретации жидкости модуляции потока индуцированной ионного канала токов (то есть конвекция гипотеза или unstirred слой транспорта номер эффект) могут предоставить ценную информацию для разработки и интерпретации исследований на сдвига силы регулирование ионных каналов. Согласно unstirred пограничного слоя транспорта номер эффект мы прогнозируем, что ионного канала токов через все виды мембранных ионных каналов может быть облегчено потока жидкости, независимо от их биологической чувствительности к поперечной силы потока жидкости, но только, если ионные каналы имеют достаточно одного канала проводимости и долго открытым. Высших плотностях тока ионного канала может увеличить эффект unstirred пограничного слоя на поверхности клеточной мембраны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами институциональных университета Конгук.

1. агарозы соли мосты между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов ссылки

Примечание: Агарозы 3M KCl, соли мостов производится как ранее описанные¹² с небольшими вариациями.

1. Формирование мостов
   1. Согните огонь стеклянные капилляры в форме U-формы при необходимости. Внутренний диаметр капилляров должно быть достаточно большим, для уменьшения сопротивления серии при записи больших ионных токов. Трубы с внутренним диаметром 2-5 мм обычно приемлемо.
2. Приготовление раствора KCl агарозы 3 M
   1. Подготовка 100 мл раствора KCl 3 M (1 М или 2 М также является приемлемым).
   2. Весят 3 g агарозы.
   3. Распустить агарозы в 100 мл хлористого калия (т.е. 3% агарозном) на горячей плите между 90 и 100 ° C.
3. Загрузка мосты с 3 M KCl агарозы
   1. Для простой загрузки, погружайте U-образной стеклянной мостов в агарозном несогретом растворе.
      Примечание: Это просто выкопать стекла мосты, если агарозы несогретом растворе содержится в контейнере мелкой и широкий.
   2. Держите их на ночь при комнатной температуре (RT) для агарозы и затвердеть.
   3. Осторожно выкапывают агарозы KCl загружен стекла мосты от набора/закаленные агарозы соли.
4. Хранение мосты
   1. Подготовить достаточно тома (т.е., 500 мл) раствора KCl 3 M в бутылке широкий шеей.
   2. Храните подготовленный мостов агарозы соли в бутылки в холодильник.

2. применение потока жидкости поперечной силы к ячейкам в камере патч зажима

Примечание: Схема экспериментальной установки патч зажим показан на рисунке 1.

1. Место контейнер загружается с купания решения (объем и высота должна уже быть измерены) выше патч зажим камеры.
2. Заполните-фиксации камеры с купания решения путем аспирации трубки.
3. Чтобы остановить поток жидкости, зажим трубки на стороне контейнера, чтобы блокировать поток жидкости, а затем обрезать трубу на всасывающей стороне прекратить всасывания в то же время. Это условие «стационарных» управления.
4. Чтобы применить потока жидкости поперечной силы, откройте оба трубы на стороне контейнера и всасывания в то же время.
5. До или после применения поперечной силы потока жидкости в ячейку Измерьте скорость потока мл/мин.
6. Вычислить скорость потока путем измерения уменьшение объем жидкости в течение определенного времени.
7. От измеренного расхода и геометрии (структура) купания камере должны оцениваться поперечной силы, примененный к ячейке потоком жидкости (см. раздел "обсуждение").
8. Кроме того чтобы контролировать скорость потока (для шагов 2,3-2,6), используйте перфузионного насоса. В этом случае будьте осторожны для обеспечения постоянной, а не пульсирующего потока.

3. измерение изменений в жидкость металл Junction потенциал потоком жидкости между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов ссылка (Рисунок 3А)

1. Используйте Ag/AgCl электродов или Пелле, который доступен из готовых продуктов, без соли мост агарозы.
2. Подготовьте физиологический физиологической соли купания камеры (например, 143 мм NaCl, 5.4 KCl, 0,33 мм NaH₂PO₄, 5 мм HEPES, MgCl 0,5 мм₂, 1.8 мм CaCl₂, 11 мм D-глюкозы; рН скорректирована до 7,4 с NaOH).
3. Установите патч пипетки, содержащий раствором KCl 3 M в камере для сведения к минимуму потенциальных сдвиг соединения между пипетки и купания решения.
4. Исправить мембраной усилитель в режим текущего зажим («я = 0» или «Копия»).
5. После отменяешь начального смещения потенциал, измерения перепадов напряжения, вызванного различными скорости потока.
6. Чтобы убедиться, что изменения напряжения в жидкости/металлические соединения потенциалов, вновь изучить влияние потока жидкости на стыке потенциал с помощью агарозы солевой мост между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов.

4. экспериментальная оценка концентрации реальных Cl^– в Unstirred слой, прилегающий к Ag/AgCl электродов при статических условиях (рисунок 3B)

1. Из результатов шага 3 привлечь отношения потенциал-расхода Джанкшен и оценить значение максимального (насыщения) потенциального сдвига Джанкшен, скорость потока выше жидкости.
2. Подготовка решений с различных концентраций Cl (то есть, 50, 99, 147, 195 и 288 мм NaCl).
3. Изменив Cl^– концентрация в купать жидкости, нарисуйте [Cl^–] отношения потенциальных - Джанкшен. Обратите внимание, что скорость жидкости должна быть постоянной и достаточно высокой (> 30 мл / мин) для предотвращения снижения концентрации Cl^– со смежными Ag/AgCl электрод сравнения.
4. От отношения двух кривых оцените изменения в концентрации Cl^– от измеренной Джанкшен потенциального сдвига.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Клеточных напряжени тока зависимых L-типа Ca^{2 +} канал (_LVDCC) токи были записаны в ферментативно дисперсной крыса брыжеечных артерий миоцитах, как описано¹¹. Артериальной миоцитов были dialyzed Cs богатые пипеткой раствором под Нистатин перфорированных ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали метод измерения реальной концентрации Cl^– в unstirred слой, прилегающий к Ag/AgCl электродов ссылку путем определения перекрестка жидкости металл потенциал с открытым патч зажим пипетки, заполнены с высокой KCl концентрация. Изменение концентра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08