JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mechanosensitive iyon kanalları kez yama-kelepçe kaydı ile sıvı akışı/makaslama kuvvet duyarlılık açısından incelenmektedir. Ancak, Deneysel protokol bağlı olarak, sonuç sıvı akışı-düzenlemelerin iyon kanalları üzerinde hatalı olabilir. Burada, önlenmesi ve teorik bir temel ile bu tür hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar.

Özet

Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçleri denetleyen önemli bir çevresel uyarıcı olduğunu. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akışı/kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel katkıda bulunabilir. Bu nedenle, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık iyon kanallarının yama-klemp tekniği kullanarak çalışılmıştır. Ancak, sonuçları ve yorumunu veri bağlı olarak Deneysel protokol, hatalı olabilir. Burada, deneysel ve teorik kanıt sıvı akışı ile ilgili hatalar için mevcut ve tahmin etme, önleme ve bu hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar. Junction Ag/AgCl referans elektrot ve banyo sıvı arasında potansiyel değişiklikleri ile 3 M KCl. sıvı akış olabilir dolu bir açık pipet ile ölçüldü sonra sıvı/metal Kavşağı yaklaşık 7 için potansiyel mV vardiya. Diğer taraftan, sıvı akış tarafından indüklenen gerilim shift ölçerek, biz iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabaka içinde tahmini. Statik durumda gerçek iyon konsantrasyonlarının Ag/AgCl referans elektrot veya iyon kanal giriş hücre membran yüzeyinde bitişik olarak yaklaşık % 30 bu akışı koşulu düşük olarak ulaşabilirsiniz. Bir özel 3 M yerleştirerek banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü Kavşağı potansiyel değişen bu sorunu engellemiş olabilir. Ancak, hücre zarının yüzeye bitişik unstirred Katman efektini bu şekilde sabit değil. Burada, biz sıvı akış kaynaklı Yönetmeliğin iyon akıntılarının okurken bir özel tuz-köprü kullanmanın önemini vurgulayan bir açık yama-kelepçe pipet ile unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu nedenle, dikkate unstirred sınır tabaka iyonu gerçek konsantrasyonları alır, bu roman yaklaşım deneysel tasarım ve iyon kanalları sıvı kesme stres düzenlenmesi ile ilgili veri yorumu yararlı bilgiler sağlayabilir .

Giriş

Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon ve sıvı kesme kuvvetleri bağımlı vasküler remodeling ve geliştirme1,2gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler denetleyen önemli bir çevresel işaretimiz, 3,4,5. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akış kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, bu iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel sıvı akış kaynaklı yanıt-e doğru5 ' e katkıda bulunabilir inanılıyor , 6 , 7 , 8. Örneğin, endotel içe doğrultucu Kir2.1 ve Ca2 +aktivasyonu-aktif K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalları Ca2 + akını sıvı akış tarafından sıvı için katkıda bulunmak için önerilen sonra akış kaynaklı vazodilatasyon6,7,8. Bu nedenle, birçok iyon kanalları, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık yama-klemp tekniği6,9,10 ile açısından okudu kanal, özellikle mekanik aktif veya - Inhibe , 11. ancak, yama kayıt tipi kelepçe sırasında gerçekleştirilen Deneysel protokol bağlı olarak sonuçları ve iyon kanallarının sıvı akışı mevzuatı hakkında veri yorumlanması hatalı10,11olabilir.

Bir sıvı akış kaynaklı eserler içinde yama-kelepçe yazmak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot11arasında potansiyel kavşak üzerinden kaynağıdır. Bu genellikle banyo sıvı Cl- konsantrasyonu sabit tutulması gibi sıvı/metal kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl elektrot arasında potansiyel banyo çözüm arasında kimyasal karşılık göz önünde bulundurarak sürekli inanılıyor ve Ag/AgCl elektrot olmak:

AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (denklem 1)

Ancak, Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl bitişik banyo sıvısının nerede genel olarak elektrokimyasal reaksiyon banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot (denklem 1) arasında soldan sağa doğru devam eder bir durumda, başvuru yeterli convectional ulaşım sağlanmaktadır sürece elektrot (unstirred sınır tabaka12,13,14,15) çok bu çözüm, banyo toplu olarak daha düşük olabilir. Ag yetersiz klorlama ile bir eski veya ideal olmayan Ag/AgCl elektrot kullanarak böyle bir risk artabilir. Bu sıvı akışı ile ilgili yapı, referans elektrodu, aslında, sadece banyo sıvı ile başvuru geleneksel bir özel-tuz Köprüsü yanında duvar ilanı hariç olmak objeyi gerçek Cl- içinde değişiklikler temel bu yana elektrot, konsantrasyon Ag/AgCl elektrot11' e bitişik. Bu çalışmada sunulan protokolü bağlantı akışı ile ilgili olası değişiklikleri önlemek ve unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek nasıl açıklar.

Bir özel banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında KCl köprü koyduktan sonra düşünülmesi gereken bir diğer önemli faktör var: sadece referans olarak Ag/AgCl elektrot Cl- elektrot gibi davranır, iyon kanalları da işlev görebilir bir iyon-seçici elektrot gibi. Banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında unstirred bir sınır tabaka durumun iyonların hareketi sırasında membran iyon kanalları yoluyla ekstraselüler ve hücre içi çözüm arasında ortaya çıkar. Bu iyon Yönetmeliği yorumlama tarafından sıvı akış kanalları zaman dikkatli kullanılmalıdır anlamına gelir. Bizim önceki çalışma11' de tartııldıı gibi bir elektrokimyasal gradyan mevcut çözüm iyonların hareketi üç farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir: difüzyon, geçiş ve konveksiyon, difüzyon hareketi nerede konsantrasyon gradyanı tarafından indüklenen, geçiş hareketi elektrik degrade tarafından tahrik olur ve konveksiyon yoluyla sıvı akış hareketidir. Bu üç taşıma mekanizmaları arasında konveksiyon modu çoğu iyonları11 (> 1000 kere difüzyon veya geçiş her zamanki yama-kelepçe ayarlar altında daha büyük) hareketine katkıda bulunur. Neden kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında potansiyel çok farklı statik ve sıvı akış koşulları11altında bu teorik temelini oluşturur.

Yukarıda önerilen hipotez başı olarak, sıvı akış facilitatory bazı etkileri iyon kanal geçerli gerçek iyon konsantrasyonu (unstirred sınır tabaka) membran yüzey kanal girişi için bitişik konvektif restorasyonu dan anlaşılmaktadır 10. Bu durumda, iyon kanal akımları akış kaynaklı sıvı etkisi sadece elektrokimyasal olaylardan değil yönetmelik iyon kanal perdeleme dan çıkmıştır. Benzer bir fikir titiz teorik hususlar ve deneysel kanıt, olarak da bilinen unstirred katman göre Barry ve meslektaşları12,13,14,15 tarafından daha önce önerilen veya taşıma sayı etkisi. Bazı iyon kanalları yeterli varsa tek kanal gürültülerinden ve yeterli taşıma kanallardan (zarda unstirred membran yüzey bir daha hızlı aktarım hızı), bir sınır tabaka etkisi oranları sağlamak için yeterince uzun açık zaman ortaya çıkabilir . Böylece, konveksiyon bağımlı taşıma Ion geçerli10,12,13,14,15nihai sıvı akışı bağlı merkezler için katkıda bulunabilir.

Bu çalışmada, biz bir agar veya özel kullanmanın önemini vurgulamak tuz-köprü sıvı akışı bağlı yönetmelik iyon akıntılarının eğitim sırasında. Biz de unstirred sınır tabaka Ag/AgCl referans elektrot ve membran iyon kanalları için bitişik konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca, sıvı akış kaynaklı modülasyon iyon kanal akımlarının (Yani, konveksiyon hipotez veya unstirred katman taşıma sayı etkisi) teorik yorumlanması tasarlama ve üzerinde çalışmalar yorumlama için değerli bilgiler sağlayabilir kesme kuvvetleri-düzenlenmesi iyon kanalları. Unstirred sınır tabaka taşıma sayı etkisi göre biz iyon kanal akımları yoluyla membran iyon kanalları her türlü akışkan akışı, bağımsız olarak sıvı akış kesme kuvvetleri, ama sadece onların biyolojik duyarlılık tarafından Eğer kolaylaştırılabilir olduğunu tahmin iyon kanalları yeterli tek kanal gürültülerinden ve uzun açık-zaman var. Daha yüksek iyon kanal akım yoğunluğu hücre membran yüzeyinde unstirred sınır tabaka etkisi artabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneyler Konkuk Üniversitesi Kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. özel tuz banyosu çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot arasında köprü

Not: Özel 3M KCl tuz köprüleri daha önce üretilen12 küçük farklılıklar nedeniyle nitelendirdi.

  1. Köprüler oluşumu
    1. U şekli uygun oluşturmak için yangın cam kılcal tüpler viraj. Kılcal iç çapı büyük iyon akımlarını kaydederken serisi direnci azaltmak için yeterince büyük olmalıdır. 2-5 mm bir iç çapı ile tüplerin genellikle kabul edilir.
  2. Özel 3 M KCl çözüm hazırlanması
    1. 100 mL 3 M KCl çözeltisi hazırlamak (1 M veya 2 M da kabul edilir).
    2. Özel 3 g ağırlığında.
    3. 90 ile 100 ° c arasında sıcak tabakta KCl (Yani, % 3 özel) 100 ml özel dağıtılması
  3. Köprüler ile 3 M KCl özel yükleme
    1. Kolay yükleme için U şeklinde cam köprü özel-KCl çözelti içinde bırakın.
      Not: Özel-KCl çözüm sığ ve geniş bir kapta içeriyorsa doğruAksi durumda, cam köprü kazmak kolaydır.
    2. Gece için ayarla ve sertleşmesine özel (RT) Oda sıcaklığında kalsın.
    3. Dikkatle set/sertleştirilmiş özel-tuz özel KCl yüklü cam köprülerden kazmak.
  4. Köprüleri depolamak
    1. Yeterli hacim hazırlamak (Yani, 500 mL) 3 M KCl çözüm geniş boyunlu şişe.
    2. Hazırlanan özel-tuz köprüleri şişe bir buzdolabında saklayın.

2. yama sıkma odası bulunan hücrelere sıvı akış kesme kuvvet uygulanması

Not: Yama-kelepçe deneysel set-up bir Şematik diyagramı Şekil 1' de gösterilen.

  1. Bir konteyner yüklü çözüm banyo ile yer (birim ve yükseklik zaten var olmak ölçü) yama-kelepçe odası yukarıda.
  2. Yama-kelepçe odası tüp suctioning tarafından banyo çözüm ile doldurun.
  3. Sıvı akışını durdurmak için tüp sıvı akışını engellemek için kapsayıcının tarafında küçük, sonra tüp emici aynı zamanda durdurmak için emme tarafında küçük. Bu "sabit" Denetim durumdur.
  4. Sıvı akış kesme kuvvet uygulamak için aynı anda her iki tüpler konteyner ve emme tarafında açık.
  5. Daha önce ya da sıvı akış kesme kuvvetleri hücreye uygulandıktan sonra debi mL/dak ölçmek.
  6. Belirli bir zaman içinde sıvı hacmindeki azalma ölçerek akış oranını hesaplamak.
  7. Ölçülen debi ve banyo odası (yapısı) geometrisini, sıvı akış tarafından hücreye uygulanan kesme Kuvvetleri (tartışma bölümüne bakın) tahmini.
  8. Alternatif olarak, akış hızı (için adımları 2.3-2.6) denetlemek için bir perfüzyon pompa kullanın. Bu durumda, pulsatil bir akış yerine bir sabit emin olmak için dikkatli olun.

3. ölçme likit Metal kavşak potansiyel banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot (Şekil 3A) arasında sıvı akışı tarafından değişimler

  1. Ag/AgCl elektrot veya hazır ürünler, özel tuz Köprüsü olmadan kullanılabilir Pelet kullanın.
  2. Normal bir fizyolojik tuzlu tuz banyo odası (Örneğin, 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11 mM D-glikoz; pH 7.4 NaOH ile düzeltilmiş) için hazır olun.
  3. Bir yama pipet pipet ve banyo çözümleri arasındaki kavşak potansiyel kayma en aza indirmek için odasında 3 M KCl solüsyon içeren yerleştirin.
  4. Geçerli kelepçe moduna gerilim tipi kelepçe amplifikatör tamir ("Ben = 0" veya "Bilgi").
  5. İlk ofset potansiyel bozarak sonra çeşitli akış oranları tarafından indüklenen gerilim içinde değişiklikleri ölçmek.
  6. Voltaj değişiklikleri sıvı/metal kavşak potansiyelleri olduğunu doğrulamak için sıvı akış etkisi kavşak potansiyel banyo çözüm Ag/AgCl elektrot ile özel-tuz Köprüsü kullanarak yeniden inceleyin.

4. deneysel tahmini gerçek Cl- konsantrasyon Unstirred katmanında bitişik Ag/AgCl elektrot altında statik durum (3B rakam)

  1. Adım 3 sonuçlarından kavşak potansiyel debi ilişkileri çizmek ve kavşak potansiyel shift tarafından supra-sıvı akış hızı (doyurarak) en büyük değerini tahmin etmek.
  2. Cl çeşitli konsantrasyonları ile çözümler hazırlamak (yani, 50, 99, 147, 195 ve 288 mM NaCl).
  3. Cl- konsantrasyonu banyo sıvı değiştirerek kavşak potansiyel-[Cl-] ilişki çizin. Sıvı oranı sürekli ve yeterince yüksek olması unutmayın (> 30 mL / Cl- konsantrasyonu bitişik Ag/AgCl referans elektrot olan için azalma önlemek için min).
  4. İki ilişki eğriler Cl- konsantrasyonu ölçülen kavşak potansiyel shift üzerinden değişiklikleri tahmin etmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bütün hücre voltaj bağımlı L tipi Ca2 + kanal (VDCCM) akımları enzimatik dağınık sıçan mezenterik arteryel miyositler, yukarıda açıklanan11kaydedildi. Arteryel miyositler bir çözümle Cs-zengin pipet nistatin delikli yapılandırma altında VDCCL11,16ile geçerli akışı kolaylaştırmak için divalent katyon ücretsiz banyo solüsyonu ile diyaliz. Gerilim...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, biz gerçek Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl referans elektrot için bitişik unstirred katmanındaki bir yüksek KCl ile dolu bir açık yama-kelepçe pipet ile likit metal kavşak potansiyel belirlenerek ölçmek için bir yöntem gösterdi konsantrasyon. Sınır tabaka Cl- konsantrasyon değişikliği kavşak potansiyel bir vardiyada statik sıvı akış koşulları için geçiş yaparken neden olabilir. Sadece bir özel banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü kullanara...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma öncü araştırma merkezi programı (2011-0027921), tarafından temel bilim araştırma programlarını (2015R1C1A1A02036887 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1A2B4014795) Ulusal Araştırma Vakfı Bilim Bakanlığı tarafından ICT finanse Kore tarafından desteklenmiştir & Gelecek planlama ve Kore sağlık teknoloji R & D proje Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla verilmesi tarafından finanse edilen Sağlık Bakanlığı & refah, Kore Cumhuriyeti (HI15C1540) tarafından.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RC-11 open bath chamberWarner instruments, USAW4 64-0307
Ag/AgCl electrode pelletWorld Precision Instruments, USAEP1
AgaroseSigma-aldrich, USAA9793
Voltage-clamp amplifierHEKA, GermanyEPC8
Voltage-clamp amplifierMolecular Devices, USAAxopatch 200B
Liquid pumpKNF Flodos, SwitzerlandFEM08

Referanslar

  1. Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
  2. Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
  3. Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
  4. Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
  5. Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
  6. Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  7. Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
  8. Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
  9. Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
  10. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585(2016).
  11. Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
  12. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
  13. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
  14. Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
  15. Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
  16. Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
  17. A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
  18. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
  19. Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 143s v akkesme kuvvetleriunstirred katmanyama kelep eAg AgCl referans elektrots v metal kav ak potansiyelikonveksiyoniyon kanal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır