오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름

요약

Mechanosensitive 이온 채널은 종종 패치 클램프 기록 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 공부 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 이온 채널의 유체 흐름 규정에 결과 잘못 된 수 있습니다. 여기, 우리는 방지 하 고 이론적 근거와 이러한 오류에 대 한 메서드를 제공 합니다.

초록

유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 등 많은 생리와 병리학 과정을 제어 하는 중요 한 환경 자극. 유체 흐름/전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규정은 비판적으로 기여할 수 있습니다. 따라서, 이온 채널의 유체 흐름/전단 힘 감도 패치 클램프 기술을 사용 하 여 공부 되었습니다 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 결과 및 해석 데이터의 수 잘못 된. 우리가 유체 흐름 관련 오류에 대 한 실험 및 이론적인 증거를 제시 하는 여기, 예측, 예방, 및 이러한 오류를 수정에 대 한 메서드를 제공 하 고. Ag/AgCl 기준 전극과 입욕 액체 사이 잠재적인 연결에 변화 3 M KCl. 유체 흐름 수 가득한 오픈 피 펫으로 측정 되었다 다음 액체/금속 접합 약 7 잠재적인 뮤직 비디오를 이동 합니다. 반대로, 유체 흐름에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 하 여 우리 unstirred 경계 층의 이온 농도 추정. 정적 상태에서 실제 이온 농도 Ag/AgCl 기준 전극 또는 이온 채널 인렛에 세포 막 표면에 인접 한 낮은 흐름 상태에서의 30%로 약으로 도달할 수 있습니다. 배치는 agarose 3 M KCl 다리 입욕 및 참조 전극 사이 접합 잠재적인 이동의이 문제를 방지 할 수 있습니다. 그러나, unstirred 레이어 효과 세포 막 표면에 인접 한이 방법으로 해결할 수 없습니다. 여기, 우리는 이온 전류의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 agarose 소금 브리지를 사용 하 여의 중요성을 강조 오픈 패치 클램프 피 펫과 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 따라서, unstirred 경계 층에 이온의 실제 농도 고려이 새로운 접근 방식을 실험 설계 및 이온 채널의 유체 전단 응력 규제 관련 데이터 해석에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다. .

서문

유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 및 유체 전단 힘 종속 혈관 개장 및 개발^1,2,^{등 많은 생리와 병 적인 프로세스를 제어 하는 중요 한 환경 큐 3,,45}. 유체 흐름 전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규칙 유체 흐름 유도 응답⁵ 비판적으로 기여할 수 있다고 믿고 ^{, 6 , 7 , 8}. 내 피 안쪽 정류기 Kir2.1 및 캘리포니아^{2 +}의 예를 들어 활성화-활성화 된 K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) 채널 Ca^{2 +} 유입 유체 흐름에 의해 액체에 기여할 제안 되었습니다 후 흐름 유도 혈관^6,,78. 따라서, 많은 이온 채널, 특히 기계적으로 활성화 또는-저해 채널, 패치 클램프 기술^6,,910 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 연구 ^{, 그러나 11}., 수에 따라 실험 프로토콜 패치 클램프 기록 동안 수행, 결과 및 유체 흐름-이온 채널의 규정에 있는 데이터의 해석 잘못^10,11.

유체 흐름 유도 아티팩트 패치 클램프 기록에의 한 소스는 목욕 및 Ag/AgCl 기준 전극¹¹사이 잠재적인 교차점에서 이다. 그것은 일반적으로 믿고 그 입욕 액체와 Ag/AgCl 전극 사이 잠재적인 액체/금속 접합 일정 입욕 액체의 Cl^- 농도 일정 유지는 입욕 솔루션 사이의 화학 반응 고려 그리고 되도록 Ag/AgCl 전극:

Ag + Cl^-↔ AgCl + 전자 (e^-) (공식 1)

그러나, 입욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 (공식 1) 사이 전반적인 전기 화학 반응 왼쪽에서 오른쪽으로 진행 하는 경우, Ag/AgCl에 인접 한 입욕 액체의 Cl^- 농도 참조 충분 한 convectional 전송 보장 하지 않는 한 전극 (unstirred 경계 층^12,13,,1415) 솔루션, 목욕의 대부분에서 그 보다 훨씬 낮은 수 있습니다. 이전 또는 비 이상적 Ag/AgCl 전극 Ag의 부적당 한 염소와 함께 사용 하 여 이러한 위험을 증가할 수 있습니다. 이 유체 흐름 관련 아티팩트 참조 전극, 사실,에서 단순히 입욕 액체 및 참조 사이 기존의 agarose 소금 다리를 배치 하 여 제외할 수 있습니다 전극, 유물 진짜 Cl^- 에서 변경에 기반 Ag/AgCl 전극¹¹에 인접 한 농도. 이 연구에서 제시 하는 프로토콜 흐름 관련 접합 잠재적인 변화를 방지 하 고 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하는 방법을 설명 합니다.

Agarose KCl 입욕 액체 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이 다리를 놓은 후 고려해 야 하는 또 다른 중요 한 요소 이다: 참조로 그냥 Ag/AgCl 전극 역할 Cl^- 전극, 이온 채널 또한 기능을 할 수 같은 이온 선택적인 전극. 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 unstirred 경계 층의 상황 막 이온 채널을 통해 세포 외 및 세포내 솔루션 사이 이온의 운동을 하는 동안 발생합니다. 이 유체 흐름에 의해 채널 이온의 규정을 해석 하는 때 주의 사용 해야 함을 의미 합니다. 우리의 이전 연구¹¹에서 설명 했 듯이, 전기 화학 기온 변화도 존재 하는 솔루션을 통해 이온의 운동 3 가지 메커니즘을 통해 발생할 수 있습니다: 확산, 마이그레이션, 및 대류, 어디 확산 운동 이다 농도 기온 변화도 의해 유도 된 마이그레이션 전기 기온 변화도 의해 구동 하는 운동 이며 대류 유체 흐름을 통해 운동 이다. 이러한 세 가지 전송 메커니즘 가운데 대류 모드 대부분 이온¹¹ (> 1000 번 유포 또는 일반적인 패치 클램프 설정 마이그레이션 보다)의 운동에 공헌 한다. 이 왜 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 잠재적인 연결 수 매우 다른 정적 및 유체 흐름 조건¹¹의 이론적인 기초를 형성 합니다.

위에서 제안 된 가설에 의하여 현재 이온 채널에 유체 흐름의 어떤 facilitatory 효과 진짜 이온 농도 막 표면 (unstirred 경계 층)에 채널 입구에 인접 한의 대류 복원에서 유추 될 수 ¹⁰.이 경우에, 이온 채널 전류에 대 한 유체 흐름 유도 효과 단순히 발현 이온 채널 게이팅의 규제 안에서 전기 이벤트에서. 비슷한 생각 이전 배리와 동료^12,13,,1415 엄격한 이론적인 고려 사항 및 실험적 증거, 일컬어 unstirred 층에 따라 의해 제안 되었다 또는 전송 번호 효과입니다. 단일 채널 전도도 충분 한 전송 채널 (unstirred 멤브레인 표면에 보다 막에서 빠른 전송 속도), 속도 경계층 효과 제공 하기 위해 충분히 오픈 시간 발생할 수 있습니다 일부 이온 채널 충분 한 경우 . 따라서, 대류 종속 전송 최종 유체 흐름 유도 자와 이온 현재^{10,12,13,,1415}에 기여할 수 있다.

우리는 한 천 또는 agarose를 사용 하 여의 중요성을 강조 하는이 연구에서 이온의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 소금 브리지. 우리는 또한 Ag/AgCl 기준 전극 및 막 이온 채널에 인접 한 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 또한, 이온 채널 전류 (즉, 대류 가설 또는 unstirred 층 전송 번호 효과)의 유체 흐름을 이용한 변조의 이론적 해석 설계 하 고 해석 하는 연구에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전단 힘-규칙 이온 채널의. 우리 경우 이온 채널 전류 막 이온 채널의 모든 종류를 통해 유체 흐름, 유체 흐름 전단 힘만을 그들의 생물 학적 감도의 독립에 의해 촉진 될 수 있다 예측 unstirred 경계 층 전송 번호 효과 따라 이온 채널 충분 한 단일 채널 전도도 긴 오픈-시간이 있다. 높은 이온 채널 전류 밀도 세포 막 표면에 unstirred 경계층 효과 높일 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 건국대의 기관 지침에 따라 수행 했다.

1. Agarose 소금 교량 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이

참고: Agarose 3m KCl 염 다리 이전 생산¹² 사소한 변형을 설명 합니다.

1. 다리의 형성
   1. 적절 한 U 자형을 형성 화재 유리 모 세관 튜브 벤드. 모세 혈관의 내경 큰 이온 전류를 기록할 때 직렬 저항을 줄이기 위한 충분히 큰 해야 합니다. 2-5 m m 내부 직경 튜브는 일반적으로 허용 됩니다.
2. Agarose 3m KCl 솔루션의 준비
   1. 100 mL 3 M KCl 해결책의 준비 (1 또는 2 M 하 셔도 됩니다).
   2. Agarose의 3 g의 무게.
   3. 90와 100 ° C 사이 뜨거운 접시에 KCl (즉, 3 %agarose) 100 mL에 agarose를 녹
3. 3m KCl agarose와 브리지 로드
   1. 쉽게 로드 agarose KCl 해결책에 U 자 모양의 유리 다리를 담가.
      참고: 그것은 agarose KCl 솔루션 얕 고 넓은 컨테이너에 포함 되어 있으면 유리 다리를 찾아 쉽습니다.
   2. 하룻밤 실 온 (RT) agarose 설정 및 강화를 위한 계속 그들.
   3. Agarose KCl 로드 유리 다리 세트/강화 agarose-소금에서 신중 하 게 찾아.
4. 다리를 저장
   1. 준비 하는 충분 한 볼륨 (즉, 500ml) 넓은 센 병에 3 M KCl 해결책의.
   2. 냉장고에 있는 병에 준비한 agarose 소금 다리를 저장 합니다.

2. 셀 패치 클램핑 챔버에 유체 흐름 전단 력의 응용

참고: 패치 클램프 실험 설정의 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

1. 장소 컨테이너 로드 목욕 솔루션 (볼륨 및 높이 측정 해야 합니다 이미) 패치 클램프 챔버 위에.
2. 튜브를 suctioning 여 입욕 솔루션 패치 클램프 챔버를 채우십시오.
3. 유체 흐름을 중지, 유체 흐름을 차단 하도록 컨테이너의 측면에서 튜브 클립 다음 중지 동시에 흡입 하는 흡입 쪽에 튜브를 클립 합니다. 이것은 "고정" 제어 상태 이다.
4. 유체 흐름 전단 힘을 적용 하기 위해 동시에 컨테이너와 흡입 측에 두 튜브를 엽니다.
5. 전에 또는 유체 흐름 전단 힘 셀에 적용 한 후, mL/min의 유량을 측정 합니다.
6. 주어진된 시간 동안 유체 볼륨에서 감소를 측정 하 여 유량을 계산 합니다.
7. 측정 된 유량과 입욕 챔버의 형상 (구조)에서 유체 흐름에 의해 셀에 적용 되는 전단 힘 (토론 섹션 참조) 추정 한다.
8. 또는, (단계 2.3-2.6)에 대 한 유량 제어, 관류 펌프를 사용 합니다. 이 경우에 상수 타악기 흐름 보다는 되도록 주의 해야 합니다.

3. 목욕 솔루션 및 (그림 3A) Ag/AgCl 기준 전극 사이의 유체 흐름에 의해 액체 금속 접합 잠재력에 변화를 측정

1. Ag/AgCl 전극 또는 펠 릿, agarose 소금 다리 없이 기성 품 제품에서 사용할 수 있는 사용 합니다.
2. (예를 들어, 143 m m NaCl, 5.4 m m KCl, 0.33 m m NaH₂포₄, 5 mM HEPES, 0.5 m m MgCl₂, 1.8 m m CaCl₂, 11 m m D-포도 당, pH 7.4 NaOH로 조정) 입욕 약 실에 대 한 일반적인 생리 소금 염 분을 준비 합니다.
3. 피 펫 및 입욕 솔루션 사이 접합 잠재적인 변화를 최소화 하기 위해 챔버에 3m KCl 솔루션을 포함 하는 패치 피 펫을 놓습니다.
4. 전압 클램프 증폭기 전류 클램프 모드를 수정 ("I = 0" 또는 "참조").
5. 초기 오프셋된 잠재력을 nullifying, 후 다양 한 유량에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 합니다.
6. 전압 변화 액체/금속 접합 잠재력을 확인, 다시 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 전극 사이 agarose 소금 다리를 사용 하 여 접합 잠재력에 유체 흐름의 효과 검사 합니다.

4. 실험 Unstirred 층 (그림 3B) 정적 조건 Ag/AgCl 전극에 인접 한에서 진짜 Cl^- 농도 추정

1. 3 단계의 결과에서 접합 잠재력-유량 관계 그리고 위에 유체 흐름 속도 의해 접합 잠재적인 변화의 최대한 (채도) 값을 추정.
2. Cl의 다양 한 농도와 솔루션 준비 (즉, 50, 99, 147, 195, 및 NaCl의 288 m m).
3. Cl^- 입욕 액체의 농도 변경 하 여 접합 잠재적인-[Cl^-] 관계를 그립니다. 일정 하 고 충분히 높은 유체 속도 수 한다 (> 30 mL/min) 인접 한 Ag/AgCl 기준 전극의 Cl^- 농도의 감소를 방지 하기 위해.
4. 두 관계 곡선에서 측정 된 접합 잠재적인 변화에서 Cl^- 농도 변화 예상.

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결과

전체 셀 전압 종속 L 유형 캘리포니아^{2 +} 채널 (VDCC_L) 전류는 앞에서 설명한¹¹로 효소 분산된 쥐 mesenteric 동맥 myocytes에 기록 되었다. 동맥 myocytes divalent 양이온 무료 입욕 솔루션 VDCC_L^11,16을 통해 현재의 흐름을 촉진 하기 위하여 nystatin 천공 구성에서 Cs 풍부한 피 펫 솔루션 dialyzed 했다. Depo...

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토론

이 연구에서 우리는 오픈 패치 클램프 피 펫이 높은 KCl로 가득와 잠재적인 액체 금속 접합을 결정 하 여 Ag/AgCl 기준 전극에 인접 한 unstirred 층에 진짜 Cl^- 농도 측정 하는 방법을 시연 농도입니다. 경계 층에 Cl^- 농도 변화 접합 잠재력의 변화 유체 흐름 조건에 정적에서 전환할 때 발생할 수 있습니다. 단순히 참조 전극과 입욕 액체 사이 KCl 다리는 agarose를 사용 하 여 패치 클램프 기?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08