Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Resumo

Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.

Resumo

Fluxo de fluido é um importante estímulo ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo fluido/não são totalmente compreendidos, fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon pode contribuir criticamente. Portanto, sensibilidade de força fluido fluxo/tesoura de canais iônicos tem sido estudada usando a técnica patch-clamp. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados e a interpretação dos dados podem ser errôneas. Aqui, apresentamos a evidência experimental e teórica para erros relacionados ao fluxo fluidos e fornecer métodos para estimar, prevenindo e corrigindo esses erros. Alterações na junção potencial entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foram medidas com uma pipeta aberta cheia de 3 M KCl. escoamento de fluidos pode, em seguida, deslocar o mV de potencial de aproximadamente 7 junção metal líquido. Por outro lado, medindo-se a mudança de tensão induzida pelo fluxo de fluido, estimamos a concentração do íon na camada limite unstirred. Na condição estática, as concentrações de íon real adjacentes para a entrada do canal eletrodo ou íon da referência do Ag/AgCl na superfície da membrana celular podem chegar tão baixo como aproximadamente 30% do que na condição de fluxo. Colocando um agarose 3M ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e fluido banho pode ter evitado este problema de deslocamento potencial de junção. No entanto, o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular não poderia ser fixado desta forma. Aqui, nós fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta, enfatizando a importância do uso de um sal de agarose-ponte enquanto estudava fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes de íon. Portanto, esta nova abordagem, que leva em consideração a concentração real de íons na camada limite unstirred, pode fornecer uma visão útil no delineamento experimental e interpretação de dados relacionados ao regulamento de tensão de cisalhamento fluido de canais iônicos .

Introdução

Fluxo de fluido é uma importante sinalização ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido e fluido cisalhamento força dependente vascular remodelação e desenvolvimento^{1,2, 3,4,5}. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo de fluido não são totalmente compreendidos, acredita-se que o fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon criticamente pode contribuir para respostas induzidas pelo fluxo fluido^{5 , 6 , 7 , 8}. por exemplo, a ativação do retificador endotelial para dentro Kir2.1 e Ca^{2 +}-ativado K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) canais depois de Ca^{2 +} influxo pelo fluxo de fluido tem sido sugerido para contribuir ao fluido vasodilatação induzida pelo fluxo^6,7,8. Portanto, muitos canais iônicos, canais especialmente ativado mecanicamente ou - inibidas, têm sido estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com o remendo-braçadeira técnica^{6,9,10 , 11}. no entanto, dependendo do protocolo experimental realizado durante a gravação da remendo-braçadeira, resultados e interpretação dos dados sobre o fluxo de fluido-regulamentos de canais iônicos podem ser errônea^10,11.

Uma fonte de fluido induzida por fluxo artefatos em gravação de remendo-braçadeira é de potencial entre o fluido de banho e de eletrodo de referência Ag/AgCl¹¹da junção. Geralmente acredita-se que a junção de metal líquido potencial entre o banho fluido e o eletrodo de Ag/AgCl é constante como a concentração de Cl^– do banho líquido é mantida constante, considerando a resposta química entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl para ser:

AG + Cl^–↔ AgCl + elétron (e^–) (equação 1)

No entanto, em um caso onde a reação global eletroquímica entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (equação 1) procede da esquerda para a direita, a concentração de Cl^– do banho fluido adjacente para o Ag/AgCl referência eletrodo (camada de limite unstirred^12,13,14,15) pode ser muito menor do que a granel de banhar a solução, a não ser suficiente convecçao transporte é assegurada. Usar um eletrodo de Ag/AgCl velho ou não-ideal com cloração inadequada do Ag pode aumentar esse risco. Este artefato relacionados ao fluxo de fluido para o eletrodo de referência, na verdade, pode ser excluído, simplesmente colocando uma ponte de agarose-sal convencional entre o banho fluido e referência eletrodo, desde que o artefato é baseado em alterações na real Cl^– concentração adjacente para o eletrodo de Ag/AgCl¹¹. O protocolo apresentado neste estudo descreve como impedir que as alterações de potencial de junção de fluxo-relacionados e medir as concentrações de íon real na camada limite unstirred.

Depois de colocar um ponte de KCl entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl de agarose, há outro fator crucial que deve ser considerado: apenas como referência o eletrodo de Ag/AgCl atua como um eletrodo de Cl^– , os canais iônicos também podem funcionar como um eletrodo íon-seletivo. A situação de uma camada de limite unstirred entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl surge durante o movimento de íons entre as soluções extracelulares e intracelulares através dos canais de íon de membrana. Isto implica que o cuidado deve ser usado quando interpretar o Regulamento do íon canais pelo fluxo de fluido. Conforme discutido no estudo anterior¹¹, o movimento de íons através de uma solução em que se encontra um gradiente electroquímico pode ocorrer através de três mecanismos distintos: difusão e convecção, onde a difusão é o movimento de migração induzida pelo gradiente de concentração, a migração é o movimento impulsionado pelo gradiente elétrico e convecção é o movimento através de fluxo de fluido. Entre esses mecanismos de três transporte, modo convecção contribui mais para o movimento de íons¹¹ (> 1.000 vezes maiores do que a difusão ou migração sob configurações do remendo-braçadeira habitual). Isto constitui a base teórica por potenciais entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl junção pode muito sob diferentes condições estáticas e fluxo de fluido¹¹.

Conforme a hipótese acima proposta, alguns efeitos facilitatórios do fluxo do fluido no canal iônico atual podem ser inferidos a partir da restauração convectiva das concentrações do íon real adjacentes à entrada do canal, na superfície da membrana (camada de limite unstirred) ¹⁰. neste caso, os efeitos de induzida pelo fluxo de fluido em correntes do canal de íon simplesmente surgiram de eventos eletroquímicos, não do Regulamento de retenção de canal de íon. Uma ideia semelhante foi anteriormente sugerida por Barry e colegas^12,13,14,15 com base em Considerações teóricas rigorosas e evidência experimental, também conhecida como a camada de unstirred ou efeito do número de transportes. Se alguns canais de íon tem suficiente condutância de canal único e bastante aberto-tempo para fornecer taxas de transporte suficiente através dos canais (um ritmo mais rápido transporte na membrana do que na superfície da membrana unstirred), um efeito de camada limite podem surgir . Assim, o transporte de convecção-dependente pode contribuir para as eventuais facilitações fluido fluxo-induzida do íon atual^{10,12,13,14,15}.

Neste estudo, enfatizamos a importância de usar um ágar ou agarose sal-ponte enquanto estudava fluido fluxo-induzida pelo Regulamento das correntes de íon. Nós também fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred adjacente para os canais de íon da eletrodo e membrana da referência do Ag/AgCl. Além disso, a interpretação teórica do fluido modulação induzida pelo fluxo das correntes do canal de íon (ou seja, a hipótese de convecção ou camada unstirred transporte número efeito) pode fornecer informações valiosas para a concepção e interpretação de estudos sobre o cisalhamento força-regulamento de canais iônicos. De acordo com o efeito de número de transporte camada de limite unstirred, prevemos que as correntes de canal de iões através de todos os tipos de canais iônicos de membrana podem ser facilitadas pelo fluxo de fluido, independente de sua sensibilidade biológica à força de cisalhamento fluxo fluido, mas somente se os canais de íon tem suficiente condutância de canal único e aberto-tempo. Maiores densidades de corrente de canal de íon pode aumentar o efeito unstirred da camada limite na superfície da membrana celular.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da Universidade de Konkuk.

1. Agarose pontes de sal entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl

Nota: Agarose 3M KCl pontes de sal são produzidos como anteriormente descrito¹² com pequenas variações.

1. Formação de pontes
   1. Dobre os tubos capilares de vidro de fogo para formar uma U-forma conforme apropriado. O diâmetro interno dos capilares deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência série, durante a gravação de correntes grandes do íon. Tubos de 2 a 5 mm de diâmetro interno são geralmente aceitáveis.
2. Preparação da solução de KCl 3M agarose
   1. Preparar 100 mL de solução de KCl 3M (1 M ou 2 M também é aceitável).
   2. Pese 3 g de agarose.
   3. Dissolver o agarose em 100 mL de KCl (ou seja, 3% agarose) sobre uma chapa quente entre 90 e 100 ° C.
3. Carregando as pontes com agarose de KCl 3M
   1. Para facilitar o carregamento, mergulhe as pontes de vidro em forma de U na solução de agarose-KCl.
      Nota: É fácil de escavar as pontes de vidro, se a solução de agarose-KCl está contida em um recipiente raso e amplo.
   2. Mantê-los durante a noite em temperatura ambiente (RT) para a agarose definir e endurecer.
   3. Cuidadosamente Escave para fora as pontes de vidro de agarose-KCl-carregado do conjunto/endurecido agarose-sal.
4. Armazenar as pontes
   1. Prepare-se volume suficiente (ou seja, 500 mL) da solução KCl 3M em uma todo o gargalo da garrafa.
   2. Armazene as pontes de sal-agarose preparadas o frasco no frigorífico.

2. a aplicação da força de cisalhamento do fluxo de fluido para células em uma câmara de Patch-aperto

Nota: Um diagrama esquemático da montagem da experiência da remendo-braçadeira é mostrado na Figura 1.

1. Lugar de um contêiner carregado com solução de banho (volume e altura já devem ser medidos) acima da câmara de remendo-braçadeira.
2. Encha a câmara de remendo-braçadeira com a solução de banho por aspiração do tubo.
3. Para parar o fluxo de fluido, cortar o tubo no lado do contêiner para bloquear o fluxo de fluido e, em seguida, cortar o tubo no lado da aspiração para parar a sucção ao mesmo tempo. Esta é a condição do controlo "estacionário".
4. Para aplicar a força de cisalhamento do fluxo fluido, abra ambos os tubos dos lados do recipiente e sucção ao mesmo tempo.
5. Antes ou depois de aplicar a força de cisalhamento do fluxo de fluido para a célula, medir a taxa de fluxo em mL/min.
6. Calcule a taxa de fluxo, medindo-se a diminuição do volume de fluido ao longo de um determinado momento.
7. Da taxa de fluxo medido e geometria (estrutura) da câmara de tomar banho, a força de cisalhamento aplicada à célula pelo fluxo do fluido deve ser estimada (consulte a seção de discussão).
8. Como alternativa, para controlar a taxa de fluxo (para etapas 2.3-2.6), use uma bomba de perfusão. Neste caso, tenha cuidado para garantir uma constante, em vez de um fluxo pulsátil.

3. medir mudanças no potencial de junção Metal líquido pelo fluxo de fluido entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (Figura 3A)

1. Use o eletrodo de Ag/AgCl ou pellet, que está disponível a partir de produtos pré-fabricados, sem a ponte de sal de agarose.
2. Prepare uma solução salina sal fisiológica normal para a câmara de banho (por exemplo, 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH₂PO₄, 5mm HEPES, 0.5 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 11mm D-glicose; pH ajustado para 7,4 com NaOH).
3. Coloque uma pipeta de patch, que contém uma solução de KCl 3M na câmara para minimizar a mudança de potencial de junção entre a pipeta e soluções de banho.
4. Corrigir o amplificador de tensão-braçadeira para o atual modo de grampo ("eu = 0" ou "CC").
5. Depois de anular o potencial de deslocamento inicial, medir as mudanças na tensão induzida por várias taxas de fluxo.
6. Para verificar se as alterações na tensão são potenciais de junção do metal líquido, re-examine o efeito do fluxo de fluido sobre o potencial de junção usando a ponte de agarose-sal entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl.

4. experimental estimativa da concentração Real Cl^– na camada Unstirred adjacente ao eletrodo de Ag/AgCl sob condição estática (Figura 3B)

1. Os resultados da etapa 3, desenhar as relações de taxa de fluxo de potencial de junção e estimar o valor máximo (saturação) do potencial mudança de junção pela taxa de fluxo de fluido supra.
2. Preparar soluções com diferentes concentrações de Cl (i.e., 50, 99, 147, 195 e 288 mM de NaCl).
3. Alterando o Cl^– concentração no fluido balneares, desenhe a junção potencial [Cl^–] relação. Note que a taxa de fluido deve ser constante e suficientemente alta (> 30 mL / min) para evitar a diminuição da concentração de Cl^– , para que o eletrodo de referência Ag/AgCl adjacentes.
4. De curvas de dois relação, estime as mudanças na concentração de Cl^– a partir da mudança de potencial de junção medido.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Toda célula dependentes de voltagem Ca L-tipo^{2 +} canal (VDCC_L) correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos miócitos de arterial mesentérica, como descrito anteriormente,¹¹. Os miócitos arteriais foram diálise com uma solução de pipeta Cs-rica sob a configuração de nistatina perfurado com solução de banho livre de cátion divalente, para facilitar o fluxo de corrente através de de^11,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Neste estudo, temos demonstrado um método para medir a concentração de Cl^– real na camada unstirred adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl, determinando a potencial de junção metal líquido com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta preenchida com um alto KCl concentração. A mudança na concentração de Cl^– na camada limite pode resultar em uma mudança de potencial de junção quando mudar de estática para condições de fluxo de fluido. Simplesmente usar um ponte de KCl en...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08