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Resumen

Presentamos aquí protocolos de aislamiento de alto rendimiento de tilacoides fisiológicamente activos y análisis de transporte de proteínas para el cloroplasto doble arginina desplazamiento (cpTat), secretoras (cpSec1) y vías de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal.

Resumen

Cloroplastos son los organelos en las plantas verdes encargadas de numerosas vías metabólicas esenciales, principalmente la fotosíntesis. Dentro de los cloroplastos, el sistema de membranas del thylakoid alberga todos los pigmentos fotosintéticos, complejos de centro de reacción y la mayoría de los portadores del electrón y es responsable de la síntesis de ATP dependiente de la luz. Más del 90% de las proteínas del cloroplasto son codificado en el núcleo, traducido en el citosol y posteriormente importado en el cloroplasto. Transporte de proteína posterior en o a través de la membrana del thylakoid utiliza uno de cuatro vías de desplazamiento. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el aislamiento de transporte competentes tilacoides de guisantes (Pisum sativum), junto con ensayos de transporte a través de las tres dependientes de la energía cpTat, cpSec1 y las vías mediada por cpSRP. Estos métodos permiten experimentos relativos a la localización de la proteína de tilacoides, energética del transporte y los mecanismos de translocación de la proteína a través de las membranas biológicas.

Introducción

Casi toda la maquinaria proteica responsable de cloroplasto adecuada función debe translocado desde el citosol1. En los sobres de cloroplasto, sustratos de proteína son importados a través del translocon de la membrana externa (TOC) y el translocon del membrana interna (TIC)2. Mayor orientación a los tilacoides membrana y lumen se produce a través de la doble arginina desplazamiento (cpTat)3, los secretores (cpSec1)4, el de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal5y las vías de inserción espontánea6 . Un método para el aislamiento de alto rendimiento de cloroplastos fisiológicamente activos y tilacoides es necesario medir la energía y cinética de un evento de desplazamiento, para comprender los mecanismos de transporte diferentes en cada itinerario y para localizar un sustrato de proteína particular de interés para cualquiera de los seis distintos compartimentos del cloroplasto.

El aislamiento de las membranas del cloroplasto ofrece mejor control experimental de factores ambientales (como las concentraciones de sal y el sustrato, la presencia de ATP/GTP y las condiciones de pH) que afectan la medición de la energía de transporte y cinética. Este entorno en vitro se presta a la exploración de los detalles mecanicistas de desplazamiento por las mismas razones. Además, aunque software predictivo para la localización de las proteínas del cloroplasto ha mejorado7,8, en vitro ensayos de transporte proporcionan un método más rápido para la confirmación sobre ensayos de microscopia fluorescentes requieren una etiqueta fluorescente genéticamente codificada, planta de transformación o anticuerpos específicos. Aquí, presentamos protocolos para aislamientos cloroplasto y tilacoides de guisantes (Pisum sativum), así como para ensayos de transporte optimizados para cada una de las vías de desplazamiento de tilacoides dependiente de energía.

Protocolo

1. iniciales materiales

  1. Remoje aproximadamente 55 g de guisantes durante 3 horas en 400 mL de agua destilada y luego, siembre en una bandeja de plástico (35 cm x 20 cm x 6 cm) en el suelo cubierto con fina capa de vermiculita.
  2. Crecer la bandeja de guisantes a 20 ° C bajo ciclo de 12/12 h luz/oscuridad (µE/m2s 50) de 9 a 15 días.
  3. Preparar el sustrato de la proteína según un método preferido.
    Nota: Hemos preparado sustratos de proteína usando una variedad de métodos, incluyendo 1) transcripción en vitro de plásmidos purificados seguido de traducción utilizando extractos de germen de trigo o lisados de reticulocitos de conejo en presencia de [3H]-leucina o [35S]-metionina, 2) en vitro traducción usando un kit de traducción/transcripción acoplado como el TnT kits de Promega, con radiolabeling como el anterior y 3) purificación de la proteína sobreexpresada en e. coli. Radiactivos en vitro traducción productos están generalmente apagados con 50 mM aminoácido frío antes de usarlo en las reacciones de transporte. En general, cada uno de estos métodos requiere alguna optimización para cada nuevo substrato de la proteína. Un ejemplo de un sistema acoplado en vitro , vea Ling y Jarvis (2016)9.

2. cloroplasto aislamiento y cuantificación

Nota: El primer paso en la preparación de tilacoides es el aislamiento de cloroplastos intactos10. Todos los materiales deben mantenerse frío durante la preparación. Resuspensión de cloroplastos debe manipularse suavemente, como fractura en este paso puede limitar gravemente rendimiento subsecuente tilacoides.

  1. Preparar después de soluciones previamente.
    1. 2 x Buffer pulido (2xGB): 100 mM HEPES K de pH 7.3, sorbitol de 660 mM, 2 mM de MgCl2, 2 MnCl2, 4 mM EDTA, 0.2% de BSA.
    2. 2 x Buffer de importación (2xIB): 100 mM K-Tricina o K-HEPES pH 8.0, sorbitol de 660 mM, 8 mM de MgCl2.
      Nota: Se han utilizado concentraciones de MgCl2 desde 3 mM hasta 10 mM sin diferencias observables.
  2. Preparar un gradiente de densidad continua por centrifugación de una mezcla de 15 mL de Percoll y 15 mL de 2xGB a 30.900 g en un rotor de ángulo fijo de 30 min a 4 ° C con el freno de.
  3. Aproximadamente 25 g de guisantes de 9-15 días de la cosecha y homogeneizar en 95 mL de 1xGB. Una batidora con cuchillas afiladas o un Polytron se han utilizado con éxito. Esta mezcla por al menos 2 capas de Miracloth en un embudo de filtro.
    Nota: Limitar la cantidad de tejido de tallo no es necesario pero puede facilitar el proceso de homogeneización, reduciendo roturas de cloroplasto que pueden ocurrir con prolongada de mezcla.
  4. De pellets a 3.000 g en un rotor oscilante de cubo por 5 min a 4 ° C y con cuidado resuspender en 1 mL de 1xGB. Un pincel puede ser la técnica más suave de resuspensión.
  5. Capa con cuidado la suspensión verde encima del gradiente de Percoll y centrifugar a 8.000 g en un rotor oscilante del cubo durante 10 min a 4 ° C con el freno de.
  6. La banda inferior de verde que contiene cloroplastos intactos en un fresco tubo cuidadosamente de la cosecha. Girar los cloroplastos intactos recuperados a 1.800 g en un rotor oscilante de cubo por 5 min a 4 ° C, deseche el sobrenadante y resuspender suavemente el precipitado en 1xIB. Repita este paso de lavado una vez más, resuspender en 30 mL de 1xIB cada vez, con la resuspensión final en 1 mL de 1xIB.
  7. Para cuantificar el contenido de clorofila (Chl), mezclar 10 μl de cloroplastos totalmente resuspendidos con 5 mL de acetona al 80% y el filtro a través de papel de filtro Whatman 1 (espesor nominal 180 μm). Registrar la absorbancia a 720 nm, 663 nm y 645 nm en un espectrofotómetro y calcular la concentración de Chl usando la siguiente fórmula11:
    [Chl] mg/mL = [40.2* (un663 – un720) + 101.4* (un645 – un720)] * 0.1
  8. Ajuste cloroplastos a 1 mg/mL equivalentes de Chl con 1xIB.

3. aislamiento de tilacoides

Nota: Los tilacoides son preparados por lisis hipotónica de cloroplastos intactos. Esto se logra exponiendo los cloroplastos a un tampón hipotónico falta sorbitol. Tilacoides aislados pueden ser utilizado para el análisis de cualquiera de las vías de desplazamiento, pero stromal extracto (SE) debe también estar aislado durante esta preparación si cpSec1 o cpSRP las vías son para ser investigado.

  1. Preparar anticipadamente las siguientes soluciones.
    1. Tampón de lisis hipotónica: 50 mM K-Tricina o K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
    2. 2 x Buffer de estroma crudo (para la concentración de SE): 100 mM K-HEPES de pH 8.0, sorbitol de 660 mM, 8 mM de MgCl2.
    3. Laemmli Sample Buffer (para SDS-PAGE, complementado con EDTA): 125 mM Tris, pH 6.8, SDS 10%, glicerol al 20%, azul de bromofenol 0,05 mg/mL, 10% β-mercaptoetanol, 10 mM EDTA.
  2. Si la recuperación no SE es necesaria, Centrifugue los cloroplastos intactos en 1.000 g en un rotor oscilante del cubo durante 6 min a 4 ° C.
    1. Desechar el sobrenadante y resuspender en 1 mg/mL en tampón de lisis hipotónica. Incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos, con mezcla ocasional.
    2. Recuperar tilacoides por centrifugación a 3.200 g en balanceo cubo rotor durante 8 min a 4 ° C. Lave los tilacoides dos veces, resuspender con 1 a 2 mL de tampón de lisis cada vez. Suspender con 1 mL de 1xIB y requantify Chl como arriba en el protocolo de aislamiento del cloroplasto.

4. concentración y recuperación del extracto estroma

  1. Si la recuperación SE es necesario, divida los cloroplastos intactos en 600 alícuotas μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar cada tubo a 1.000 g en balanceo cubo rotor de 6 min a 4 ° C.
    Nota: Este volumen es conveniente cuando se utiliza tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, que ayuda a prevenir la alteración de la pelotilla eventual para membranas residuales.
    1. Suspender a 1 mg/mL Chl en tampón de lisis hipotónica e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 minutos, como en el paso 3.2.1.
    2. Centrifugue cada tubo a 3.200 x g en balanceo cubo rotor durante 8 min a 4 ° C y la luz verde o amarilla sobrenadante siguientes cloroplasto lisis de transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga con un volumen igual de 2 x de Buffer de estroma crudo.
    3. Tilacoides con 2 volúmenes de tampón de lisis (aproximación de 0,5 mg/mL) de lavar y recoger por centrifugación a 3.200 g en balanceo cubo rotor durante 8 min a 4 ° C. Resuspender y 1 mg/mL Chl en 1xIB en el hielo.
    4. Centrifugue el estroma crudo a 42.000 g en un rotor de ángulo fijo de 30 min a 4 ° C para eliminar las membranas residuales. Inmunotransferencia de proteínas de la envoltura exterior y el interior puede utilizarse para verificar la pureza del sobrenadante.
    5. Recoge el 95% del volumen de cada tubo sin molestar a la pequeña pelotilla verde amarillo. Tenga en cuenta el volumen de cada tubo.
    6. Para preparar el extracto concentrado de stromal (SE), piscina de sobrenadantes recogidos y se concentran cinco veces utilizando un concentrador de 4 mL 30 kDa MWCO.
      Nota: SE prepara de esta manera es equivalente a tejido conectador derivado de cloroplastos en 2,5 mg/mL CHL. Si es necesario, SE puede ser diez veces más concentrado a 5 mg/mL equivalentes de Chl. SE será oro en color y viscoso. En centrífuga de leyenda RT del laboratorio con balanceo cubo rotor, esto requiere unos 10 minutos por mL concentrado.

5. transporte a través de la cpTat vía

Nota: A diferencia del cpSec1 o cpSRP, el camino de cpTat no requiere de componentes solubles o exógeno agregado fuentes de energía; la fuerza motriz de protones impulsado por la luz es necesario3. Por lo tanto, sólo aislada proteína de tilacoides y el substrato se requieren para el ensayo. Sustratos típicos son formas intermedias de los 17 kDa (como se ve en la figura 1) y 23 kDa subunidades del oxígeno evolutivo complejo, iOE17 y iOE23, respectivamente, pero formas precursoras, prOE17 y prOE23, puede también ser con éxito transportado. Precursor formas tienen la entera bipartita secuencia N-terminal apunta, mientras que formas intermedias tienen sólo los tilacoides a secuencia.

  1. Preparar mezcla de transporte cpTat con 0,33 mg/mL Chl tilacoides, 5 mM ATP de un caldo preparado en 1xIB y 8 mM Ditiotreitol (DTT) de un stock en 1xIB, en el hielo. ATP no es estrictamente necesaria para esta reacción si se realiza bajo iluminación.
  2. Transporte iniciar introduciendo 1:30 por volumen mezcla proteína sustrato en el transporte. Si la proteína sustrato no está preparada en 1xIB, preparar una dilución con 2xIB primero, luego use 1:30 por volumen del sustrato diluido en la mezcla de transporte de 1:1.
    Nota: Las concentraciones de sustrato variará según el método de preparación. Por lo general, en vitro preparaciones permitirá nanomolar a cantidades micromolar, mientras que la sobreexpresión permitirá micromolar a cantidades milimolar. Métodos de detección deben también ser considerados como autorradiografía y fluorografía son más sensibles que el immunoblotting.
  3. Iluminar la suspensión en 80-100 µE/m2s de radiación fotosintéticamente activa (PAR) 10 min a temperatura ambiente. Si necesita transporte cinética, equilibrar la mezcla tilacoides y reacción a la temperatura ambiente e iluminar hasta 30 minutos.
  4. Detener la reacción de transporte con una dilución de 8-fold de 1xIB helada y recuperar tilacoides por centrifugación a 3.200 g en microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C.
  5. Retire el sustrato residual que no ha sido transportada, Resuspender el precipitado de tilacoides en 120 μl de 1xIB y digerir proteína externa por la adición de 6 μl de 2 mg/mL thermolysin y 10 mM CaCl2 en 1xIB.
  6. Incubar la reacción de la proteasa en el hielo durante 40 minutos y luego apagar la proteasa al duplicar el volumen con 25 mM EDTA en 1xIB.
  7. Recuperar tilacoides por centrifugación a 3.200 g en una microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C. Lave tilacoides recuperados en 120 μL de EDTA de 5 mM en 1xIB y transfiéralo a un tubo nuevo.
  8. Centrifugue a 3.200 g en una microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C. Vuelva a suspender en un volumen adecuado de Laemmli Sample Buffer suplementado con 10 mM EDTA. Un volumen de 40 μl suele ser suficiente para detectar el sustrato en un gel de SDS-PAGE y conserva muestra para geles de repetición cuando sea necesario.
  9. Coloque las muestras en un baño de agua hirviendo por 10 min y análisis por SDS-PAGE. Autorradiografía, fluorografía o Western blot de proteínas no nativas o etiquetado del epítopo se han utilizado con éxito para la detección de proteínas transportadas.

6. transporte a través de la vía cpSec1

Nota: Transporte a través de la cpSec1 translocon requiere la proteína stromal cpSecA112,13, que pueden ser adquiridos a través de la sobreexpresión en e. coli14,15 o recuperado por concentrar tejido conectador durante el aislamiento de tilacoides. Un sustrato típico es la subunidad de 33 kDa del oxígeno evolución compleja (prOE33), como se ve en la figura 2.

  1. Preparar la mezcla de transporte cpSec1 con 0,33 mg/mL Chl tilacoides, SE equivalente de Chl 0,83 mg/mL o 1,5 μg de cpSecA1 recombinante y 5 mM ATP en hielo e incubar durante 10 minutos. Una mezcla de reacción de transporte típico aquí es 72 μL, hasta de 60 μL debido a la adición SE.
    1. Si va a utilizar en lugar de SE cpSecA1 recombinante, ajuste cpSecA1 purificada con un volumen igual de 2xIB, luego diluir a una concentración conveniente añadir a las reacciones de transporte (por ejemplo, 0.75 μg/μl).
      Nota: Para almacenamiento a largo plazo, cpSecA1 se almacena en hielo en una sala controlada, refrigerada después de la purificación como congelación suprime actividad.
  2. Transporte iniciar introduciendo 1:10 por volumen mezcla de proteínas de sustrato para el transporte. Si la proteína sustrato no está preparada en 1xIB, preparar una dilución de 1:1 con 2xIB y añadir 1:10 por volumen de la proteína diluida a la mezcla de transporte.
  3. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 min debajo de 80-100 µE/m2s PAR. Otra vez, tiempos más largos pueden ser necesarios para cinética o ciertos sustratos.
  4. Después de tratamiento con luz, diluir 8 con helada reacciones 1xIB y centrifugue a 3200 g en microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C.
  5. Tratar con thermolysin y saciar con EDTA como arriba en pasos 5.5 a 5.7.
  6. Centrifugue a 3.200 g en microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C y resuspender el precipitado en un volumen adecuado de Laemmli Sample Buffer suplementado con 10 mM EDTA. Colocar en baño de agua durante 10 minutos antes de cargar en el gel SDS-PAGE de ebullición.

7. introducir la cpSRP vía

Nota: Requiere de la integración mediada por el cpSRP de la luz cosecha proteínas complejas (LHCP) observa en la figura 3 cpSRP54, cpSRP43 y cpFtsY16. Estos componentes se suministran a la reacción de transporte a través de extracto concentrado de estroma, como se describe para el protocolo de cpSec1.

  1. Preparar el cpSRP transporte mezcla con Chl tilacoides y 0,83 mg/mL SE equivalente Chl 5 mM ATP de 0,33 mg/mL en hielo e incubar durante 10 minutos.
  2. Transporte iniciar introduciendo 1:10 por volumen mezcla de proteínas de sustrato para el transporte. Si la proteína sustrato no está preparada en 1xIB, preparar una dilución de 1:1 con 2xIB y añadir 1:10 por volumen de la proteína diluida a la mezcla de transporte.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en 80-100 µE/m2s PAR la reacción.
  4. Después de tratamiento con luz, diluir 8 con helada reacciones 1xIB y centrifugue a 3.200 g en microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 120 μl de 1xIB.
  5. Tratar con thermolysin como anteriormente en las secciones 5.5 a 5.7. Thermolysin digestión es necesaria aquí para evaluar la integración exitosa de la membrana. Lave tilacoides recuperados en 120 μL de EDTA de 5 mM en 1xIB y transfiéralo a un tubo nuevo.
  6. Centrifugue a 3.200 g en microcentrífuga durante 5 minutos a 4 ° C y resuspender el precipitado nuevamente en un volumen adecuado de 2 buffer de x Laemmli suplementado con 10 mM EDTA. Colocar en baño de agua durante 10 minutos antes del análisis por SDS-PAGE de ebullición.
    Nota: Integración de maduro LHCP (mLHCP) es determinado por la aparición de un producto de degradación protegido de proteasa (mLHCP-D) kDa aproximadamente 1.5-2 más pequeño que el de uncleaved mLHCP17.

Resultados

Para medir la cantidad de sustrato transportado con éxito, es útil incluir uno o más carriles de "entrada por ciento". Para los datos presentados a continuación, se utilizó el 10% de la reacción final transporte sin tilacoides. Esta "entrada por ciento" también ayuda a visualizar el tamaño del sustrato precursor. El porcentaje representa una cantidad del sustrato con el cual al substrato transportado en comparación contra conocida, definida y se puede escalar hacia arriba o hacia...

Discusión

Aislamiento del cloroplasto y tilacoides

Rotura excesiva puede resultar en cloroplasto pobre aislamiento y así tilacoides pobre rendimiento después de la separación del gradiente. Es mejor homogeneizar el tejido cosechado suavemente asegurándose de que todo el material es sumergido antes de licuar y pulso en 15 ciclos de s hasta completamente homogeneizada. Si es necesario, utilice múltiples rondas más cortas de la mezcla con menos tejido en cada ronda.

Todos los...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este manuscrito fue elaborado con fondos de la división de ciencias químicas, Geociencias y biociencias, oficina 408, de ciencias básicas de la energía del Departamento de energía a través de Grant DE-SC0017035

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Pisum sativum seedsSeedway LLC, Hall, NY8686 - Little Marvel
MiraclothCalbiochem, Gibbstown, NJ475855-1
80% AcetoneSigma, Saint Louis, MO67-64-1
Blender with sharpened bladesWaring CommercialBB155S
Polytron 10-35Fischer Sci13-874-617
PercollSigma, Saint Louis, MOGE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotorBeckman-Coulter8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotorSorvall8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIBSigma, Saint Louis, MO12/3/83Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIBSigma, Saint Louis, MO74804-12-9Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)Sigma, Saint Louis, MO9073-78-3Can be frozen in aliquots for future use
HEPESSigma, Saint Louis, MOH3375
K-TricineSigma, Saint Louis, MOT0377
SorbitolSigma, Saint Louis, MO50-70-4
Magnesium ChlorideSigma, Saint Louis, MO7791-18-6
Manganese ChlorideSigma, Saint Louis, MO13446-34-9
EDTASigma, Saint Louis, MO60-00-4
BSASigma, Saint Louis, MO9048-46-8
TrisSigma, Saint Louis, MO77-86-1
SDSSigma, Saint Louis, MO151-21-3
GlycerolSigma, Saint Louis, MO56-81-5
Bromophenol BlueSigma, Saint Louis, MO115-39-9
B-MercaptoethanolSigma, Saint Louis, MO60-24-2

Referencias

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