생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

요약

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

초록

엽록체는 녹색 식물 수많은 필수 대사 경로, 수행에 대 한 책임에서 세포 특히 광합성. 엽록체, 내 thylakoid 막 시스템 모든 광합성 안료, 반응 센터 복합물, 및 전자 통신 사업자의 대부분 이며 빛 종속 ATP 합성에 대 한 책임. 엽록체 단백질의 90% 이상 핵에서 인코딩, cytosol, 번역 이며 이후에 엽록체를 가져올. 추가 단백질 전송 또는 thylakoid 막에 걸쳐 4 전 경로 중 하나를 사용합니다. 여기, 우리 3 에너지 종속 cpTat, cpSec1, 및 cpSRP 중재 경로 통해 전송 분석 함께 완두콩 (Pisum sativum)에서 전송 유능한 thylakoids의 격리에 대 한 높은 수확량 메서드를 설명합니다. 이러한 메서드를 실험 생물학 막에 걸쳐 thylakoid 단백질 지 방화, 교통에 너 지론, 그리고 단백질 전 좌의 메커니즘에 관련 된 사용.

서문

배치할 기계 적절 한 엽록체 기능에 대 한 책임의 거의 모든 cytosol¹translocated 해야 합니다. 엽록체 봉투에서 단백질 기판의 외부 막 (TOC) translocon와 내부 막 (TIC)²의 translocon를 통해 가져올 수 있습니다. 더는 thylakoid에 타겟팅 막과 루멘 트윈 아르기닌 전 (cpTat)³,⁴분 비 (cpSec1), 신호 승인 입자 (cpSRP)⁵, 그리고 자발적인 삽입 경로^{6 통해 발생} . 순수 활성 엽록체 및 thylakoid 막의 높은 수율 격리에 대 한 메서드는 필요한에 너 지론과 전 이벤트, 각 통로에 다양 한 전송 메커니즘을 이해 하 고 지역화의 활동을 측정 하는 엽록체의 6 가지 구획에 관심의 특정 단백질 기질.

더 나은 실험 제어 전송에 너 지론의 측정에 영향을 주는 환경 요인 (예: 소금, 기질 농도, pH 조건과 ATP/GTP의 존재)를 제공 하는 엽록체에서 막의 분리 및 속도 론입니다. 이 체 외에서 환경에 빌려준다 전 좌의 기계적 세부 탐사 같은 이유로. 또한, 엽록체 단백질의 지역화에 대 한 예측 소프트웨어^7,8개선 했다, 하는 동안 전송 분석 생체 외에서 제공 확인에 대 한 더 빠른 방법 현미경-기반 형광 분석을 인코딩된 유전자 형광 태그, 공장 변환 및 특정 항 체를 필요 합니다. 여기, 엽록체 및 thylakoid 격리 완두콩 (Pisum sativum)에서 뿐만 아니라 에너지 의존 thylakoid 전 좌 통로의 각각에 최적화 된 전송 분석 실험 프로토콜 선물이.

프로토콜

1. 초기 자료

1. 완두콩의 약 55 g 400 ml 증류수, 3 시간 담근 다 고 다음 플라스틱 쟁반에 뿌리 다 (35 cm x 20 cm x 6 cm) 질 석의 얇은 층으로 덮여 토양에.
2. 9 ~ 15 일에 대 한 12/12 h 명암 (50 µE/m²s) 주기에서 20 ° C에서 완두콩의 트레이 성장.
3. 선호 하는 방법에 따라 단백질 기질을 준비 합니다.
   참고: 우리는 다양 한 1 등 하는 방법 사용 하 여 단백질 기판 준비) 순화 된 플라스 미드에서 녹음 방송 생체 외에서 다음 밀 배아 추출 물 또는 토끼 reticulocyte lysates [³H]의 존재를 사용 하 여 번역-신 또는 [³⁵S]-메티오닌, 2) TnT 같은 결합 된 전사/번역 키트를 사용 하 여 체 외에서 번역 Promega radiolabeling 위에서, 함께 그리고 3에서 키트) 대장균에 overexpressed 단백질의 정화. 번역 제품 방사성 체 외에 일반적으로 50 m m 감기 아미노산 전송 반응에서 사용 하기 전에 침묵 된다. 이러한 각 메서드는 일반적으로 각 새로운 단백질 기질에 대 한 몇 가지 최적화를 필요합니다. 결합 된 생체 외에서 시스템의 예, 링 및 자비스 참조 (2016)⁹.

2. 엽록체 절연 및 정량화

참고: thylakoids의 준비의 첫 번째 단계는 그대로 엽록체¹⁰의 격리. 모든 재료 준비 하는 동안 차가운 유지 되어야 한다. 엽록체의 물의 Resuspension이이 단계에서 파손 이후 thylakoid 수율 제한할 수로 부드럽게 처리 되어야 합니다.

1. 다음 솔루션을 미리 준비 합니다.
   1. 2 분쇄 버퍼 (2xGB) x: 100 mM HEPES K pH 7.3 660 m m sorbitol, 2 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 4 mM EDTA, 0.2 %BSA.
   2. 가져오기 버퍼 (2xIB) x 2: 100 m m K-Tricine 또는 K HEPES pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl₂.
      참고: MgCl₂ 3 m m에서 10mm까지 농도 현저한 차이 없이 사용 되었습니다.
2. Percoll의 15 mL와 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서 30,900 g 에 2xGB의 15 mL의 혼합물 브레이크 centrifuging 여 연속 밀도 그라디언트를 준비 합니다.
3. 9 월 15 일 오래 된 완두콩의 약 25 g을 수확 하 고 1xGB의 95 mL에 균질. 날카롭게 블레이드와 함께 믹서 기 또는 Polytron는 성공적으로 사용 되었습니다. 퍼 널에서 Miracloth의 2 층을 통해이 혼합물을 필터링 합니다.
   참고: 줄기 조직의 양을 제한 필요 하지 않습니다 하지만 수 있습니다 쉽게 균질 화 과정, 장시간 혼합 된 발생할 수 있는 엽록체 파손을 줄일.
4. 4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에서 3000 g 에서 펠 릿과 1xGB의 1 mL에 부드럽게 resuspend. 그림 붓은 가장 부드러운 물의 resuspension 기술 있을 수 있습니다.
5. 신중 하 게 떨어져 브레이크 Percoll 그라데이션 및 4 ° C에서 10 분에 대 한 진동 물통 회전자에 8000 g 에서 원심 분리기 녹색 정지 레이어.
6. 조심 스럽게 수확 신선한 관으로 그대로 엽록체를 포함 하는 낮은 녹색 밴드. 4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1800 g 에서 복구 된 그대로 엽록체를 회전 하 고, 삭제는 상쾌한 부드럽게 펠 릿 1xIB에 resuspend. 이 세척 단계 한 번 더, 1xIB의 30 mL에 resuspending와 1xIB의 1 mL에 마지막 물의 resuspension 때마다, 반복 합니다.
7. 엽록소 (Chl) 콘텐츠를 계량, 완전히 resuspended 엽록체의 10 µ L 80% 아세톤 및 Whatman 1 필터 종이 (공칭 두께 180 µ m)을 통해 필터의 5 mL와 혼합 한다. 720에서 흡 광도 기록 nm, 663 nm와 645 nm는 분 광 광도 계에 사용 하 여 다음 수식¹¹Chl 농도 계산:
   [Chl] mg/mL = [40.2* (는₆₆₃ -₇₂₀) + 101.4* (₆₄₅ -₇₂₀)] * 0.1
8. 1 mg/mL 1xIB와 Chl 등가물에 엽록체를 조정 합니다.

3입니다. Thylakoids의 격리

참고: Thylakoids 그대로 엽록체의 침투성 세포에 의해 준비 된다. 이 소형 버퍼 sorbitol 부족에 엽록체를 노출 하 여 이루어집니다. 격리 된 thylakoids 전 좌 통로 시 금에 사용할 수 있습니다 하지만 stromal 추출 (SE) 또한 격리 되어야이 준비 하는 동안 cpSec1 또는 cpSRP 경로 조사 하는 경우.

1. 다음 솔루션을 미리 준비 합니다.
   1. 침투성 세포의 용 해 버퍼: 50 m m K-Tricine 또는 K HEPES 산도 8.0, 8 m m MgCl₂.
   2. 2 원유 기질 버퍼 (SE의 농도)에 대 한 x: 100 mM HEPES K pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl₂.
   3. (페이지에 대 한 SDS-EDTA와 보충) Laemmli 샘플 버퍼: 125 mM Tris pH 6.8, 10 %SDS, 20% 글리세롤, 0.05 mg/mL bromophenol 블루, 10% β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
2. SE 복구 필요 하지 않은 경우 원심 그대로 엽록체에서 4 ° c.에 6 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1000 g
   1. 삭제는 상쾌한 고 침투성 세포의 용 해 버퍼에 1 mg/mL를 resuspend. 가끔 혼합과 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
   2. 4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 각 시간에 세포의 용 해 버퍼의 1 ~ 2 mL와 resuspending thylakoids 두 번 씻는 다. 1xIB의 1 mL와 resuspend 그리고 엽록체 격리 프로토콜에서 위에 Chl를 requantify.

4. 실질 추출 복구 및 농도

1. SE 복구 필요한 경우 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 600 µ L aliquots에 그대로 엽록체를 분할 하 고 각 관 4 ° c.에 6 분 통 터 스윙에서 1000 g 에서 원심
   참고:이 볼륨은 편리한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하는 경우 잔여 세포 막에 대 한 최종 펠 릿의 소요를 방지 하는 데 도움이.
   1. 1 mg/mL Chl 침투성 세포의 용 해 버퍼에서를 resuspend 하 고 단계 3.2.1에서 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.
   2. 각 관에 4 ° C에서 8 분 통 터 스윙 3200 x g 에서 원심 하 고 원유 기질 버퍼 x 2의 동등한 양 가진 새로운 microcentrifuge 튜브에는 가벼운 녹색 또는 노란색 표면에 뜨는 다음 엽록체 세포를 전송.
   3. Thylakoids (가깝게 0.5 mg/mL)는 세포의 용 해 버퍼의 2 양으로 세척 및 4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 원심 분리 하 여 수집 1 mg/ml Chl 얼음에 1xIB에 resuspend.
   4. 42000 g 잔류 막 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서에서 원유 기질 원심 외부 및 내부 봉투 단백질을 위한 Immunoblotting는 상쾌한의 순도 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
   5. 작은 노란색-녹색 펠 렛을 방해 하지 않고 각 관에서 볼륨의 95%를 수집 합니다. 각 관에서 가져온 볼륨 note
   6. 집중된 stromal 추출 (SE)를 준비 하려면 수집된 supernatants 수영장 그리고 배 4 mL 30 kDa MWCO 집중 장치를 사용 하 여 집중.
      참고:이 방식으로 준비 하는 SE는 2.5 mg/mL Chl.에서 엽록체에서 파생 된 기질 필요한 경우 SE 5 mg/mL Chl 등가물을 10 배 집중 될 수 있습니다. SE 색상에 황금과 점도 있을 것입니다. 진동 물통 회전자와 랩의 전설 RT 원심 분리기에이 집중 하는 mL 당 약 10 분 필요 합니다.

5. cpTat 통로 통해 전송

참고: cpSec1 또는 cpSRP, 달리 cpTat 통로 수용 성 구성 요소를 요구 하지 않는다 또는 것 추가 에너지 소스; 빛 주도 양성자 동기 힘만 필요한³입니다. 따라서만 고립 된 thylakoids 및 기질 단백질 분석 결과 대 한 필요는. 전형적인 기판은 ( 그림 1에서 보이는) 것과 같이 17 kDa의 중간 형태와 산소 진화 복합물, iOE17 및 iOE23, 23 kDa subunits 각각, 그러나 전조 폼, prOE17 및 prOE23, 또한 수송 될 수 있다 성공적으로. 중간 형태는 시퀀스를 대상으로 하는 thylakoid만 동안 선구자 형태는 전체이 분 N 터미널 대상 시퀀스를, 있다.

1. Chl thylakoids, 1xIB, 및 1xIB, 얼음에 주식에서 8 m m dithiothreitol (DTT)에 주식에서 5mm ATP cpTat 전송 혼합 0.33 mg/mL를 준비 합니다. 조명 아래에서 실시 하는 경우 ATP 엄격 하 게이 반응을 위한 필요 하지 않습니다.
2. 1시 30분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 전송에서 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 희석 먼저, 다음 사용 하 여 1:30 볼륨으로 볼륨 희석된 기판의 전송 조합에 1: 1을 준비.
   참고: 기판의 농도 준비 방법에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 생체 외에서 준비 overexpression micromolar millimolar 금액에 대 한 허용 됩니다 nanomolar micromolar 금액을 허용 합니다. Autoradiography와 fluorography는 immunoblotting 보다 더 민감한, 검출 방법 또한 고려 되어야 한다.
3. 실 온에서 10 분 동안 photosynthetically 활성 방사선 (파)의 80-100 µE/m²s 정지 밝히는. 전송 속도 론 필요한 경우 미리 두 thylakoids equilibrate 그리고 반응 실내 온도에 혼합 하 고 30 분 최대 조명.
4. 얼음 처럼 차가운 1xIB의 원죄 희석와 전송 반응을 중지 및 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 분리 하 여 thylakoids를 복구
5. 잔여 기판 이송 하지가 제거 하 고 1xIB의 120 µ L에서 thylakoid 펠 릿 resuspend 2 mg/mL thermolysin와 10mm CaCl₂ 1xIB에서의 6 µ L의 추가 의해 외부 단백질을 소화.
6. 40 분 동안 얼음에 효소 반응 품 어 그리고 25 mM EDTA 1xIB에 있는 볼륨을 두 배로 protease를 끄다.
7. 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.
8. 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 10 mM EDTA와 보충 Laemmli 샘플 버퍼의 적절 한 볼륨에서 resuspend. 40 µ L의 볼륨은 일반적으로 충분히 SDS 페이지 젤에 기판 감지 하 고 필요한 경우 반복 젤에 대 한 샘플을 보존.
9. 10 분 동안 끓는 물 욕조에 샘플을 놓고 SDS-PAGE로 분석 합니다. Autoradiography, fluorography, 또는 비-네이티브 또는 피토 프 태그 단백질의 서 부 럽 수송된 단백질의 탐지를 위해 성공적으로 사용 되어 왔습니다.

6. cpSec1 통로 통해 전송

참고: cpSec1 translocon 통해 전송 필요 stromal 단백질 cpSecA1^12,13, 대장균^14,15 overexpression 통해 조달 하거나 기질을 집중 하 여 복구할 수 있는 동안 thylakoid 격리. 그림 2에서 보듯이 전형적인 기판 (prOE33), 복잡 한 진화 하는 산소의 33 kDa 소 단위입니다.

1. Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE 또는 재조합 cpSecA1, 그리고 5mm 얼음, ATP의 1.5 μ g 0.33 mg/mL cpSec1 전송 믹스를 준비 하 고 10 분 동안 품 어. 여기는 일반적인 전송 반응 혼합물 때문에 SE 추가 60 μ에서 72 μ, 최대입니다.
   1. 재조합 cpSecA1 SE 대신 사용 됩니다, 순화 cpSecA1 2xIB의 동일한 볼륨을 조정할 경우 전송 반응 (예를 들어, 0.75 µ g / µ L)에 추가 하는 편리한 농도에 희석.
      참고: 긴 기간 저장을 위해 cpSecA1에 저장 된 제어, 냉장 실에 얼음으로 정화 후 동결 곧 활동.
2. 1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.
3. 아래 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어 80-100 µE/m^2의파. 다시 말하지만, 긴 시간 활동 또는 특정 기판에 대 한 필요할 수 있습니다.
4. 가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에 5 분에서 3200 g 에서 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응
5. Thermolysin와 함께 취급 하 고 5.7 통해 단계 5.5에서 이상으로 EDTA와 끄다.
6. 4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 Laemmli 샘플 버퍼 10 mM EDTA와 보충의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 resuspend. SDS 페이지 젤에 로딩 하기 전에 10 분 동안 물 목욕을 끓는 장소.

7입니다. 삽입 cpSRP 통로 통해

참고: cpSRP54, cpSRP43, 및 cpFtsY¹⁶빛 수확 하는 복잡 한 단백질 (LHCP) 그림 3의 cpSRP 중재 통합 필요 합니다. 이러한 구성 요소는 cpSec1 전송 프로토콜에 대 한 설명 된 대로 집중된 stromal 추출 통해 전송 반응에 제공 됩니다.

1. cpSRP을 준비 얼음에 0.33 mg/mL Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE, 그리고 5mm ATP 혼합을 수송 하 고 10 분 동안 품 어.
2. 1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.
3. 80-100 µE/m^2의파에에서 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.
4. 가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에서 5 분에 3, 200 g 에 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응 상쾌한 삭제 하 고 1xIB의 120 µ L에 펠 릿을 resuspend.
5. 섹션 5.7 통해 5.5 이상으로 thermolysin와 함께 취급 합니다. Thermolysin 소화 성공적인 막 통합을 평가 하기 위해 여기 필요 하다. 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.
6. 4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 10mm EDTA로 보완 하는 2 x Laemmli 버퍼의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 다시 resuspend. 끓는 SDS 페이지 분석 전에 10 분 동안 물을 욕조에 배치 합니다.
   참고: 성숙한 LHCP (mLHCP)의 통합 저하 효소 보호 제품 (mLHCP-D)의 외관에 의해 평가 약 1.5-2 kDa uncleaved mLHCP¹⁷보다 작은.

결과

성공적으로 수송 하는 기판의 크기를 측정 하기 위해 하나 이상의 "백분율 입력" 차선을 포함 하도록 유용 합니다. 아래 제시 하는 데이터에 대 한 마지막 전송 반응 없이 thylakoids의 10% 사용 되었다. 이 "백분율 입력" 또한 전조 기판의 크기를 시각화 하는 데 도움이. 비율에 대 한 수송 비교 기판에는 기판의 알려진, 정의 된 금액을 나타내고 단백질 준비 필요한 사용 하 여 ?...

토론

엽록체 및 Thylakoid 절연

과도 한 파손 될 수 있습니다 가난한 엽록체에서 격리 하 고 따라서 가난한 thylakoid에서에서 분리 후 항복. 그것은 모든 재료 혼합 및 완전히 무 균 때까지 15 s 사이클에서 펄스 전에 침수는 함으로써 부드럽게 수확된 조직 균질 최고의. 필요한 경우 여러 개의 짧은 라운드의 각 라운드에서 적은 조직으로 혼합 사용 합니다.

수확된 조직...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Acetone	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Blender with sharpened blades	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Can be frozen in aliquots for future use
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbitol	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Magnesium Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Manganese Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glycerol	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Bromophenol Blue	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoethanol	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2