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Resumo

Apresentamos os protocolos neste documento para isolamento de alto rendimento de fisiologicamente ativo contém e ensaios de transporte da proteína para a translocação de arginina gêmeo cloroplasto (cpTat), secretora (cpSec1) e percursos de partícula (cpSRP) de reconhecimento de sinal.

Resumo

Cloroplastos são as organelas em plantas verdes responsáveis pela realização de inúmeras vias metabólicas essenciais, mais notavelmente a fotossíntese. Dentro do cloroplasto, o sistema de membrana tilacoides abriga todos os pigmentos fotossintéticos, complexos de centro de reação e a maioria dos transportadores de elétrons e é responsável pela síntese de ATP de luz-dependente. Mais de 90% das proteínas do cloroplasto são codificados no núcleo, traduzido no citoplasma e posteriormente importada para o cloroplasto. Transporte de proteína adicional em ou através da membrana tilacoides utiliza uma das quatro vias de translocação. Aqui, descrevemos um método de alto rendimento para isolamento de transporte-competente contém de ervilhas (Pisum sativum), juntamente com ensaios de transporte através de três cpTat de energia-dependente, cpSec1 e vias mediada por cpSRP. Estes métodos permitem experiências relacionadas com a localização da proteína tilacoides, transporte energética e os mecanismos de translocação de proteínas através das membranas biológicas.

Introdução

Quase todas as máquinas proteicas responsável pela função de cloroplasto adequada devem ser translocadas no citosol1. Os envelopes do cloroplasto, substratos de proteína são importados através do translocon da membrana exterior (TOC) e o translocon da membrana interna (TIC)2. Mais direcionamento para os tilacoides membrana e lúmen ocorre através do gêmeo arginina translocação (cpTat)3, a secretora (cpSec1)4, o sinal de reconhecimento das partículas (cpSRP)5e as vias de inserção espontânea6 . Um método para a isolação de alto rendimento de cloroplastos fisiologicamente ativos e membranas tilacoides é necessário medir a energética e cinética de um evento de translocação, compreender os mecanismos de transporte diversa em cada percurso e localizar uma substrato específico da proteína de interesse para qualquer um dos seis compartimentos distintos do cloroplasto.

O isolamento das membranas do cloroplasto oferece melhor experimental controle sobre fatores ambientais (tais como concentrações de sal e substrato, a presença de ATP/GTP e condições de pH) que afetam a medição da energética de transporte e cinética. Este ambiente em vitro presta-se à exploração dos detalhes mecanicistas de translocação, pelas mesmas razões. Além disso, enquanto o software preditivo para localização de proteínas cloroplasto melhorou7,8, ensaios de transporte em vitro fornecem um método mais rápido para confirmação sobre baseado em microscopia fluorescentes ensaios que exigem uma etiqueta fluorescente geneticamente codificada, planta de transformação e/ou anticorpos específicos. Aqui, apresentamos protocolos para isolamentos de cloroplasto e tilacoides de ervilhas (Pisum sativum), bem como para os ensaios de transporte otimizados para cada uma das vias de translocação de tilacoides de energia-dependente.

Protocolo

1. materiais iniciais

  1. Aproximadamente 55 g de ervilhas de molho por 3 horas em 400 mL de água destilada e em seguida semear em uma bandeja plástica (35 cm x 20 cm x 6 cm) em solo coberto com fina camada de vermiculita.
  2. Cresce a bandeja de ervilhas a 20 ° C, sob o ciclo claro/escuro (50 µE/m2s) de 12/12 h por 9 a 15 dias.
  3. Prepare o substrato da proteína de acordo com um método preferido.
    Nota: Temos preparado substratos de proteínas usando uma variedade de métodos, incluindo 1) em vitro transcrição de plasmídeos purificados seguido de tradução utilizando extratos de gérmen de trigo ou lysates de Reticulócito coelho na presença [3H]-leucina ou [35S]-metionina, 2) em vitro tradução usando um kit de transcrição/tradução acoplado como o TnT kits Promega, com radioativos como acima, e 3) purificação da proteína Blumental em e. coli. Radioativo em vitro produtos tradução geralmente são extinguidos com 50mm frio aminoácido antes da utilização em reações de transporte. Normalmente, cada um desses métodos requer alguma otimização para cada novo substrato de proteína. Para obter um exemplo de um sistema acoplado em vitro , consulte Ling e Jarvis (2016)9.

2. cloroplasto isolamento e quantificação

Nota: A primeira etapa na preparação da contém é o isolamento de cloroplastos intactos10. Todos os materiais devem ser mantidos frios durante a preparação. Ressuspensão de cloroplastos deve ser manuseado suavemente, como ruptura neste passo pode limitar severamente o rendimento de tilacoides subsequentes.

  1. Prepare soluções previamente na sequência.
    1. 2 x Buffer de moagem (2xGB): pH 100 mM K-HEPES 7.3, sorbitol 660 mM, 2 mM MgCl2, 2mm MnCl2, 4 mM de EDTA, 0,2% de BSA.
    2. 2 x importação Buffer (2xIB): 100 mM K-Tricine ou K-HEPES pH 8.0, sorbitol 660 mM, 8 mM MgCl2.
      Nota: Concentrações de MgCl2 , variando de 3 mM a 10 mM foram usadas sem diferenças observáveis.
  2. Prepare um gradiente de densidade contínua por centrifugação de uma mistura de 15 mL de Percoll e 15 mL de 2xGB a 30.900 g em um rotor de ângulo fixo para 30 min a 4 ° C com o travão de fora.
  3. Colheita de cerca de 25 g de ervilhas de 9-15 dias de idade e homogeneizar em 95 mL de 1xGB. Liquidificador com lâminas afiadas ou um Polytron têm sido utilizados com sucesso. Filtre esta mistura pelo menos 2 camadas de Miracloth em um funil.
    Nota: Limitando a quantidade de tecido do tronco não é necessário, mas pode facilitar o processo de homogeneização, reduzindo assim a ruptura do cloroplasto que pode ocorrer com prolongada de mistura.
  4. De Pelotas a 3.000 g em um rotor de balde balançando por 5 min a 4 ° C e ressuspender delicadamente em 1 mL de 1xGB. Um pincel pode ser a técnica de ressuspensão mais gentil.
  5. Camada cuidadosamente a suspensão verde no topo do gradiente de Percoll e centrifugar a 8.000 g em um rotor de balde balançando durante 10 minutos a 4 ° C com o travão de fora.
  6. Cuidadosamente Colha a banda inferior verde contendo cloroplastos intactos em um tubo de fresco. Girar os cloroplastos recuperados intactos a 1.800 g em um rotor de balde balançando por 5 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante e suavemente resuspenda o pellet em 1xIB. Repita essa etapa de lavagem mais uma vez, resuspending em 30 mL de 1xIB de cada vez, com o final ressuspensão em 1 mL de 1xIB.
  7. Para quantificar o teor de clorofila (Chl), misture 10 µ l de cloroplastos totalmente ressuspensão com 5 mL de acetona 80% e filtrar com papel de filtro Whatman 1 (espessura nominal 180 µm). Gravar a absorvância a 720 nm, 663 nm e 645 nm num espectrofotómetro e calcular a concentração de Chl usando a seguinte fórmula11:
    [Chl] mg/mL = [40.2* (um663 – um720) + 101.4* (um645 – um720)] * 0.1
  8. Ajuste os cloroplastos a 1 mg/mL Chl equivalentes com 1xIB.

3. isolamento de contém

Nota: Contém é preparados por lise hipotónica de cloroplastos intactos. Isto é conseguido, expondo os cloroplastos para um buffer hipotônica falta sorbitol. Contém isolado pode ser usado para qualquer uma das vias de translocação de análise, mas extrato do estroma (SE) também deve ser isolado durante esta preparação se caminhos ou cpSec1 ou cpSRP estão a ser investigada.

  1. Prepare-se antes do tempo as seguintes soluções.
    1. Tampão de Lise hipotónica: 50mm Tricine-K ou K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
    2. 2 x bruto estroma Buffer (para concentração do SE): pH 100 mM K-HEPES 8.0, sorbitol 660 mM, 8 mM MgCl2.
    3. Laemmli Sample Buffer (para SDS-PAGE, suplementado com EDTA): pH de Tris 125mm 6,8, SDS 10%, 20% de glicerol, bromofenol 0,05 mg/mL, 10% β-Mercaptoetanol, 10 mM de EDTA.
  2. Se a recuperação SE não for necessária, centrifugue os cloroplastos intactos a 1.000 g em um rotor de balde oscilante para 6 min a 4 ° C.
    1. Desprezar o sobrenadante e ressuspender a 1 mg/mL em tampão de Lise hipotónica. Incube em gelo no escuro por 10 min, com ocasionais de mistura.
    2. Recuperar o contém por centrifugação a 3.200 g em balançando balde rotor durante 8 min a 4 ° C. Lave a contém duas vezes, resuspending com 1 a 2 mL de tampão de lise de cada vez. Resuspenda com 1 mL de 1xIB e requantify Chl como acima no protocolo de isolamento de cloroplasto.

4. do estroma extrato recuperação e concentração

  1. Se a recuperação SE for necessária, divida os cloroplastos intactos em 600 alíquotas µ l em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar cada tubo a 1.000 g em balançando balde rotor para 6 min a 4 ° C.
    Nota: Este volume é conveniente quando usar tubos de 1,5 mL microcentrifuga, que ajuda a evitar a perturbação da eventual pelota para membranas residuais.
    1. Resuspenda a 1 mg/mL Chl em tampão de Lise hipotónica e incubar no gelo no escuro por 10 minutos, como no passo 3.2.1.
    2. Centrifugue a cada tubo a 3.200 x g em balançando balde rotor durante 8 min a 4 ° C e a luz verde ou amarelo sobrenadante seguir cloroplasto lise de transferência para um novo tubo de microcentrifuga com igual volume de 2x Buffer bruto do estroma.
    3. Lave contém com 2 volumes de tampão de lise (aproximação de 0,5 mg/mL) e recolher por centrifugação a 3.200 g em balançando balde rotor durante 8 min a 4 ° C. Resuspenda 1mg/ml Chl em 1xIB no gelo.
    4. Centrifugue o estroma bruta a 42.000 g em um rotor de ângulo fixo para 30 min a 4 ° C para remover membranas residuais. Immunoblotting para proteínas do envelope exterior e interior pode ser usado para verificar a pureza do líquido sobrenadante.
    5. Colete 95% do volume de cada tubo, sem perturbar o pequeno sedimento amarelo-verde. Anote o volume extraído em cada tubo.
    6. Para preparar o extrato concentrado do estroma (SE), reunir as fracções sobrenadantes coletadas e concentrar-se cinco vezes, usando um concentrador MWCO 4 mL 30 kDa.
      Nota: SE preparado desta maneira equivale a estroma derivada de cloroplastos em 2,5 mg/mL Chl. Se necessário, SE pode ser dez vezes mais concentrado a 5 mg/mL Chl equivalentes. SE vai ser loiro e viscoso. Na centrífuga de lenda RT do laboratório com rotor de balde de balanço, isto requer cerca de 10 min / mL de concentrado.

5. transporte através da cpTat caminho

Nota: Ao contrário do cpSec1 ou cpSRP, o caminho de cpTat não requer componentes solúveis ou exogenamente adicionado fontes de energia; somente a força motriz protónica orientado a luz é necessário3. Portanto, apenas isolada proteína contém e substrato são necessários para o ensaio. Substratos típicos são formas intermediárias da kDa 17 (como visto na Figura 1) e 23 kDa subunidades do oxigênio em evolução complexa, iOE17 e iOE23, respectivamente, mas formas de precursor, prOE17 e prOE23, podem também ser com sucesso transportados. Formas precursoras têm a inteiro bipartido N-terminal sequência de direcionamento, enquanto formas intermediárias têm apenas os tilacoides sequência de direcionamento.

  1. Prepare a mistura de transporte cpTat com 0,33 mg/mL contém Chl, 5mm ATP de um estoque preparado em 1xIB e 8 mM ditiotreitol (DTT) de um estoque preparado em 1xIB, no gelo. ATP não é estritamente necessário para esta reação se conduzido sob iluminação.
  2. Iniciar transporte introduzindo 01:30 volume por volume de proteína substrato no transporte de misturar. Se proteína substrato não é preparada em 1xIB, prepare uma diluição com 2xIB primeiro, depois use 01:30 por volume o volume do substrato diluído no mix transporte de 1:1.
    Nota: Concentrações de substrato irão variar com base no método de preparação. Normalmente, em vitro preparações permitirá nanomolar montantes micromolar, enquanto superexpressão permitirá micromolar montantes milimolar. Métodos de deteção também devem ser considerados, como autoradiografia e fluorography são mais sensíveis que immunoblotting.
  3. Ilumine a suspensão em 80-100 µE/m2s de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) por 10 min à temperatura ambiente. Se a cinética de transporte é necessária, pre-equilibrar ambos contém e reação de mistura à temperatura ambiente e iluminar para até 30 min.
  4. Parar a reação de transporte com uma 8 vezes diluição de 1xIB gelada e recuperar contém por centrifugação a 3.200 g em microcentrifuga por 5 min a 4 ° C.
  5. Remover o substrato residual que não foi transportado, resuspenda o pellet de tilacoides em 120 µ l de 1xIB e digerir a proteína externa por adição de 6 µ l de 2 mg/mL thermolysin e 10 mM CaCl2 em 1xIB.
  6. Incubar a reação de protease no gelo por 40 min e depois saciar a protease, duplicando o volume com 25 mM de EDTA preparado em 1xIB.
  7. Recuperar o contém por centrifugação a 3.200 g numa microcentrifuga por 5 min a 4 ° C. Lave contém recuperados em 120 μL de 5 mM EDTA em 1xIB e transferir para um tubo novo.
  8. Centrifugar a 3.200 g numa microcentrifuga por 5 min a 4 ° C. Resuspenda em um volume adequado de Laemmli Sample Buffer suplementado com 10 mM de EDTA. Um volume de 40 µ l é geralmente suficiente para detectar o substrato em um gel de SDS-PAGE e conserva a amostra para repetição géis quando necessário.
  9. Colocar as amostras em um banho de água fervente por 10 minutos e analisar por SDS-PAGE. Autoradiografia, fluorography ou mancha ocidental de proteínas não-nativas ou epítopo-marcados têm sido utilizados com sucesso para a deteção de proteínas de transportadas.

6. transporte através da via cpSec1

Nota: Transporte através da cpSec1 translocon requer a proteína do estroma cpSecA112,13, que podem ser recuperados, concentrando o estroma ou adquiridos através de superexpressão em Escherichia coli14,15 durante o isolamento de tilacoides. Um substrato típico é o 33 kDa subunit do oxigênio em evolução complexa (prOE33), como visto na Figura 2.

  1. Preparar a mistura de transporte de cpSec1 com 0,33 mg/mL contém Chl, 0,83 mg/mL Chl SE equivalente ou 1,5 μg de recombinação cpSecA1 e 5 mM ATP no gelo e incubar durante 10 min. Uma mistura de reação típica de transporte aqui é 72 μL, até de 60 μL devido à adição de SE.
    1. Se será usado em vez de SE cpSecA1 recombinante, ajustar cpSecA1 purificada com um volume igual de 2xIB e, em seguida, diluir para uma concentração conveniente para adicionar as reações de transporte (por exemplo, 0,75 µ g / µ l).
      Nota: Para o armazenamento de longo prazo, cpSecA1 é armazenado no gelo em uma sala refrigerada controlada após purificação como congelamento abole a atividade.
  2. Iniciar transporte introduzindo 01:10 volume por volume de proteína de substrato para o transporte de misturar. Se proteína substrato não é preparada em 1xIB, preparar uma diluição de 1:1 com 2xIB e adicionar 01:10 por volume o volume da proteína diluída para a mistura de transporte.
  3. Incubar a reação na temperatura ambiente por 10 min em 80-100 µE/m2s PAR. Novamente, mais vezes podem ser necessários para cinética ou determinados substratos.
  4. Após o tratamento com luz, diluir 8-fold com gelada reações 1xIB e centrifugar a 3200 g em microcentrifuga por 5 min a 4 ° C.
  5. Tratar com thermolysin e saciar com EDTA como acima em 5.5 etapas através de 5,7.
  6. Centrifugar a 3.200 g em microcentrifuga por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet em um volume adequado de Laemmli Sample Buffer suplementado com 10 mM de EDTA. Coloque em banho-maria por 10 min antes do carregamento em gel de SDS-PAGE a ferver.

7. inserção através da cpSRP caminho

Nota: A integração mediada por cpSRP da luz colheita proteínas complexas (LHCP) vistas em Figura 3 requer cpFtsY16, cpSRP43 e cpSRP54. Esses componentes são fornecidos para a reação de transporte através de extrato concentrado do estroma, como descrito para o protocolo de transporte de cpSec1.

  1. Preparar a cpSRP transporte mistura com 0,33 mg/mL Chl contém 0,83 mg/mL equivalente SE Chl e 5mm ATP no gelo e incubar durante 10 min.
  2. Iniciar transporte introduzindo 01:10 volume por volume de proteína de substrato para o transporte de misturar. Se proteína substrato não é preparada em 1xIB, preparar uma diluição de 1:1 com 2xIB e adicionar 01:10 por volume o volume da proteína diluída para a mistura de transporte.
  3. Incube a reação à temperatura ambiente por 10 min em 80-100 µE/m2s PAR.
  4. Após o tratamento com luz, diluir 8-fold com gelada reações 1xIB e centrifugar a 3.200 g em microcentrifuga por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 120 µ l de 1xIB.
  5. Tratar com thermolysin como acima nas seções 5.5 através de 5,7. Thermolysin digestão é necessário aqui avaliar a integração bem sucedida de membrana. Lave contém recuperados em 120 μL de 5 mM EDTA em 1xIB e transferir para um tubo novo.
  6. Centrifugar a 3.200 g em microcentrifuga por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet novamente em um volume adequado de 2 x Laemmli buffer, suplementado com 10 mM de EDTA. Coloque em banho-maria durante 10 minutos antes da análise por SDS-PAGE a ferver.
    Nota: Integração de LHCP maduro (mLHCP) é avaliada pelo aparecimento de um produto de degradação de protease-protegido (mLHCP-D) aproximadamente 1.5-2 kDa menor do que o mLHCP uncleaved17.

Resultados

Para medir a quantidade de substrato transportado com sucesso, é útil incluir uma ou mais faixas de "entrada por cento". Para os dados apresentados a seguir, utilizou-se 10% da reação final transporte sem contém. Esta entrada"por cento" também ajuda a visualizar o tamanho do substrato precursor. O percentual representa uma quantidade conhecida, definida de substrato com o qual comparar transportado substrato contra e pode ser escalado a cima ou para baixo conforme necessário usando...

Discussão

Isolamento de cloroplasto e tilacoides

Quebra excessiva pode resultar em cloroplasto pobre isolamento e, portanto, pobre tilacoides rendimento após a separação do degradê. É melhor homogeneizar o tecido colhido suavemente, garantindo que todo o material está submersa antes de mesclagem e pulsação em 15 ciclos s até totalmente homogeneizado. Se necessário, use vários tiros mais curtos de mistura com menos tecido em cada rodada.

Todos os materiais que entram e...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este manuscrito foi preparado com financiamento pela divisão de ciências químicas, Geociências e Biociências, 408 escritório de ciências básicas da energia do departamento de energia através DE Grant-SC0017035

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Pisum sativum seedsSeedway LLC, Hall, NY8686 - Little Marvel
MiraclothCalbiochem, Gibbstown, NJ475855-1
80% AcetoneSigma, Saint Louis, MO67-64-1
Blender with sharpened bladesWaring CommercialBB155S
Polytron 10-35Fischer Sci13-874-617
PercollSigma, Saint Louis, MOGE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotorBeckman-Coulter8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotorSorvall8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIBSigma, Saint Louis, MO12/3/83Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIBSigma, Saint Louis, MO74804-12-9Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)Sigma, Saint Louis, MO9073-78-3Can be frozen in aliquots for future use
HEPESSigma, Saint Louis, MOH3375
K-TricineSigma, Saint Louis, MOT0377
SorbitolSigma, Saint Louis, MO50-70-4
Magnesium ChlorideSigma, Saint Louis, MO7791-18-6
Manganese ChlorideSigma, Saint Louis, MO13446-34-9
EDTASigma, Saint Louis, MO60-00-4
BSASigma, Saint Louis, MO9048-46-8
TrisSigma, Saint Louis, MO77-86-1
SDSSigma, Saint Louis, MO151-21-3
GlycerolSigma, Saint Louis, MO56-81-5
Bromophenol BlueSigma, Saint Louis, MO115-39-9
B-MercaptoethanolSigma, Saint Louis, MO60-24-2

Referências

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