Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Özet

Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.

Özet

Kloroplast vardır organelleri çok sayıda temel metabolik yollar, sorumlu yeşil bitkilerde fotosentez en önemlisi. Kloroplast içinde thylakoid membran sistemi ve fotosentetik pigment, reaksiyon merkezi kompleksleri ve elektron taşıyıcıları çoğu evler ışık bağımlı ATP sentezi için sorumludur. Kloroplast proteinlerin % 90'çekirdeğinde kodlanmış, sitozol tercüme ve daha sonra kloroplast ithal. Daha fazla protein taşıma içine veya thylakoid membran boyunca dört translocation yollar birini kullanır. Buraya, taşıma deneyleri üç enerji bağımlı cpTat, cpSec1 ve cpSRP-aracılı yolu ile birlikte bezelye (Pisum sativum), gelen taşıma-yetkili thylakoids yalıtım için yüksek verimli yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler thylakoid protein yerelleştirme, taşıma enerji ve protein translocation mekanizmaları biyolojik membranlar arasında ilgili deneyler etkinleştirin.

Giriş

Neredeyse tüm proteinaceous makine uygun kloroplast işlevi için sorumlu sitozol¹ile translocated gerekir. Kloroplast zarflar protein yüzeylerde dış membran (TOC) translocon ve iç zar (TIC)²translocon alınır. Daha fazla thylakoid için hedefleme membran ve lümen oluşur ikiz arginin translocation (cpTat)³, salgı (cpSec1)⁴, sinyal tanıma parçacık (cpSRP)⁵ve spontan ekleme yolları^{6 ile} . Yüksek verimli yalıtım fizyolojik aktif kloroplast ve thylakoid membran için bir yöntem enerji bilimi ve kinetik bir translocation olay, her yolu farklı taşıma mekanizmaları anlamak ve yerelleştirmek için ölçmek gerekli olan bir kloroplast altı ayrı bölmeleri hiçbirine ilgi belirli protein alt katman.

Kloroplast dan membran izolasyon taşıma enerji ölçümü etkileyen çevresel faktörler (örneğin, tuz ve substrat konsantrasyonu, ATP/GTP ve pH koşulların varlığı) üzerinde daha iyi deneysel kontrol sunar ve kinetik. Bu vitro ortamda aynı sebeplerden dolayı mekanik translocation ayrıntılarını keşif için oldukça rahat. Akıllı yazılım yerelleştirme kloroplast proteinlerin^7,8geliştirdi, Ayrıca, vitro taşıma deneyleri onay için daha hızlı bir yöntem mikroskobu tabanlı floresan deneyleri üzerinde bunu sağlarken genetik olarak kodlanmış bir floresan etiketi, bitki dönüşümü ve/veya belirli antikor gerektirir. Burada, iletişim kuralları her enerji bağımlı thylakoid translocation yolları için optimize taşıma deneyleri yanı sıra, kloroplast ve thylakoid izolasyonların bezelye (Pisum sativum) üzerinden için mevcut.

Protokol

1. ilk malzemeleri

1. 400 mL distile su içinde 3 saat yaklaşık 55 g bezelye ıslatın ve plastik bir tepsi içinde ekmek (35 cm x 20 cm x 6 cm) toprak vermikülit ince bir tabaka ile kaplı.
2. Tepsiyi bezelye 12/12 h açık/koyu (50 µE/m²s) döngüsü için 9-15 gün altında 20 ° C'de büyümek.
3. Protein substrat tercih edilen yöntemi göre hazırlayın.
   Not: 1 gibi yöntemleri kullanarak protein yüzeylerde hazırladık) vitro transkripsiyon arıtılmış plazmid gelen buğday tohumu özleri veya tavşan retikülosit lysates huzurunda [³H] kullanarak çeviri tarafından takip-lösin veya [³⁵S]-metiyonin, 2) vitro çeviri birleştiğinde transkripsiyon/çeviri takımı TnT gibi kullanarak kitleri Promega yukarıda da belirtildiği gibi radiolabeling ile ve 3) E. colioverexpressed protein saflaştırma. Radyoaktif vitro çeviri ürünler genellikle 50 mM soğuk amino asit taşıma tepkileri kullanmak için önceden ile söndürülür. Bu yöntemlerin her biri, her yeni protein substrat için genellikle bazı optimizasyon gerektirir. Eşleşmiş vitro sistem örneği için bkz: Ling ve Jarvis (2016)⁹.

2. kloroplast yalıtım ve miktar

Not: Sağlam kloroplast¹⁰yalıtım thylakoids hazırlanmasında ilk adımdır. Tüm malzemeler hazırlık sırasında soğuk tutulmalıdır. Bu adımda kırılma ciddi sonraki thylakoid verim sınırlayabilirsiniz gibi kloroplast, Resuspension hafifçe, ele alınmalıdır.

1. Çözümleri önceden hazırlayın.
   1. 2 x taşlama arabellek (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 4 mM EDTA, % 0,2 BSA.
   2. 2 x alma arabellek (2xIB): 100 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl₂.
      Not: 3 mM arasında değişen 10 mM den MgCl₂ konsantrasyonları gözlemlenebilir farklılıkları kullanılmaktadır.
2. Sürekli yoğunluk gradient Percoll 15 mL ve 2xGB 30,900 g sabit açılı Open End 4 ° C'de 30 dk de 15 mL karışımı ile fren kapalı centrifuging tarafından hazırlayın.
3. Yaklaşık 25 bin 9-15 gün eski bezelye hasat ve 95 mL 1xGB homojenize. Bir blender ile bilenmiş bıçak ya da bir Polytron kullanıldığını başarıyla. Bu karışımı Miracloth en az 2 kat bir huni ile filtre.
   Not: kök dokusu miktarını sınırlayarak gerekli değildir ancak homojenizasyon işlemi daha kolay, böylece uzun süreli karıştırma ile oluşabilir kloroplast kırılma azaltmak yapabilirsiniz.
4. Sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 5 min için 3000 g de cips ve yavaşça 1 mL 1xGB resuspend. Bir fırça en nazik resuspension tekniği olabilir.
5. Dikkatle Percoll degrade ve santrifüj 8000 g sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 10 dakika için de en üstünde yeşil süspansiyon kapalı tut ile katman.
6. Dikkatli bir şekilde taze bir tüpün içine sağlam kloroplast içeren alt yeşil bant hasat. Kurtarılan sağlam kloroplast 1800 g 4 ° C'de 5 min için sallanan bir kova Open End, spin, süpernatant atmak ve yavaşça Pelet 1xIB içinde resuspend. 1 ml 1xIB son resuspension ile her zaman 30 mL 1xIB resuspending bu yıkama bir kez daha tekrarlayın.
7. Klorofil (Chl) içeriği ölçmek için 5 mL % 80 aseton ve filtre Whatman 1 filtre kağıdı (nominal kalınlık 180 µm) üzerinden de tam resuspended kloroplast 10 µL karıştırın. 720 absorbans kaydetmek nm, 663 nm ve 645 bir spektrofotometre nm ve aşağıdaki formül¹¹kullanarak Chl konsantrasyonu hesaplayın:
   [Chl] mg/mL = [40.2* (bir₆₆₃ -₇₂₀) + 101.4* (bir₆₄₅ -₇₂₀)] * 0,1
8. Kloroplast 1 mg/ml 1xIB eşdeğerleriyle Chl ayarlayın.

3. Thylakoids yalıtım

Not: Thylakoids sağlam kloroplast hipotonik lizis tarafından hazırlanır. Bu kloroplast sorbitol eksik hipotonik arabellek için teşhir ederek elde edilir. İzole thylakoids herhangi bir translocation yolları raporlaması için kullanılabilir, ama ya cpSec1 ya da cpSRP yollarının araştırılması için ise stromal özü (SE) Ayrıca bu hazırlık sırasında izole edilmelidir.

1. Vaktinden önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. Hipotonik lizis arabellek: 50 mM K-Tricine veya K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl₂.
   2. 2 x ham Stroma arabellek (için konsantrasyon se): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl₂.
   3. Laemmli örnek arabellek (SDS-EDTA ile desteklenen sayfa için): 125 mM Tris pH 6.8, % 10 SDS, % 20 gliserol, 0,05 mg/mL bromophenol mavi, % 10 β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
2. SE kurtarma gerekmiyorsa, sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 6 dk 1000 g de sağlam kloroplast santrifüj kapasitesi
   1. Süpernatant atın ve 1 mg/ml hipotonik lizis tampon resuspend. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika, karanlıkta buz üzerinde kuluçkaya.
   2. Thylakoids 3200 g 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde de centrifuging tarafından yeniden elde etmek İki kez, her zaman 1-2 mL ile lizis arabellek resuspending thylakoids yıkayın. 1 mL 1xIB ile resuspend ve yukarıda olarak Chl kloroplast yalıtım protokolünde requantify.

4. stromal özü kurtarma ve konsantrasyon

1. SE kurtarma gerekli ise, 600 µL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler sağlam kloroplast bölün ve her tüpün içinde 6 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 1000 g de santrifüj kapasitesi
   Not: Bu 1.5 mL microcentrifuge tüpler, kullanırken kalan membranlar için nihai Pelet karışıklık önlemek için yardımcı olur uygun birimdir.
   1. 1 mg/ml Chl hipotonik lizis arabelleği resuspend ve karanlıkta adım 3.2.1 olduğu gibi 10 dk buz üzerinde kuluçkaya.
   2. Her tüpün içinde 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan 3200 x g , santrifüj kapasitesi ve 2 x ham Stroma arabellek eşit bir birimdeki yeni bir microcentrifuge tüp ışık yeşil veya sarı süpernatant aşağıdaki kloroplast lizis aktarmak.
   3. Thylakoids lizis arabelleği (yaklaşıldığıdır 0,5 mg/mL) 2 cilt ile yıkayın ve 8 dk için kova rotor 4 ° C'de sallanan içinde 3200 g de Santrifüjü tarafından toplamak 1 mg/mL Chl buzda 1xIB için resuspend.
   4. 42.000 g 4 ° C'de kalan membranlar kaldırmak için 30 dk için sabit açılı rotor de ham stroma santrifüj kapasitesi. Immunoblotting iç ve dış zarf proteinler için süpernatant saflığı doğrulamak için kullanılabilir.
   5. Birimin % 95'i küçük sarı-yeşil Pelet bozmadan her tüp sizden toplamak. Birimin her tüp sizden alınan not.
   6. Konsantre stromal özü (SE) hazırlamak için toplanan supernatants havuz ve 4 mL 30 kDa MWCO yoğunlaştırıcı filolarının kullanarak konsantre ol.
      Not: Bu şekilde hazırlanan SE kloroplast, 2.5 mg/mL Chl. türetilen stroma eşdeğerdir Gerekirse, SE on 5 mg/mL Chl eşdeğerleri konsantre olabilir. SE altın renkli ve yapışkan olacaktır. Kova rotor sallanan ile laboratuar efsane RT santrifüje, bunun hakkında 10 min başına mL konsantre gerekir.

5. cpTat yolu ile ulaşım

Not: CpSec1 veya cpSRP, aksine cpTat yolu çözünür bileşenler gerektirmez veya exogenously enerji kaynakları eklendi; Sadece ışık tahrik proton nedeni gerekli³güçtür. Bu nedenle, sadece izole protein thylakoids ve substrat, tahlil için gereklidir. Tipik yüzeylerde ( Şekil 1' de görüldüğü gibi) 17 kDa ara formları ve 23 kDa alt birimleri oksijen karmaşık gelişen, iOE17 ve iOE23, sırasıyla vardır, ama habercisi formlar, prOE17 ve prOE23, de başarılı bir şekilde taşınan. Öncü formları tüm önerebilirim N-terminal hedefleme sıra, ara formlar yalnızca sıra hedefleme thylakoid vardır.

1. CpTat ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 5 mM ATP 1xIB ve 8 mM dithiothreitol (DTT) 1xIB, buz üzerinde hazırlanan bir stoktan hazırlanan bir stoktan hazırlayın. ATP aydınlatma altında yürütülen, kesinlikle bu reaksiyon için gerekli değildir.
2. 1:30 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır olmadığı bir 1:1 2xIB ile seyreltme ilk, o zaman kullanmak 1:30 birim birim seyreltilmiş substrat / ulaşım karışımı hazırlamanız.
   Not: Substrat konsantrasyonu hazırlama yöntemi göre değişir. Overexpression için millimolar tutarları micromolar sağlayacak süre genellikle vitro hazırlıklar micromolar tutarlarına, nanomolar için izin verir. Autoradiography ve fluorography daha immunoblotting daha duyarlı olduğu gibi algılama yöntemleri de düşünülmelidir.
3. 80-100 µE/m²s omnivor aktif radyasyon (PAR) Oda sıcaklığında 10 dakika için süspansiyon aydınlatmak. Taşıma kinetik gerekiyorsa, oda sıcaklığında thylakoids ve tepki karışıma önceden equilibrate ve 30 dakikaya kadar aydınlatmak.
4. Buz gibi 1xIB 8-fold bir seyreltme ile taşıma reaksiyonu durdurmak ve 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de Santrifüjü tarafından thylakoids kurtarmak
5. Değil taşınan kalan substrat kaldırmak, thylakoid Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend ve 2 mg/mL thermolysin ve 10 mM CaCl 1xIB içinde₂ 6 µL eklenmesi tarafından dış protein sindirimi.
6. Proteaz tepki 40 min için buz üzerinde kuluçkaya ve sonra proteaz 25 mM EDTA 1xIB içinde hazırlanan birimle ikiye katlayarak gidermek.
7. Thylakoids 3200 g 4 ° C'de 5 min için bir microcentrifuge de centrifuging tarafından yeniden elde etmek Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.
8. Bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için 3200 g de santrifüj kapasitesi Laemmli örnek 10 mM EDTA ile desteklenmiş arabellek uygun bir hacmine resuspend. Genellikle yeterince 40 µL hacmi olduğunu substrat SDS-sayfa jel üzerinde tespit etmek ve gerektiğinde tekrar jelleri için örnek tasarruf sağlar.
9. Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosu yerleştirin ve SDS-PAGE tarafından analiz. Autoradiography, fluorography veya yerel olmayan veya epitope öğesini proteinlerin Western blot taşınan proteinler tespiti için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

6. cpSec1 yolu ile ulaşım

Not: CpSec1 translocon yoluyla ulaşım overexpression E. coli^14,15 üzerinden tedarik veya stroma yoğunlaşarak kurtarılan stromal protein cpSecA1^12,13, gerektirir. thylakoid yalıtım sırasında. Tipik bir substrat karmaşık gelişen oksijen (prOE33), 33 kDa alt birim Şekil 2' de görüldüğü gibi var.

1. CpSec1 ulaşım karışımı 0,33 mg/mL ile Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE veya rekombinant cpSecA1 ve 5 mM ATP buz üzerinde 1,5 μg hazırlamak ve kuluçkaya 10 dakikadır. Bir tipik taşıma tepki burada 72 μL, en fazla 60 μL SE eklenmesi nedeniyle gelen karışımdır.
   1. Rekombinant cpSecA1 SE yerine kullanılacaksa, saf cpSecA1 2xIB eşit bir birimdeki ayarlayın, daha sonra taşıma reaksiyonlar (Örneğin, 0,75 µg/µL) eklemek için uygun bir konsantrasyon oranında seyreltin.
      Not: uzun süreli depolama için cpSecA1 bir kontrollü, buzdolabında odada buz sonra arıtma depolanır donma onuntemsilcilerini etkinlik.
2. 1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.
3. Tepki altında 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 80-100 µE/m²s PAR. Yine, daha uzun zaman kinetik veya belirli yüzeyler için gerekli olabilir.
4. Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile
5. Thermolysin ile tedavi ve adımları 5.5 EDTA ile 5,7 gidermek.
6. 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve uygun bir birimdeki Laemmli örnek arabelleği 10 mM EDTA ile desteklenmiş Pelet resuspend. Su banyosu SDS-sayfa jel yükleme önce 10 dakika kaynar suda koyun.

7. cpSRP yolu aracılığıyla ekleme

Not: CpSRP54, cpSRP43 ve cpFtsY¹⁶cpSRP-aracılı entegrasyonu karmaşık proteinleri (LHCP) Şekil 3 ' te görülen hasat ışık gerektirir. Bu bileşenler için konsantre stromal özü, yoluyla taşıma tepki cpSec1 aktarma protokolü için açıklandığı gibi sağlanır.

1. CpSRP hazırlamak taşıma 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl eşdeğer SE ve 5 mM ATP buz ile karıştırın ve 10 dakikadır kuluçkaya.
2. 1:10 tanıtımı tarafından başlatmak taşıma birim birim taşıma substrat protein karışımı. Substrat protein 1xIB içinde hazır değil, 2xIB ile 1:1 seyreltme hazırlamak ve 1:10 birim birim seyreltilmiş protein taşıma karışıma ekleyin.
3. Reaksiyon, oda sıcaklığında 10 dk 80-100 µE/m²s PAR için kuluçkaya.
4. Işık tedavisi sonra 8-fold seyreltik 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de buz gibi 1xIB ve santrifüj tepkiler ile Süpernatant atın ve Pelet 1xIB 120 µL içinde resuspend.
5. Bölümlerde 5.7 ile 5.5 thermolysin ile tedavi. Thermolysin sindirim burada başarılı membran tümleştirme değerlendirmek için gereklidir. Kurtarılan thylakoids 5 mm EDTA 1xIB ve yeni bir tüp transferi 120 μL yıkayın.
6. 3200 g microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet tekrar 10 mM EDTA ile desteklenmiş 2 x Laemmli arabellek uygun bir hacmine resuspend. Su banyosu SDS-sayfa göre analiz önce 10 dakika kaynar suda koyun.
   Not: Olgun LHCP (mLHCP) entegrasyonunu proteaz korumalı bozulması ürün (mLHCP-D) görünümünü tarafından değerlendirilir yaklaşık 1,5-2 kDa uncleaved mLHCP¹⁷daha küçük.

Sonuçlar

Başarılı bir şekilde taşınan substrat miktarını ölçmek için bir veya daha fazla "yüzde giriş" Şerit eklemek kullanışlı olabilir. Aşağıda gösterilen veri için son aktarım tepki thylakoids olmadan yüzde 10'u kullanıldı. Bu "yüzde giriş" da habercisi substrat boyutunu görselleştirmek için yardımcı olur. Yüzde hangi substrat taşınan Karşılaştır substrat karşı için bilinen, tanımlı miktarını temsil eder ve gerekli başlangıçta kullanarak protein...

Tartışmalar

Kloroplast ve Thylakoid yalıtım

Aşırı kırılması neden olur zavallı kloroplast ayrılık degradedeki sonra yalıtım ve böylece zavallı thylakoid verim. Hasat doku yavaşça tüm malzeme karıştırma ve tamamen homojenize oluncaya kadar 15 s döngülerle darbe önce batık sağlayarak homojenize en iyisidir. Gerekirse, birden çok daha kısa tur her turda daha az doku ile harmanlama kullanın.

Hasat doku ile temas gelen tüm malzemeler soğutma izole kloropl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Acetone	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Blender with sharpened blades	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Can be frozen in aliquots for future use
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbitol	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Magnesium Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Manganese Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glycerol	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Bromophenol Blue	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoethanol	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2