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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons des protocoles ci-après pour l’isolement de haut rendement de thylakoïdes physiologiquement actives et essais de transport de protéine pour la translocation de chloroplastes twin arginine (cpTat), sécrétoire (cpSec1) et particules (cpSRP) voies de reconnaissance des signaux.

Résumé

Les chloroplastes sont les organites en plantes vertes chargées d’effectuer de nombreuses voies métaboliques essentielles, notamment de la photosynthèse. Dans les chloroplastes, le système de membrane de thylakoid abrite tous les pigments photosynthétiques, complexes de centre de réaction et la plupart des transporteurs d’électrons et est responsable de la synthèse d’ATP dépendante de la lumière. Plus de 90 % des protéines de chloroplastes sont codées dans le noyau, traduit dans le cytosol et ensuite importé dans le chloroplaste. Transport des protéines supplémentaire dans ou à travers la membrane des thylakoïdes utilise une des quatre voies de translocation. Nous décrivons ici une méthode de rendement élevé pour l’isolement des thylakoïdes transport-compétente de pois (Pisum sativum), ainsi que des essais de transport à travers les trois dépendant de l’énergie cpTat et cpSec1 cpSRP par l’intermédiaire des voies. Ces méthodes permettent des expériences relatives à la localisation des protéines thylakoïdes, transport énergétique et les mécanismes de la translocation de la protéine à travers les membranes biologiques.

Introduction

La quasi-totalité de la machinerie protéique responsable fonction chloroplastes appropriée doit être transloquée dans le cytosol1. L’enveloppe de chloroplaste, substrats protéiques sont importés par le translocon de la membrane externe (TOC) et le translocon de la membrane interne (TIC)2. Ciblage plus loin pour les thylakoïdes membrane et lumen se fait par les jumeaux arginine translocation (cpTat)3, la sécrétion (cpSec1)4, le signal reconnaissance particule (cpSRP)5et les voies d’insertion spontanée6 . Une méthode pour l’isolation de haut rendement des chloroplastes physiologiquement actives et les membranes thylakoïdes est nécessaire de mesurer le bilan énergétique et cinétique d’un événement de translocation, de comprendre les mécanismes de transport diversifié dans chaque voie et à localiser un substrat protéique particulière d’intérêt à l’un des six compartiments distincts du chloroplaste.

L’isolement des membranes des chloroplastes offre mieux expérimentale maîtrise des facteurs environnementaux (tels que les concentrations de sel et de substrat, la présence d’ATP/GTP et des conditions de pH) qui influent sur la mesure de l’énergétique du transport et cinétique. Cet environnement in vitro se prête à l’exploration des détails mécaniques de translocation pour les mêmes raisons. En outre, logiciel prédictif pour la localisation des protéines de chloroplastes s’est améliorée7,8, essais in vitro de transport prévoient une méthode plus rapide pour la confirmation sur la microscopie fluorescentes analyses que besoin d’une balise fluorescente génétiquement encodée, la transformation des plantes et/ou des anticorps spécifiques. Nous présentons ici les protocoles pour l’isolement des chloroplastes et des thylakoïdes des pois (Pisum sativum), ainsi que pour des essais de transport optimisés pour chacune des voies translocation thylakoïdes dépendant de l’énergie.

Protocole

1 les premiers matériaux

  1. Faire tremper environ 55 g de petits pois pendant 3 heures dans 400 mL d’eau distillée et ensuite semer dans un bac en plastique (35 cm x 20 cm x 6 cm) dans le sol recouvert d’une fine couche de vermiculite.
  2. Pousser le plateau de pois à 20 ° C sous cycle lumière/obscurité (50 µE/m2s) 12/12 h pendant 9 à 15 jours.
  3. Préparer le substrat protéique selon une méthode de choix.
    Remarque : Nous avons préparé les substrats protéiques en utilisant une variété de méthodes, dont 1) transcription in vitro à partir des plasmides purifiés suivie de la traduction à l’aide d’extraits de germe de blé ou de lysats de réticulocytes de lapin en présence de la [3H]-leucine ou [35S]-méthionine, 2) in vitro traduction, utiliser un kit de transcription/traduction couplé comme la TnT kits de Promega, avec radiomarquage comme ci-dessus et 3) purification de protéine surexprimée dans e. coli. Radioactive in vitro les produits de la traduction sont généralement trempées avec 50 mM acide aminé froide avant de les utiliser dans des réactions de transport. Chacune de ces méthodes nécessite généralement une optimisation pour chaque nouveau substrat protéique. Pour obtenir un exemple d’un système couplé en vitro , voir Ling et Jarvis (2016)9.

2. quantification et l’isolement des chloroplastes

Remarque : La première étape dans la préparation des thylakoïdes est l’isolement des chloroplastes intacts10. Tout le matériel doit être conservé au froid pendant la préparation. Remise en suspension des chloroplastes doit être manipulé délicatement, comme rupture à cette étape peut limiter sévèrement rendement subséquent thylakoïdes.

  1. Préparer la suite de solutions au préalable.
    1. 2 x tampon de polissage (2xGB) : 100 mM K-HEPES de pH 7,3, sorbitol de 660 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2 % de BSA.
    2. 2 x Import tampon (2xIB) : 100 mM K-Tricine ou K-HEPES pH 8,0, sorbitol de 660 mM, 8 mM MgCl2.
      Remarque : Les Concentrations de MgCl2 allant de 3 mM à 10 mM ont été utilisées sans différences observables.
  2. Préparer un gradient de densité continue par centrifugation d’un mélange de 15 mL de Percoll et 15 mL de 2xGB à 30 900 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 min à 4 ° C avec le frein au large.
  3. Récolter environ 25 g de petits pois 9-15 jour vieux et homogénéiser dans 95 mL de 1xGB. Un mixeur avec lames affûtés ou un Polytron ont été utilisées avec succès. Filtrer ce mélange à travers au moins 2 couches de Miracloth dans un entonnoir.
    Remarque : Limite la quantité de tissus de la tige n’est pas nécessaire mais peut faciliter le processus d’homogénéisation, réduisant ainsi les bris de chloroplaste qui peuvent survenir avec mélange prolongée.
  4. Pellet à 3 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 5 min à 4 ° C et doucement resuspendre dans 1 mL de 1xGB. Un pinceau peut être la technique plus douce de remise en suspension.
  5. Soigneusement la couche la suspension verte sur le dessus du gradient de Percoll et centrifuger à 8 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 10 min à 4 ° C avec le frein au large.
  6. Soigneusement la récolte la plus faible bande verte contenant des chloroplastes intacts dans un nouveau tube. Filer les chloroplastes intacts récupérés à 1 800 g dans un rotor oscillant de seau pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et doucement Resuspendre le culot dans 1xIB. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, resuspendant dans 30 mL de 1xIB chaque fois, avec la finale remise en suspension dans 1 mL de 1xIB.
  7. Afin de quantifier la teneur en chlorophylle (Chl), mélanger 10 µL de chloroplastes entièrement remises en suspension avec 5 mL d’acétone de 80 % et filtrer sur papier filtre de Whatman 1 (épaisseur nominale 180 µm). Mesurer l’absorbance à 720 nm, 663 nm et 645 nm dans un spectrophotomètre et calculer la concentration de Chl en utilisant la formule suivante11:
    [Chl] mg/mL = [40.2* (un663 –720) + 101.4* (un645 –720)] * 0,1
  8. Ajuster des chloroplastes à 1 mg/mL Chl équivalents avec 1xIB.

3. isolement des thylakoïdes

Remarque : Les thylakoïdes sont préparés par lyse hypotonique des chloroplastes intacts. Ceci est réalisé en exposant les chloroplastes dans un tampon hypotonique sans sorbitol. Les thylakoïdes isolés peuvent être utilisés pour doser une des voies de la translocation, mais extrait stromal (SE) doit également être isolée au cours de cette préparation si soit cpSec1 soit cpSRP voies doivent être analysés.

  1. Préparer avance les solutions suivantes.
    1. Tampon de lyse hypotonique : 50 mM Tricine-K ou K-HEPES pH 8,0, 8 mM MgCl2.
    2. 2 x brut Stroma tampon (pour la concentration du SE) : 100 mM K-HEPES de pH 8,0, sorbitol de 660 mM, 8 mM MgCl2.
    3. Tampon de Laemmli échantillon (par SDS-PAGE, complété avec de l’EDTA) : 125 mM Tris pH 6,8, SDS de 10 %, 20 % de glycérol, 0,05 mg/mL de bleu de bromophénol, 10 % de β-mercaptoéthanol, 10 mM EDTA.
  2. Si la récupération SE n’est pas nécessaire, centrifuger les chloroplastes intacts à 1 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 6 min à 4 ° C.
    1. Jeter le surnageant et remettre en suspension à 1 mg/mL dans le tampon de lyse hypotonique. Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 10 min, avec mixage occasionnels.
    2. Récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C. Laver les thylakoïdes deux fois, resuspendant avec 1 à 2 mL de tampon de lyse chaque fois. Remettre en suspension avec 1 mL de 1xIB et requantify Chl comme ci-dessus dans le protocole d’isolement de chloroplastes.

4. concentration et récupération extrait stromales

  1. Si la récupération SE est nécessaire, divisez les chloroplastes intacts en 600 µL d’extraits en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et centrifuger chaque tube à 1 000 g en balançant le seau du rotor pendant 6 min à 4 ° C.
    Remarque : Ce volume est pratique lorsque vous utilisez des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, qui contribue à prévenir les perturbations de la pastille éventuelle pour les membranes résiduelles.
    1. Remettre en suspension à 1 mg/mL Chl dans le tampon de lyse hypotonique et incuber sur glace dans l’obscurité pendant 10 min, comme au point 3.2.1.
    2. Centrifuger chaque tube à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C et la lumière verte ou jaune surnageant suivant chloroplastique lyse de transfert dans un nouveau tube de microcentrifuge avec un volume égal de 2 x brut Stroma tampon.
    3. Laver les thylakoïdes et 2 volumes de tampon de lyse (se rapprochant de 0,5 mg/mL) et de recueillir par centrifugation à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C. Remettre en suspension à 1 mg/mL Chl en 1xIB sur la glace.
    4. Centrifuger le stroma brut à 42 000 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 min à 4 ° C pour enlever les membranes résiduelles. Immunoblotting pour les protéines de l’enveloppe extérieure et intérieure peut être utilisé pour vérifier la pureté du liquide surnageant.
    5. Recueillir les 95 % du volume de chaque éprouvette sans déranger la petite pastille jaune-vert. Noter le volume prélevé chaque tube.
    6. Pour préparer l’extrait concentré stromal (SE), réunir les fractions surnageantes collectées et concentrer cinq fois à l’aide d’un concentrateur MWCO 4 mL 30 kDa.
      Remarque : SE préparé de cette manière est équivalent à stroma dérivé des chloroplastes à 2,5 mg/mL LCH. Si nécessaire, SE peut être dix fois concentré à 5 mg/mL Chl équivalents. SE sera la couleur dorée et visqueux. En centrifugeuse Legend RT du laboratoire avec godet rotor d’oscillation cela nécessite environ 10 min par mL concentré.

5. le transport par la voie de cpTat

Remarque : Contrairement aux cpSec1 ou cpSRP, la voie de cpTat ne nécessite pas de composants solubles ou exogène ajouté des sources d’énergie ; seule la force motrice de proton axée sur la lumière est nécessaire3. Par conséquent, seulement isolé thylakoïdes et substrat protéique sont nécessaires pour le dosage. Substrats typiques sont des formes intermédiaires de la 17 kDa (comme on le voit à la Figure 1) et 23 kDa sous-unités de l’oxygène en évolution complexe, iOE17 et iOE23, respectivement, mais les formes de précurseur, prOE17 et prOE23, peuvent aussi être transportées d’avec succès. Formes de précurseurs ont la bipartite N-terminaux ciblant séquence entière, tandis que des formes intermédiaires ont seulement les thylakoïdes ciblant la séquence.

  1. Préparer cpTat transport mix avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes, 5 mM ATP d’un stock en 1xIB et en 8 mM le dithiothréitol (DTT) provenant d’un stock établi en 1xIB, sur la glace. ATP n’est pas strictement requise pour cette réaction si effectuée en vertu de l’illumination.
  2. Transport initié par l’introduction de 01:30 volume par volume mélanger protéine substrat dans le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer un 1:1 dilution avec 2xIB tout d’abord, puis utilisez 01:30 volume par volume du substrat dilué dans le mélange de transport.
    Remarque : Les Concentrations de substrat variera selon la méthode de préparation. En général, en vitro préparations permettra nanomolaires micromolaires montants, tandis que la surexpression permettront pour micromolaire aux montants millimolaires. Méthodes de détection doivent aussi être considérées, autoradiographie et fluorographie étant plus sensibles qu’immunoblotting.
  3. Illuminer la suspension en 80-100 µE/m2s du rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) pendant 10 min à température ambiante. Si cinétique du transport est nécessaire, équilibrer les mix les thylakoïdes et réaction à température ambiante et illuminer jusqu'à 30 min.
  4. Arrêter la réaction de transport avec une dilution 8 fois de 1xIB glacé et récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.
  5. Enlever le substrat résiduelle qui n’a pas été transporté, resuspendre le culot de thylakoïdes dans 120 µL de 1xIB et digérer les protéines externes par l’addition de 6 µL de 2 mg/mL thermolysine et 10 mM CaCl2 en 1xIB.
  6. Incubez la réaction de protéase sur glace pendant 40 min et puis étancher la protéase en doublant le volume avec 25 mM EDTA préparé en 1xIB.
  7. Récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Laver les thylakoïdes récupérés dans 120 μL de 5 mM EDTA dans 1xIB et le transfert dans un nouveau tube.
  8. Centrifuger à 3 200 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans un volume suffisant de tampon de Laemmli additionné de 10 mM EDTA. Un volume de 40 µL est généralement suffisant pour détecter le substrat sur un gel SDS-PAGE et conserve l’échantillon pour répéter gelées lorsque cela est nécessaire.
  9. Placer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min et analyser par SDS-PAGE. Autoradiographie, fluorographie ou éponger occidental de protéines non indigènes ou épitope marqués ont été utilisées avec succès pour la détection des protéines transportées.

6. transports par la voie cpSec1

Remarque : Transport par le translocon cpSec1 nécessite la protéine stromal cpSecA112,13, qui peuvent être achetés par l’intermédiaire de surexpression dans e. coli14,15 ou récupérés en concentrant le stroma lors de l’isolation des thylakoïdes. Un substrat typique est la sous-unité de 33 kDa de l’oxygène en évolution complexe (prOE33), comme on le voit à la Figure 2.

  1. Préparer le mélange de transport cpSec1 avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes, 0,83 mg/mL Chl équivalent SE ou 1,5 μg de recombinaison cpSecA1 et ATP sur la glace, de 5 mM et incuber pendant 10 min. Un mélange réactionnel transport typique ici provient de 72 μL, jusqu'à 60 μL en raison de l’ajout de SE.
    1. Si cpSecA1 recombinante est utilisé au lieu de SE, ajuster cpSecA1 purifié avec un volume égal de 2xIB, puis dilué à une concentration commode d’ajouter les réactions de transport (p. ex., 0,75 µg/µL).
      Remarque : Pour le stockage à long terme, cpSecA1 se trouve sur la glace dans une chambre réfrigérée, contrôlée après purification comme gel abolit l’activité.
  2. Transport initier en introduisant 01:10 volume par volume mélanger protéine substrat pour le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer une dilution de 1:1 avec 2xIB et ajouter 01:10 volume par volume de la protéine diluée à la combinaison de transport.
  3. Incubez la réaction à la température ambiante pendant 10 min, avec 80 à 100 µE/m2s PAR. Encore une fois, plus longs peuvent être nécessaires à cinétique ou certains substrats.
  4. Après traitement par la lumière, diluer 8 fois avec glacee réactions 1xIB et centrifuger à 3200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.
  5. Traiter avec la thermolysine et étancher avec EDTA comme ci-dessus en étapes 5.5 à 5.7.
  6. Centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans un volume suffisant de tampon de Laemmli additionné de 10 mM EDTA. Placez au bain-marie bouillant pendant 10 min avant leur chargement sur gel SDS-PAGE.

7. insertion par le biais de la voie de cpSRP

Remarque : L’intégration induite par le cpSRP de la lumière des protéines complexes (LHCP) vus à la Figure 3 la récolte nécessite cpSRP54, cpSRP43 et cpFtsY16. Ces composants sont fournis à la réaction de transport grâce à l’extrait concentré de stroma, comme pour le protocole de transport de cpSec1.

  1. Préparer le cpSRP transport mix avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes et 0,83 mg/mL Chl SE équivalent 5 mM ATP sur la glace et incuber pendant 10 min.
  2. Transport initier en introduisant 01:10 volume par volume mélanger protéine substrat pour le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer une dilution de 1:1 avec 2xIB et ajouter 01:10 volume par volume de la protéine diluée à la combinaison de transport.
  3. Incubez la réaction à température ambiante pendant 10 min à 80 – 100 µE/m2s PAR.
  4. Après traitement par la lumière, diluer 8 fois avec glacee réactions 1xIB et centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 120 µL de 1xIB.
  5. Traiter avec la thermolysine comme ci-dessus dans les sections 5.5 à 5.7. Digestion de la thermolysine est nécessaire ici d’évaluer l’intégration réussie de membrane. Laver les thylakoïdes récupérés dans 120 μL de 5 mM EDTA dans 1xIB et le transfert dans un nouveau tube.
  6. Centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot à nouveau dans un volume approprié de 2 x Laemmli tampon additionné de 10 mM EDTA. Placez au bain-marie bouillant pendant 10 min avant l’analyse par SDS-PAGE.
    Remarque : Intégration des mature LHCP (mLHCP) est évaluée par l’apparition d’un produit de dégradation de protéase protégé (mLHCP-D) plus petit que le mLHCP clivés17d’environ 1,5 à 2 kDa.

Résultats

Pour mesurer la quantité de substrat transporté avec succès, il est utile d’inclure une ou plusieurs voies « pourcentage d’entrée ». Pour les données présentées ci-dessous, 10 % de la réaction de transport final sans thylakoïdes a été utilisé. Cette « entrée pourcentage » permet également de visualiser la taille du substrat précurseur. Le pourcentage représente une quantité connue, définie de substrat avec laquelle au substrat de comparer transportée contre ...

Discussion

Isolement des chloroplastes et des thylakoïdes

Rupture d’excessive peut entraîner dans les chloroplastes pauvres isolement et donc pauvre thylakoïdes rendement après la séparation du gradient. Il est préférable d’homogénéiser les tissus récoltés délicatement en veillant à ce que tout le matériel est immergé avant de mélanger et pulsé dans 15 s cycles jusqu'à ce que complètement homogénéisée. Si nécessaire, utilisez plusieurs tours plus courtes de mélanger avec moins de...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce manuscrit a été préparé avec le financement par la Division des Sciences chimiques, sciences de la terre et Biosciences, bureau 408 énergie des Sciences de base de l’US Department of Energy par Grant DE-SC0017035

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Pisum sativum seedsSeedway LLC, Hall, NY8686 - Little Marvel
MiraclothCalbiochem, Gibbstown, NJ475855-1
80% AcetoneSigma, Saint Louis, MO67-64-1
Blender with sharpened bladesWaring CommercialBB155S
Polytron 10-35Fischer Sci13-874-617
PercollSigma, Saint Louis, MOGE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotorBeckman-Coulter8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotorSorvall8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIBSigma, Saint Louis, MO12/3/83Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIBSigma, Saint Louis, MO74804-12-9Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)Sigma, Saint Louis, MO9073-78-3Can be frozen in aliquots for future use
HEPESSigma, Saint Louis, MOH3375
K-TricineSigma, Saint Louis, MOT0377
SorbitolSigma, Saint Louis, MO50-70-4
Magnesium ChlorideSigma, Saint Louis, MO7791-18-6
Manganese ChlorideSigma, Saint Louis, MO13446-34-9
EDTASigma, Saint Louis, MO60-00-4
BSASigma, Saint Louis, MO9048-46-8
TrisSigma, Saint Louis, MO77-86-1
SDSSigma, Saint Louis, MO151-21-3
GlycerolSigma, Saint Louis, MO56-81-5
Bromophenol BlueSigma, Saint Louis, MO115-39-9
B-MercaptoethanolSigma, Saint Louis, MO60-24-2

Références

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