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Method Article
Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).
Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.
Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol1umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)2eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)3, die sekretorischen (cpSec1)4, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)5, und die spontane Aufnahme Wege6 . Eine Methode für die High Yield Isolierung der physiologisch aktiven Chloroplasten und der Thylakoidmembran Membranen ist notwendig zur Messung der Energetik und Kinetik einer Translokation Veranstaltung, zu die vielfältigen Transportmechanismen in jeder Weg zu verstehen und zu lokalisieren eine bestimmtes Protein Substrat für eines der sechs verschiedene Fächer der Chloroplasten von Interesse.
Die Isolation der Membranen aus den Chloroplasten bietet bessere experimentelle Kontrolle über Umweltfaktoren (z. B. Salz und Substrat-Konzentrationen, die Anwesenheit von ATP/GTP und pH-Bedingungen), die die Messung der Transport Energetik zu beeinflussen und Kinetik. Dieser in-vitro- Umgebung eignet sich für die Erforschung der mechanistischen Details der Translokation aus den gleichen Gründen. Darüber hinaus während predictive Software für die Lokalisierung der Chloroplasten Proteine7,8verbessert hat, bieten in-vitro- Transport-Assays einer schnelleren Methode zur Bestätigung über Mikroskopie-basierte fluoreszierenden Proben, die erfordern Sie eine genetisch codierte fluoreszierende Tag, Pflanzentransformation und/oder spezifische Antikörper. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für Chloroplasten und Thylakoidmembran Isolationen von Erbsen (Pisum Sativum), sowie für Transport-Assays für jeden der die ENERGIEABHÄNGIGE Thylakoidmembran Translokation Wege optimiert.
1. erste Materialien
(2) Chloroplasten Isolation und Quantifizierung
Hinweis: Der erste Schritt bei der Vorbereitung des Thylakoids ist die Isolierung der intakten Chloroplasten10. Alle Materialien sollten während der Zubereitung kühl gelagert werden. Wiederfreisetzung des Chloroplasten sollte schonend behandelt werden, da Bruch bei diesem Schritt anschließenden Thylakoidmembran Ertrag erheblich einschränken kann.
3. Isolierung des Thylakoids
Hinweis: Thylakoids sind durch hypotone Lyse der intakten Chloroplasten vorbereitet. Dies wird erreicht, indem man die Chloroplasten in eine Hypotonische Puffer fehlt Sorbit. Isolierte Thylakoids eignet sich für die Prüfung eines die Translokation Wege muss, Stromale Extrakt (SE) jedoch auch isoliert während dieser Vorbereitung sind entweder cpSec1 oder CpSRP Wege untersucht werden.
4. Stromazellen Extrakt Erholung und Konzentration
5. transport durch die CpTat Weg
Hinweis: Im Gegensatz zu den cpSec1 oder CpSRP, der CpTat Weg erfordert nicht lösliche Bestandteile oder exogen Energiequellen hinzugefügt; nur der lichtgetriebenen Proton Motor ist erforderlich3. Daher nur vereinzelte Thylakoids und Substrat Protein sind erforderlich für den Assay. Typische Substrate sind Übergangsformen von den 17 kDa (wie in Abbildung 1zu sehen) bzw. 23 kDa-Untereinheiten der Sauerstoff entwickelt komplexe, iOE17 und iOE23, aber Vorläufer Formen, prOE17 und prOE23, kann auch erfolgreich transportiert werden. Vorläufer-Formen haben die gesamte zweiseitige N-terminale targeting-Sequenz, während Zwischenformen nur die Thylakoidmembran targeting Sequenz.
6. transport durch den cpSec1 Weg
Hinweis: Transport durch die cpSec1-Translocon erfordert die Stromazellen Protein cpSecA112,13, beschafft durch Überexpression in E. Coli14,15 oder durch die Konzentration Stroma wiederhergestellt werden können während der Thylakoidmembran isoliert. Eine typische Substrat ist der 33 kDa-Untereinheit des Sauerstoffs entwickelt komplexe (prOE33), wie in Abbildung 2dargestellt.
7. Aufnahme durch die CpSRP Weg
Hinweis: Die CpSRP-vermittelte Integration von Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) in Abbildung 3 zu sehen erfordert cpSRP54, cpSRP43 und CpFtsY16. Diese Komponenten sind die Transportreaktion durch konzentrierte Stromazellen Extrakt, für den cpSec1-Transport-Protokoll zur Verfügung gestellt.
Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere "prozentuale Eingabe" Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese "prozentuale Eingabe" hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert ...
Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation
Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.
Kühl...
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Dieses Manuskript wurde mit finanzieller Unterstützung durch die Abteilung von Chemie, Geowissenschaften und Biosciences, 408 Büro der Grundlagenwissenschaften Energie an das US Department of Energy durch Grant DE-SC0017035 vorbereitet
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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