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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Resumen

Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.

Introducción

El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas. 1 , 2 , 3 , 4 en los últimos diez años, el desarrollo de RNA de la célula única secuenciación (scRNA-Seq) ha permitido el estudio de la expresión génica en células individuales, proporcionando una visión en la diversidad de tipo de la célula. 5

La aparición de métodos escalables como tratamiento masivo en paralelo scRNA-Seq, ha proporcionado plataformas para tejidos heterogéneos de la secuencia, incluyendo muchas regiones del sistema nervioso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, métodos de disociación celular solo pueden llevar a la muerte celular así como los cambios experimentales en la expresión génica. 16 trabajo reciente ha adaptado métodos de secuenciación de unicelular para preservación de perfiles transcripcionales endógenos. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estrategias han sido particularmente convenientes para la detección inmediata temprana expresión del gen (IEG) después de estímulo sensorial o comportamiento. 3 , 4 en el futuro, esta estrategia podría también ser utilizada para estudiar los cambios dinámicos en los tejidos en Estados de enfermedad o en respuesta al estrés. De estos métodos, la secuencia solo núcleo RNA (snRNA-Seq) es un enfoque prometedor que implican estrés induce la disociación celular y puede ser utilizado en difícil de disociar del tejido (por ejemplo, la médula espinal), así como congelado tejido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de los métodos de aislamiento de los núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq típicamente utiliza el celular y la interrupción de tejido rápido lisis en condiciones de frío, centrifugación y separación de los núcleos de la ruina celular. 4 núcleos pueden ser aislados para la secuenciación de próxima generación descendente en múltiples plataformas de encapsulación de gotita de microfluidos. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite una instantánea de la actividad transcripcional de miles de células en un momento en el tiempo.

Existen múltiples estrategias para la liberación de los núcleos de las células antes de aislamiento y secuencia, cada uno con sus ventajas y desventajas. Aquí, describimos y comparar dos protocolos para permitir el aislamiento de los núcleos de la médula espinal adulta para el tratamiento masivo en paralelo abajo snRNA-Seq: lisis mecánica detergente y lisis hipotónica-mecánica. Lisis de detergente-mecánica proporciona la interrupción completa del tejido y un mayor rendimiento final de los núcleos. Mecánica-lisis hipotónica incluyen un grado controlable de disrupción del tejido, proporcionando una oportunidad para la selección de un equilibrio entre la cantidad y la pureza de la producción nuclear final. Estos enfoques proporcionan rendimiento comparable de RNA detectado un número de genes por núcleo y mediante perfiles tipo de la célula y también pueden tanto ser utilizados con éxito para snRNA-SS.

Protocolo

Todos los trabajos de animales se realizan según un protocolo aprobado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento Animal cuidado y uso. Equilibrado de las muestras de hombres y mujeres ICR/CD-1 tipo salvaje ratones, entre 8 y 12 semanas viejo, fueron utilizados para todos los experimentos. Ratones deben ser manejados con arreglo a directrices institucionales Animal Care y Comité de uso locales.

1. preparación de materiales y Buffers

  1. Preparar todos los búferes del día de uso y enfriado previamente en hielo (ver tabla 1).
    1. Si utiliza detergente industrial lisis, preparar el tampón de lisis detergente (> 500 μL por muestra), buffer de sacarosa bajo (> 6 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).
    2. Si utiliza lisis hipotónica-mecánica, preparar el tampón de lisis hipotónica (> 5 mL por muestra), medio HEB (> 5 mL por muestra), buffer sucrosa bajo (> 3 mL por muestra), buffer de densidad de sacarosa (> 12,5 mL por muestra) y la solución de resuspensión (> 1 mL).
    3. Añadir 25 μL de Ditiotreitol (DTT) otro 25 μL de la TDT a 25 mL de la solución de gradiente de densidad de sacarosa y 25 mL de la solución de sacarosa baja justo antes de iniciar el protocolo.
  2. Cubrir la superficie de disección con papel de aluminio para minimizar la contaminación de la muestra con las fibras de papel toallas o protectores de banco, que pueden obstruir microfluídicos canales utilizados para la captura de núcleos individuales.
  3. Rocíe la herramientas de disección y espacio del Banco con una solución de descontaminación de Rnasa. Además, rocíe el interior del tubo de Homogeneizadores Dounce (si está usando la lisis celular de detergente-mecánica) y Oak Ridge tubo con una solución de descontaminación de Rnasa. Enjuague el tubo con agua ultrapura, libre de ARNasa Dounce y Oak Ridge.
  4. Enfriar previamente todos los tubos (50 mL cónico, roble Ridge) y tubos de Homogeneizadores Dounce en hielo.
  5. Fuego polaco una serie de Pipetas Pasteur (si está usando lisis hipotónica mecánica celular).

2. preparación de la médula espinal

  1. Si se utiliza tejido fresco, eutanasia el ratón por la inhalación de CO2 . Después de eutanasia, rocíe la capa del ratón con etanol al 70% para minimizar la contaminación del cabello en la muestra.
  2. Decapitar el ratón con tijeras quirúrgicas agudos, libre de ARNasa. A continuación, levantando suavemente los abdominales la piel con pinzas y hacer una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.
  3. Desentrañan el ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo con unas pinzas. No use toallas de papel para limpiar el área o a quitar órganos, esto puede introducir contaminantes. Con unas tijeras, cortar la columna vertebral entre las vértebras L2 y L3 de la columna.
    Nota: Con la práctica, este paso se logra en menos de 30 segundos.
    1. Para expulsar la médula espinal, colocar una jeringa de 3 mL con PBS helado con una aguja de 25 G 1/4 pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja y presione el émbolo para expulsar la médula rostral. Lugar la médula espinal en una placa de Petri con PBS helado.
    2. En este punto, congelar el tejido y conservarlo a-80 ° C o utilizar inmediatamente para detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).
  4. Si usando tejido congelado, mantener el tejido en hielo seco, proceder a detergente-mecánica (paso 3) o lisis de hipotónica-mecánica (paso 4).

3. lisis de la célula detergente industrial

  1. Lugar de la médula espinal lumbar en un homogeneizador de Dounce previamente enfriado y añadir 500 mL previamente enfriada tampón de lisis detergente.
    Nota: Una médula espinal lumbar de ratón es 325,5 mg ± mg 63,9 error estándar de la media (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g de tejido se puede utilizar con éxito.
  2. Dounce con 5 golpes de mortero de una (Maja 'flojo'), luego 5 a 10 golpes de mortero B ('tight' Maja). Evite levantar el homogenizador de la solución de lisis entre trazos y evitar la introducción de burbujas.
  3. Coloque un filtro de 40 mm sobre un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada y prewet con 1 mL de tampón de sacarosa bajo.
  4. Añadir 1 mL de tampón baja sacarosa al Dounce homogeneizador que contiene los núcleos crudos en el buffer de lisis y suavemente mezclar mediante pipeteo de 2 – 3 veces.
  5. Pasar la preparación de núcleos crudo sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.
  6. Traspasar un adicional 1 mL de tampón de sacarosa bajo el tamiz de 40 mm, que el volumen final de 3 mL de la solución de sacarosa baja y 500 mL de la solución de lisis.
  7. Repita los pasos 3.1-3.6 Si la combinación de múltiples cables, puesta en común en el mismo tubo cónico.
  8. Centrifugar la muestra a 3.200 x g por 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decantar el sobrenadante. Proceda al paso 5.

4 lisis celular hipotónica-mecánico

  1. Lugar de la médula espinal lumbar en 5 mL de la solución de lisis hipotónica en un plato de cultivo de tejidos. Usar el extremo despuntado de tijeras primavera atraviesan la médula espinal, luego usar primavera tijeras para cortar el cable en trozos de 3 – 4 mm, pero no pique.
    Nota: 50 mg a 1,5 g de tejido puede ser utilizado con éxito.
  2. Incubar en hielo por 15 min, Remolino 2 – 3 veces.
  3. Añadir 5 mL de medio HEB para diluir el buffer de lisis hipotónica.
  4. Triturate el tejido 10 veces con una pipeta serológica de 5 mL o hasta que todas las piezas del tejido mover suavemente a través de la abertura de la pipeta.
  5. Triturate con una serie de tres pipetas de Pasteur fuego pulido con diámetros progresivamente más estrechos (~ 900-600 mm).
    1. Para cada pipeta triturate 5 - 15 veces, permite el tejido colocar, quitar 1 – 2 mL del sobrenadante que contiene núcleos disociados y pasar por un tamiz de 40 mm en un tubo cónico de 50 mL previamente enfriada.
    2. Después de trituración con la pipeta Pasteur más pequeño tamaño, asegúrese de que el homogeneizado fluye suavemente a través de la punta de la pipeta. Pase la solución restante sobre el tamiz de 40 mm en el tubo cónico de 50 mL.
      Nota: El número total de trituraciones se puede ajustar como desee. Las meninges de la médula espinal de ratón serán siendo, pero es importante triturate cualquier trozos visibles de médula espinal. Pase el homogeneizado quedan sobre el tamiz de 40 m. Evitar la introducción de burbujas durante la trituración.
  6. Centrifugue la muestra filtrada a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Una vez finalizada la centrifugación, decante y descarte el sobrenadante. Proceda al paso 5.

5. homogeneización y gradiente de densidad de sacarosa

  1. Después de paso 3 o 4, Resuspender el precipitado con 3 mL de solución de sacarosa bajo. Agitar suavemente para eliminar el sedimento de la pared para facilitar la resuspensión. Deje que la muestra se sientan en hielo durante 2 minutos y transferir la suspensión a un tubo de Oak Ridge.
  2. Con el homogeneizador en posición 1, homogeneizar los núcleos en tampón baja sacarosa durante 15 – 30 s., manteniendo la muestra en hielo.
    Nota: Utilice 15 s si usa uno medular lumbar o 30 s si agruparon muestras o una médula espinal entera.
  3. Utilizando una pipeta serológica, capa 12,5 mL de solución de sacarosa de densidad debajo el homogeneizado de buffer sucrosa bajo, teniendo cuidado de no para crear una burbuja que altera las capas de densidad.
  4. Centrifugar los tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.
  5. Una vez finalizada la centrifugación, inmediatamente decante el sobrenadante en un movimiento de cajón.
    Nota: Un volumen residual (menos de 400 mL) de tampón de sacarosa se puede desechar si se desea producir un volumen más bajo y el limpiador de la muestra final, pero este volumen residual contienen núcleos y puede ser conservado para maximizar el rendimiento de los núcleos.
  6. Utilizando 100 mL - 1 mL de solución de resuspensión, resuspender los núcleos restantes en la pared. Evitar la mielina 'entrecejo' que sigue con la preparación base de detergente.
  7. Los núcleos del filtro a través de un filtro de tamaño de poro de 30 – 35 mm y recoger en un tubo previamente enfriado.
  8. Determinar los núcleos rendimiento utilizando un hemocitómetro para contar núcleos bajo un objetivo de X 10.
    Nota: Puede añadirse azul de tripano para visualizar núcleos, que deben aparecer en azul. Tenga en cuenta la cantidad de detritos celulares.
  9. Proceda al paso 6 o 7.

6. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma académica7

  1. Realizar la secuenciación masivamente paralela snRNA (p. ej., gota-Seq) método como se ha descrito7 con las siguientes modificaciones:4
    1. Ajustar los núcleos a una concentración final de 225 núcleos por mL.
    2. Preparar cuentas con código de barras en una concentración de 250 granos por mL.
    3. Preparar el tampón de lisis con sarkosyl de 0,7%.
    4. Ajustar las tasas de flujo a 35 mL / min para granos, 35 mL por minuto por núcleos y 200 mL por minuto de aceite.

7. masivamente paralelo secuenciación del snRNA: plataforma comercial26

  1. SnRNA-secuenciación masivamente paralela utilizando la plataforma comercial (p. ej., cromo única célula Gene expresión solución) de realizar productos de acuerdo de las instrucciones del fabricante de la26 con la siguiente modificación:
    1. Tras reverso-transcripción, añadir un ciclo PCR adicionales a la cantidad calculada de ciclos para la amplificación del cDNA basado en la recuperación de la célula objetivo para compensar la disminución del cDNA de los núcleos en comparación con las células.

Resultados

Aquí, realizamos aislamiento de núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto para la descendente secuencia de RNA masivamente paralela. El protocolo participan tres componentes principales: tejido celular e interrupción lisis, homogeneización y sacarosa densidad centrifugación (figura 1). En cuestión de segundos la lisis mecánica de detergente rindió una preparación cruda de núcleos con un gran número de núcleos, así como desechos celulares...

Discusión

El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes ...

Divulgaciones

No tenemos conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
SucroseInvitrogen15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)Gibco15630-080
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
MgAcSigma AldrichM5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)CorningMT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich10197777001Add DTT just prior to use
Triton-XSigma AldrichT8787
Nuclease-free waterCrystalgen221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)Sigma AldrichT2194
5 M NaClSigma Aldrich59222C
1 M MgCl2Sigma AldrichM1028
Nonidet P40Sigma Aldrich74385
Hibernate-AGibcoA12475-01
Glutamax (100x)Gibco35050-061
B27 (50x)Gibco17504-044
1x PBSCrystalgen221-133-10
0.04% BSANew England BiolabsB9000S
0.2 U/μL RNAse InhibitorLucigen30281-1
Oak Ridge Centrifuge TubeThermo Scientific3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)Kimble885303-002
Glass large clearance pestleKimble885301-0002
Glass small clearance pestleKimble885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax HomogenizerIKA3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)IKA3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
40 μm cell strainerFalcon352340
MACS SmartStrainers, 30 μmMiltenyi Biotec130-098-458
Conical tubesDenville Scientific1000799
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle RotorThermo Fisher Scientific75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mLDenville ScientificP7127
HemocytometerDaigger ScientificEF16034F
Chemgenes Barcoding BeadsChemgenesMacosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)Corning352235
MoFlo Astrios Cell SorterBeckman CoulterB25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10X Genomics120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns10X Genomics120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)Corning353002

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

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