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Erratum Notice

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摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 快速隔离高品质的核从新鲜或冷冻组织的下游大规模平行 RNA 测序。我们包括洗涤剂-机械和低渗-机械组织破坏和细胞裂解选择, 两者都可用于核分离。

摘要

探测单个细胞的基因表达可以识别细胞类型和细胞状态。单细胞 RNA 测序已成为研究细胞转录剖面的有力工具, 特别是在中枢神经系统等异质组织中。然而, 单细胞测序所需的分离方法可能导致基因表达和细胞死亡的实验改变。此外, 这些方法一般仅限于新鲜组织, 因此限制了对档案和生物银行材料的研究。单核 RNA 测序 (snRNA) 是转录研究的一种有吸引力的替代方法, 因为它能够准确地识别细胞类型, 允许对被冻结或难以分离的组织进行研究, 并减少离体诱导的转录。在这里, 我们提出了一个高通量协议, 用于快速隔离用于下游 snRNA 的原子核。这种方法可以从新鲜或冰冻的脊髓样本中分离细胞核, 并可与两个大型平行液滴封装平台结合使用。

引言

神经系统由不同种类的细胞组成, 它们显示出各种形态、生化和电生理特性。虽然大量 RNA 测序对于确定不同条件下基因表达的组织范围变化是有用的, 但它排除了在单细胞水平上检测转录变化的方法。在单细胞转录分析的最新进展, 使异质细胞的分类根据他们的分子曲目的功能组, 甚至可以利用来检测一组最近活跃的神经元。1,2,3,4在过去十年中, 单细胞 RNA 测序 (scRNA) 的发展使得对单个细胞的基因表达进行研究, 从而为细胞类型的多样性提供了一种观点。5

大规模并行 scRNA 等可扩展方法的出现, 为序列异构组织 (包括中枢神经系统的许多区域) 提供了平台。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15然而, 单细胞分离方法可导致细胞死亡以及基因表达的实验改变。16最近的工作已经适应了单细胞测序方法, 以便保存内源转录剖面。1,3,4,17,18,19这些策略特别适用于在感官刺激或行为之后检测即时早期基因 (腿部) 表达。3,4在未来, 这一策略也可用于研究疾病状态或对压力的反应组织的动态变化。在这些方法中, 单核 RNA 测序 (snRNA) 是一种很有前途的方法, 它不涉及应力诱导细胞的分离, 也可用于难以剥离的组织 (如脊髓) 以及冷冻组织。4,17,18,19根据以前的细胞核隔离方法改编, 20、21、22、23、25 snRNA 通常利用快速组织破坏和细胞在寒冷条件下裂解, 离心, 并从细胞碎片中分离细胞核。在多个微流控液滴封装平台上, 可隔离4核以进行下游下一代测序。4,7,24,25此方法允许在一个时刻的数以千计的细胞的转录活动的快照。

在分离和测序之前, 有多种策略可以从细胞中释放细胞核, 各有各自的优缺点。在这里, 我们描述和比较两个协议, 以实现从成人脊髓的细胞核隔离的下游大规模平行 snRNA: 洗涤剂-机械裂解和低渗-机械裂解。洗涤剂-机械裂解提供完整的组织破坏和更高的最终产量的细胞核。低渗机械裂解包括可控制的组织破坏程度, 为选择最终核产量的数量和纯度之间的平衡提供了机会。这些方法提供了可比的 RNA 产量, 每核检测到的基因数量和细胞类型的分析, 也可以成功地用于 snRNA。

研究方案

所有的动物工作都是按照国家神经疾病研究所和中风动物护理和使用委员会批准的一项议定书进行的。男性和女性 ICR/CD-1 野生型小鼠的平衡样本, 在8和12周龄之间, 用于所有实验。应按照当地机构动物照料和使用委员会的指导方针处理小鼠。

1. 材料和缓冲器的制备

  1. 准备所有的缓冲使用当天和冰前冷却 (见表 1)。
    1. 如果使用洗涤剂-机械裂解, 请准备洗涤剂裂解缓冲液 (每样品 > 500 微升), 低蔗糖缓冲液 (每样本 > 6 毫升), 蔗糖密度缓冲液 (> 每样品12.5 毫升) 和再悬浮溶液 (> 1 毫升)。
    2. 如果使用低渗-机械裂解, 请准备非低渗裂解缓冲液 (每样品 > 5 毫升), 希伯来培养基 (> 5 毫升每样本), 蔗糖缓冲液 (> 每样3毫升), 蔗糖密度缓冲液 (> 每样12.5 毫升), 再悬浮溶液 (> 1 毫升)。
    3. 加入25微升的 dithiothreitol (DTT) 到25毫升的低蔗糖缓冲液和另一个25微升的 DTT 到25毫升的蔗糖密度梯度缓冲区刚刚开始协议之前。
  2. 用铝箔覆盖解剖表面, 最大限度地减少样品与纸巾或工作台保护器纤维的污染, 从而堵塞用于捕获单个原子核的微流体通道。
  3. 使用核糖核酸酶净化解决方案喷涂解剖工具和工作台空间。此外, 喷雾内冲击均质管 (如果使用洗涤剂-机械细胞裂解) 和橡木脊管与核糖核酸酶净化解决方案。用超纯的无 rna 水冲洗冲击和橡木脊管。
  4. 预冷所有收集管 (50 毫升圆锥, 橡木脊) 和冲击均质管在冰上。
  5. 火焰抛光一系列的巴斯德移液器 (如果使用低渗-机械细胞裂解)。

2. 脊髓的制备

  1. 如果使用新鲜组织, 通过 CO2吸入安乐死鼠标。在安乐死之后, 用70% 乙醇喷涂老鼠的外衣, 以尽量减少样品中的毛发污染。
  2. 斩首的小鼠用锋利的无 rna 的手术剪刀。接下来, 用镊子轻轻举起腹部皮肤, 沿着身体的长度切开切口, 露出内脏。
  3. 用镊子从体腔中取出内脏, 剔骨鼠标。请勿使用纸巾清洁区域或移除器官, 因为这可能会引入污染物。用剪刀剪 L2 和 L3 脊柱之间的椎柱。
    注意: 实践中, 这一步可以在不到30秒内实现。
    1. 要弹出脊髓, 请用 25 G ¼英寸针将含有冰冷 PBS 的3毫升注射器装上。将针头的尖端放到脊椎柱的骶端。用两根手指捏住椎骨, 在针头尖端周围建立一个紧密的密封圈, 然后按下柱塞以弹出脊髓 rostrally。将脊髓置于培养皿中, 使用冰冷 PBS。
    2. 此时, 冷冻组织和储存在-80 摄氏度或立即使用洗涤剂-机械 (步骤 3) 或低渗机械 (步骤 4) 裂解。
  4. 如果使用冷冻组织, 在干冰上保持组织, 继续洗涤剂-机械 (步骤 3) 或低渗-机械 (步骤 4) 裂解。

3. 洗涤剂-机械细胞裂解

  1. 将腰部脊髓置于预冷冲击均质机中, 加入500毫升预冷洗涤剂裂解缓冲液。
    注: 鼠标腰椎脊髓是325.5 毫克±63.9 毫克标准误差平均值 (SEM, N = 4)。50 mg–1.5 g 的组织可以成功地使用。
  2. 冲击5冲程的杵 A (' 松散 ' 杵), 然后5-10 冲程杵 B (' 紧 ' 杵)。避免在冲程之间将匀质机从裂解液中提起, 避免引入气泡。
  3. 将一个40毫米的过滤器放在预冷的50毫升锥形管上, prewet 1 毫升低蔗糖缓冲液。
  4. 将1毫升低蔗糖缓冲液添加到含有裂解缓冲液中粗核的冲击均质机中, 并通过移液的时间轻轻混合。
  5. 通过40毫米过滤器的粗核准备到预冷的50毫升锥形管。
  6. 在 40 mm 过滤器上通过额外的1毫升低蔗糖缓冲液, 使最终体积降低到3毫升的低蔗糖缓冲液和500毫升裂解缓冲液。
  7. 重复步骤3.1–3.6 如果组合多个线, 池在同一个锥形管。
  8. 将样品离心 3200 x g, 10 分钟, 4 摄氏度。离心完成后, 醒酒上清液。继续执行步骤5。

4. 低渗-机械细胞裂解

  1. 将腰椎脊髓在5毫升的低渗裂解缓冲液中的组织培养皿。用弹簧剪刀的钝端一分为二脊髓, 然后用弹簧剪刀把绳子切成3–4毫米的碎片, 但不要碎。
    注意:50 mg–1.5 g 的组织可以成功地使用。
  2. 在冰上孵育15分钟, 旋转的次数。
  3. 加入5毫升的希伯来培养基稀释低渗裂解缓冲液。
  4. 颠倒组织10次与5毫升血清移液器, 或直到所有的组织的部分顺利通过移液器的打开。
  5. 颠倒带有一系列三火焰抛光的巴斯德移液器, 直径逐渐变窄 (~ 900–600 mm)。
    1. 对于每一个移液器, 颠倒5-15 次, 允许组织沉降, 去除含有分离细胞核的上清液, 并将40毫米滤网传递到预冷的50毫升锥形管中。
    2. 使用最小尺寸的巴斯德移液器研制后, 确保匀浆通过移液器尖端顺畅流动。将剩余的溶液通过 40 mm 过滤器放入50毫升锥形管中。
      注: 粉末的总数量可以根据需要进行调整。小鼠脊髓的脑膜将保留, 但颠倒任何可见的脊髓块是很重要的。通过40米过滤器上剩余的匀浆。避免在研制期间引入气泡。
  6. 离心过滤样品在 1000 x g 10 分钟在4摄氏度。离心完成后, 醒酒并丢弃上清液。继续执行步骤5。

5. 均质和蔗糖密度梯度

  1. 在步骤3或4后, 用3毫升低蔗糖缓冲液重悬颗粒。轻轻旋转, 从墙上取出颗粒, 以方便再悬浮。让样品坐在冰上2分钟, 将悬浮液转移到橡木脊管上。
  2. 在设置1中使用均质器, 在15–30的低蔗糖缓冲液中匀质核, 保持样品在冰上。
    注意: 使用十五年代如果使用一个腰椎脊髓或三十年代如果使用共用样本或整个脊髓。
  3. 使用血清移液器, 将12.5 毫升的密度蔗糖缓冲液放在低蔗糖缓冲匀浆下, 注意不要产生扰乱密度层的气泡。
  4. 离心管在 3200 x g 20 分钟在4摄氏度。
  5. 离心完成后, 立即醒酒上清液。
    注: 如果需要, 可以丢弃蔗糖缓冲液的残余体积 (小于400毫升), 以产生更低的体积和更清洁的最终样品, 但此残余体积确实含有原子核, 可以保留以最大限度地提高细胞核产量。
  6. 使用100毫升-1 毫升的再悬浮溶液, 重悬在墙上剩余的原子核。避免以洗涤剂为基础的制剂中残留的髓鞘 ' 皱眉 '。
  7. 通过 30–35 mm 孔径滤网过滤细胞核, 并在预冷管中收集。
  8. 用血细胞计数器计算原子核在10X 目标下的生成量。
    注意: 台盼蓝可以添加到可视化原子核, 这应该出现蓝色。注意细胞碎片的数量。
  9. 继续执行步骤6或7。

6. 大规模平行 snRNA 排序: 学术平台7

  1. 按照前面描述的7执行大规模并行 snRNA 排序 (例如, Drop Seq) 方法, 并进行以下修改:4
    1. 将细胞核调整为每毫升225核的最终浓度。
    2. 在每毫升250颗珠子的浓度下制备条形码珠。
    3. 用 0.7% sarkosyl 制备裂解缓冲液。
    4. 调整流速为35毫升每分钟的珠子, 35 毫升每分钟的原子核, 和200毫升每分钟油。

7. 大规模平行 snRNA 排序: 商业平台26

  1. 根据制造商的说明26使用商业平台 (如铬单细胞基因表达式解决方案) 产品进行大规模并行 snRNA 排序, 并进行以下修改:
    1. 反向转录后, 添加一个额外的 PCR 周期到计算的周期数量的 cDNA 放大基于目标细胞恢复, 以补偿从细胞核的减少 cdna 与细胞相比。

结果

在这里, 我们执行了从成年小鼠腰椎脊髓的细胞核分离, 用于下游大规模平行 RNA 测序。该协议涉及三主要组成部分: 组织中断和细胞裂解、均质化和蔗糖密度离心 (图 1)。在几秒钟内, 洗涤剂-机械裂解产生了一个粗核制备与大量的细胞核, 以及蜂窝和组织碎片 (图 2A, 表 2)。十五分钟后, 低渗-机械裂解产生了一个粗糙?...

讨论

本协议的最终目标是分离含有高质量 RNA 的细胞核, 用于下游转录分析。为了分析脊髓中的所有细胞类型, 我们调整了 snRNA 方法。起初, 我们发现典型的细胞分离方法对单细胞 RNA 测序无效, 因为脊髓神经元特别容易受到细胞死亡的影响。此外, 细胞分离方法诱导各种活动和应激反应基因的表达多达数个百倍。3,4,16考虑到单细胞制...

披露声明

我们没有利益冲突的披露。

致谢

这项工作得到了机构 (1 齐亚 NS003153 02) 和 NIDCD (1 齐亚 DC000059 18) 的校内程序的支持。我们感谢李和杜伯特的技术支持和有益的讨论, 以及 c. 凯特审查手稿。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
SucroseInvitrogen15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)Gibco15630-080
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
MgAcSigma AldrichM5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)CorningMT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich10197777001Add DTT just prior to use
Triton-XSigma AldrichT8787
Nuclease-free waterCrystalgen221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)Sigma AldrichT2194
5 M NaClSigma Aldrich59222C
1 M MgCl2Sigma AldrichM1028
Nonidet P40Sigma Aldrich74385
Hibernate-AGibcoA12475-01
Glutamax (100x)Gibco35050-061
B27 (50x)Gibco17504-044
1x PBSCrystalgen221-133-10
0.04% BSANew England BiolabsB9000S
0.2 U/μL RNAse InhibitorLucigen30281-1
Oak Ridge Centrifuge TubeThermo Scientific3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)Kimble885303-002
Glass large clearance pestleKimble885301-0002
Glass small clearance pestleKimble885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax HomogenizerIKA3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)IKA3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
40 μm cell strainerFalcon352340
MACS SmartStrainers, 30 μmMiltenyi Biotec130-098-458
Conical tubesDenville Scientific1000799
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle RotorThermo Fisher Scientific75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mLDenville ScientificP7127
HemocytometerDaigger ScientificEF16034F
Chemgenes Barcoding BeadsChemgenesMacosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)Corning352235
MoFlo Astrios Cell SorterBeckman CoulterB25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10X Genomics120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns10X Genomics120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)Corning353002

参考文献

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

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