JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Здесь мы представляем протокол быстро изолировать высокого качества ядер из свежих или замороженных ткани для вниз по течению массивно параллельной последовательности РНК. Мы включать моющих средств механические и гипотонической механические ткани нарушения и ячейки лизис вариантов, оба из которых могут быть использованы для изоляции ядер.

Аннотация

Зондирование экспрессии генов отдельной ячейки позволяет идентифицировать тип ячейки и ячейки состояния. Одноместный клеточной РНК последовательности стала мощным инструментом для изучения транскрипционный анализ профиля клеток, особенно в разнородных тканей, таких как центральной нервной системы. Однако диссоциация методы, необходимые для отдельной ячейки виртуализации может привести к экспериментальные изменения в ген выражение и клеток смерть. Кроме того эти методы обычно ограничены свежие ткани, тем самым ограничивая исследования архивных и био банк материала. Последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является привлекательной альтернативой для транскрипционный анализ исследований, учитывая, что он точно идентифицирует типы клеток, позволяет исследование ткани, замороженные или трудно отделить, и уменьшает диссоциации индуцированной транскрипция. Здесь мы представляем высок объём протокол для быстрой изоляции ядер для вниз по течению мяРНК Seq. Этот метод позволяет изоляции ядер из свежих или замороженных спинного образцов и могут быть объединены с двумя платформами инкапсуляции массивно параллельной капелька.

Введение

Нервная система состоит из гетерогенных групп клеток, которые отображают разнообразные морфологических, биохимических и электрофизиологических свойств. В то время как основная РНК последовательности был полезным для определения ткани-изменения в экспрессии генов в различных условиях, он исключает обнаружения transcriptional изменений на уровне одной ячейки. Последние достижения в одну ячейку транскрипционный анализ анализ позволили классификации разнородные клеток в функциональные группы на основании их молекулярные репертуар и даже могут быть использованы для обнаружения наборы нейронов, которые были недавно активных. 1 , 2 , 3 , 4 за последние десять лет, развитие одноклеточного РНК последовательности (scRNA-Seq) позволило изучение экспрессии генов в отдельных клетках, обеспечивая представление в разнообразии типа клеток. 5

Появление масштабируемых подходов, таких как массивно параллельной scRNA-Seq, предоставил платформ для последовательности разнородных тканей, включая многие регионы центральной нервной системы. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, методы диссоциации одной ячейке может привести к гибели клеток, а также экспериментальные изменения в экспрессии генов. 16 последние работы адаптировала одну ячейку последовательности методов включения сохранения эндогенного транскрипционный анализ профиля. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 эти стратегии были особенно подходит для обнаружения немедленно ранних экспрессии генов (IEG) после сенсорные стимулы или поведение. 3 , 4 в будущем, эта стратегия могла бы также использоваться для изучения динамических изменений в тканях в болезненном состоянии или в ответ на стресс. Из этих методов, последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является многообещающим подходом, который не предполагает стресса заставить диссоциации клеток и могут быть использованы на трудно отделить ткани (например, спинной мозг), а также замороженные ткани. 4 , 17 , 18 , 19 адаптировано из предыдущих методов изоляции ядер,20,21,22,,2325 мяРНК Seq обычно использует нарушения быстрого ткани и клетки Лизис в холодных условиях, центрифугирования и разделение ядер от сотовой мусора. 4 ядра могут быть изолированы для вниз по течению виртуализации следующего поколения на нескольких платформах инкапсуляции microfluidic капли. 4 , 7 , 24 , 25 этот метод позволяет для моментального снимка транскрипционный анализ деятельности тысяч клеток в момент времени.

Существует несколько стратегий для выпускать ядра от клеток до изоляции и последовательности, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки. Здесь мы описываем и сравнить два протокола для включения изоляции ядра от взрослых спинного мозга для вниз по течению массивно параллельной мяРНК Seq: лизис моющих средств механические и гипотонической механические lysis. Моющее механические лизис обеспечивает полный тканей срыв и более высокую доходность окончательный ядер. Гипотонический механические лизис включает управляемые степень разрушения тканей, обеспечивая возможность для выбора баланса между количеством и чистоты доходности окончательного ядерного. Эти подходы обеспечивают сопоставимых РНК урожайности, обнаруженных числа генов в ядро и профилирование типа клеток и также может использоваться успешно для мяРНК Seq.

протокол

Все животные работа была выполнена в соответствии с протоколом, утвержденным Национальный институт неврологических нарушений и инсульта животных уход и использования Комитетом. Сбалансированный образцы мужские и женские мышей дикого типа МГП/CD-1, между 8 и 12 недель старые, были использованы для всех экспериментов. Мышей должны обрабатываться местных институциональных животное уход и использование Комитетом руководящим принципам.

1. Подготовка материалов и буферы

  1. Подготовить все буферы в день использования и предварительно охладить на льду (см. таблицу 1).
    1. При использовании стирального порошка механические лизис, подготовьте стиральный порошок литического буфера (> 500 мкл на сэмпл), низкая сахарозы буфера (> 6 мл на сэмпл), буфер плотность сахарозы (> 12,5 мл на сэмпл) и ресуспендирования раствор (> 1 мл).
    2. При использовании лизис гипотонический механические, подготовить гипотонический литического буфера (> 5 мл на сэмпл), ЕВР среднего (> 5 мл на сэмпл), низкая сахарозы буфера (> 3 мл на сэмпл), буфер плотность сахарозы (> 12,5 мл на сэмпл) и ресуспендирования раствор (> 1 мл).
    3. Добавьте 25 мкл Дитиотреитол (DTT) 25 мл буфера низкой сахарозы и еще 25 мкл DTT до 25 мл буфера градиента плотности сахарозы непосредственно перед запуском протокола.
  2. Покрыть поверхность рассечения с алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму загрязнение образца с волокна от бумажных полотенец или скамейке защитников, которые могут засорить microfluidic каналы, используемые для захвата одного ядра.
  3. Спрей рассечения инструменты и скамейка пространства с решением РНКазы обеззараживания. Кроме того спрей внутри трубки гомогенизатор Dounce (при использовании моющих средств механические клетки лизис) и трубки Oak Ridge раствором РНКазы обеззараживания. Промойте Dounce и ОК-Ридже трубка с сверхчистого, RNase свободной воды.
  4. Предварительно охладите все коллекции трубок (50 мл конические, дуб хребет) и Dounce гомогенизатор трубы на льду.
  5. Огонь польской серии пипетки Пастера (при использовании лизис клеток гипотонический механические).

2. Подготовка спинного мозга

  1. При использовании свежих ткани, усыпить мыши вдыханием CO2 . После эвтаназии спрей пальто мыши с 70% этанола для сведения к минимуму загрязнения волос в образце.
  2. Обезглавить мышь с острыми, RNase бесплатные хирургические ножницы. Далее аккуратно подъема брюшной кожи пинцетом и надрезают вдоль длины тела подвергать внутренние органы.
  3. Потрошение мыши, потянув внутренние органы от полости тела, используя пинцет. Не используйте бумажные полотенца для очистки области или для удаления органов, как это может ввести загрязняющих веществ. Использование ножницами, вырезать позвоночник между L2 и L3 позвонка позвоночника.
    Примечание: С практикой, этот шаг может быть достигнуто в менее чем 30 секунд.
    1. Чтобы извлечь спинного мозга, подходят 3 мл шприц, содержащие ледяной PBS с помощью иглы 25 G ¼ дюйма. Место кончике иглы в сакральной конец позвоночного столба. Используйте два пальца для щепотка позвонков для создания герметичности вокруг кончика иглы и нажмите на поршень, чтобы извлечь спинного рострально. Место спинного мозга в чашке Петри с ледяной PBS.
    2. На данный момент замораживания тканей и хранить при температуре-80 ° C или немедленно использовать для моющих средств механические (шаг 3) или гипотонические механические лизис (шаг 4).
  4. Если с использованием замороженных ткани, сохранить ткани на сухой лед, перейти к моющим средством механические (шаг 3) или лизис гипотонический механические (шаг 4).

3. моющее средство механические клетки Lysis

  1. Поясничного отдела спинного мозга в предварительно охлажденные гомогенизатор Dounce и добавить что 500 мл предварительно охлажденные стиральный порошок литического буфера.
    Примечание: Мыши поясничного отдела спинного мозга — 325.5 мг ± 63.9 мг Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM, N = 4). 50 мг – 1,5 г ткани может быть успешно использован.
  2. Dounce с 5 ударов пестика («свободный» пестик), затем 5-10 ударов пестика B («жесткой» пестик). Избегайте подъема гомогенизатор из лизис раствора между штрихами и избежать пузырей.
  3. Поместите стрейнер 40 мм предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки и prewet с 1 мл раствора низкой сахарозы буфера.
  4. Добавить 1 мл буфера низкой сахарозы в гомогенизатор Dounce, содержащие сырой ядер литического буфера и смешайте нежно закупорить 2 – 3 раза.
  5. Передайте prep сырой ядер над 40 мм сито в предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки.
  6. Передайте буфером низкой сахарозы еще 1 мл 40 мм сито, чего окончательный объем до 3 мл буфера низкой сахарозы и 500 мл буфера lysis.
  7. Повторите шаги 3.1 – 3,6, если объединение нескольких шнуров, объединения в том же конической трубки.
  8. Центрифугуйте образцы на 3200 x g 10 мин при 4 ° C. После центрифугирования, сцеживаться супернатант. Перейдите к шагу 5.

4. гипотонический механические клетки Lysis

  1. Место поясничного отдела спинного мозга в 5 мл гипотонический литического буфера в тканевой культуры блюдо. Использовать тупой конец весны ножницы пополам спинного мозга, а затем использовать ножницы весной шнур нарезать 3 – 4 мм, но не жалел.
    Примечание: 50 мг – 1,5 г ткани может успешно использоваться.
  2. Инкубируйте на льду за 15 мин, закрученной 2 – 3 раза.
  3. Добавьте 5 мл HEB среды для разбавления гипотонический литического буфера.
  4. Нарезанных ткани 10 раз с 5 мл Серологические Пипетки, или до тех пор, пока все куски ткани плавно путем открытия пипеткой.
  5. Нарезанных с серии три огонь полированные пипетки Пастера постепенно узкой диаметром (~ 900 – 600 мм).
    1. Для каждого пипетку, нарезанных 5 - 15 раз, позволяют ткани урегулировать, удалить 1 – 2 мл супернатанта, содержащих диссоциированных ядер и пройти через стрейнер 40 мм в предварительно охлажденные 50 мл Конические трубки.
    2. После Тритурация с пипетка Пастера наименьшего размера убедитесь, что огневки плавно перетекает через наконечник пипетки. Пройти оставшийся раствор над 40 мм сито в 50 мл Конические трубки.
      Примечание: Общее количество порошки могут быть скорректированы как пожелано. Мозговые оболочки спинного мозга мыши останется, но это важно для нарезанных любых видимых куски спинного мозга. Передайте оставшихся огневки 40 m ситечко. Избегайте введения пузырей во время Тритурация.
  6. Центрифуга для отфильтрованных выборки в 1000 g x 10 мин при 4 ° C. После центрифугирования, декантируют и удалить супернатант. Перейдите к шагу 5.

5. гомогенизации и градиент плотности сахарозы

  1. После шага 3 или 4 Ресуспензируйте Пелле, используя 3 мл буфера низкой сахарозы. Аккуратно водоворот удалить гранулы от стены для облегчения ресуспендирования. Пусть пример сидеть на льду на 2 мин и передать трубки Oak Ridge подвеска.
  2. С использованием гомогенизатора в настройке 1, гомогенизировать ядер в буфере низкой сахарозы для 15-30 сек, сохраняя образца на льду.
    Примечание: Используйте 15 s при использовании одного поясничного отдела спинного мозга или 30 s при использовании пула образцы или весь спинной мозг.
  3. С помощью Серологические Пипетки, слой 12,5 мл плотности сахарозы буфера под низким сахарозы буфера огневки, заботиться, чтобы не создавать пузырь, который разрушает слои плотности.
  4. Центрифуга для трубы на 3200 x g 20 мин при 4 ° C.
  5. После центрифугирования, немедленно сцеживаться супернатант в flicking движения.
    Примечание: Остаточный объем (менее чем 400 мл) сахарозы буфера может быть удален при необходимости производить низкой громкости и чистого последний пример, но этот остаточный объем содержат ядра и могут быть сохранены для максимизации доходности ядер.
  6. С помощью 100 мл - 1 мл раствора ресуспендирования Ресуспензируйте ядер, оставаясь на стене. Избегайте миелина «хмуриться» остается с подготовкой на основе моющих средств.
  7. Фильтр ядра через сито 30 – 35 мм, размер поры и собирать в предварительно охлажденные трубы.
  8. Определите ядер урожайности с использованием Горяева для подсчета ядер под объектив 10 X.
    Примечание: Трипановый синий могут добавляться визуализировать ядер, которые должны появиться синий. Обратите внимание на количество сотовой мусора.
  9. Перейдите к шагу 6 или 7.

6. массивно параллельной мяРНК последовательности: академический платформы7

  1. Выполните массивно параллельной мяРНК последовательности (например, падение-Seq) метод как описано7 со следующими изменениями:4
    1. Настройка ядра до конечной концентрации ядер 225 мл.
    2. Подготовьте перепутываются бусины в концентрации бусины 250 мл.
    3. Подготовьте литического буфера с 0,7% sarkosyl.
    4. Отрегулируйте скорость потока до 35 мл / мин для бусины, 35 мл / мин для ядер и 200 мл / мин для нефти.

7. массивно параллельной мяРНК последовательности: коммерческая платформа26

  1. Выполнение расширенной параллельной мяРНК последовательности с использованием коммерческой платформы (например, хрома ячейки ген выражение решения) продукты согласно инструкции производителя26 со следующим изменением:
    1. После обратного транскрипция добавьте дополнительный цикл PCR расчетное количество циклов для амплификации кДНК на основе восстановления целевой ячейки компенсировать снижение cDNA от ядра, по сравнению с клетками.

Результаты

Здесь мы провели изоляции ядер от поясничного отдела спинного мозга взрослого мыши по течению массивно параллельной последовательности РНК. Протокол участвуют три основных компонента: тканей срыв и сотовых лизиса, гомогенизации и сахароза плотность центрифугирован...

Обсуждение

Конечная цель настоящего Протокола заключается в изоляции ядер, содержащие РНК высокого качества для вниз по течению transcriptional анализа. Мы адаптировали мяРНК Seq методы для того, чтобы профиль, все типы клеток спинного мозга. Первоначально мы обнаружили, что типичных клеток диссоциации м?...

Раскрытие информации

У нас нет конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана в очной программе NINDS (1 Зия NS003153 02) и NIDCD (1 Зия DC000059 18). Мы благодарим L. Li и воспламенением Dobrott за их техническую поддержку и полезные обсуждения и Kathe C. для рассмотрения рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SucroseInvitrogen15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)Gibco15630-080
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
MgAcSigma AldrichM5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)CorningMT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich10197777001Add DTT just prior to use
Triton-XSigma AldrichT8787
Nuclease-free waterCrystalgen221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)Sigma AldrichT2194
5 M NaClSigma Aldrich59222C
1 M MgCl2Sigma AldrichM1028
Nonidet P40Sigma Aldrich74385
Hibernate-AGibcoA12475-01
Glutamax (100x)Gibco35050-061
B27 (50x)Gibco17504-044
1x PBSCrystalgen221-133-10
0.04% BSANew England BiolabsB9000S
0.2 U/μL RNAse InhibitorLucigen30281-1
Oak Ridge Centrifuge TubeThermo Scientific3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)Kimble885303-002
Glass large clearance pestleKimble885301-0002
Glass small clearance pestleKimble885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax HomogenizerIKA3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)IKA3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
40 μm cell strainerFalcon352340
MACS SmartStrainers, 30 μmMiltenyi Biotec130-098-458
Conical tubesDenville Scientific1000799
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle RotorThermo Fisher Scientific75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mLDenville ScientificP7127
HemocytometerDaigger ScientificEF16034F
Chemgenes Barcoding BeadsChemgenesMacosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)Corning352235
MoFlo Astrios Cell SorterBeckman CoulterB25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10X Genomics120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns10X Genomics120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)Corning353002

Ссылки

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
  26. 10X Genomics. . Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140Seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены