Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Résumé

Sondant l’expression des gènes de la cellule individuelle permet l’identification du type de cellule et de l’état de la cellule. Séquençage de RNA unicellulaire a émergé comme un outil puissant pour l’étude des profils de transcriptional des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes tels que le système nerveux central. Cependant, méthodes de dissociation requis pour l’ordonnancement de la cellule unique peuvent conduire à des changements expérimentaux dans la gène expression et la mort cellulaire. En outre, ces méthodes sont généralement limités aux tissus frais, limitant ainsi les études sur les archives et le matériel de bio-Banque. Séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une alternative attrayante pour études transcriptionnels, étant donné qu’il identifie les types de cellules, permet l’étude des tissus congelés ou difficile de dissocier, avec précision et réduit la dissociation induite par le transcription. Nous présentons ici un protocole haut débit pour l’isolement rapide de noyaux pour aval snRNA-suiv. Cette méthode permet l’isolement des noyaux des échantillons frais ou congelés de la moelle épinière et peut être combinée avec deux plates-formes d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle.

Introduction

Le système nerveux est composé de groupes hétérogènes de cellules qui présentent une grande diversité de propriétés morphologiques, biochimiques et électrophysiologiques. Alors que le séquençage de RNA en vrac a été utile pour déterminer les modifications à l’échelle tissulaire dans l’expression de gène dans des conditions différentes, il s’oppose à la détection de changements transcriptionnelles au niveau unicellulaire. Les progrès récents dans l’analyse transcriptionnelle unicellulaires ont permis la classification des cellules hétérogènes en groupes fonctionnels basé sur leur répertoire moléculaire et peuvent même être exploités pour détecter les ensembles de neurones qui avaient été récemment actifs. ^{1 , 2 , 3 , 4} au cours des dix dernières années, le développement de l’ARN unicellulaire séquençage (scRNA-Seq) a permis l’étude de l’expression des gènes dans des cellules individuelles, offrant ainsi une vue de la diversité type de cellule. ⁵

L’émergence d’approches évolutives telles que massivement parallèle scRNA-Seq, a fourni des plates-formes de tissus hétérogènes de séquence, dont de nombreuses régions du système nerveux central. ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} Toutefois, méthodes de dissociation unicellulaire peuvent conduire à la mort cellulaire, mais aussi les changements expérimentaux dans l’expression des gènes. ¹⁶ travaux récents a adapté des méthodes de séquençage unicellulaire pour permettre la préservation des profils de transcriptionnelles endogènes. ^{1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19} ces stratégies ont été particulièrement adaptés pour la détection de l’expression des gènes (IEG) début immédiat après le stimulus sensoriel ou comportement. ^{3 , 4} dans le futur, cette stratégie pourrait également servir à étudier les changements dynamiques dans les tissus dans les états pathologiques ou en réponse au stress. De ces méthodes, séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une approche prometteuse qui n’implique pas de stress induisant la dissociation cellulaire et peut être utilisée sur difficile de dissocier les tissus (par exemple, la moelle épinière), mais aussi gelé des tissus. ^{4 , 17 , 18 , 19} adapté des précédentes méthodes d’isolement de noyaux,^{20,21,22,23,25} snRNA-Seq utilise généralement cellulaire et interruption rapide des tissus lyse dans des conditions froides, centrifugation et séparation des noyaux de débris cellulaires. ⁴ noyaux peuvent être isolés pour le séquençage de nouvelle génération en aval sur plusieurs plateformes d’encapsulation de gouttelettes microfluidiques. ^{4 , 7 , 24 , 25} cette méthode permet une capture instantanée de l’activité transcriptionnelle de milliers de cellules à un moment dans le temps.

Il existe plusieurs stratégies pour libérer les noyaux des cellules avant d’isolement et de séquençage, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients. Nous décrivons ici et comparer deux protocoles pour permettre l’isolement des noyaux de la moelle épinière adulte pour la snRNA-Seq massivement parallèle en aval : détergent-mechanical lyse et lyse hypotonique-mécanique. Détergent-mechanical lyse fournit la désorganisation complète de tissus et un meilleur rendement final des noyaux. Mécanique-lyse hypotonique comprend une certaine désorganisation du tissu, offrant la possibilité de sélectionner un équilibre entre la quantité et la pureté de la dernière puissance nucléaire contrôlable. Ces approches fournissent le rendement comparable de RNA, détecté un nombre de gènes par noyau et le profilage de type cellulaire et aussi peuvent être utilisés avec succès pour snRNA-suiv.

Protocole

Tous les animaux travaux ont été réalisés conformément à un protocole approuvé National Institute of Neurological Disorders and Stroke animalier et Comité d’urbanisme. Équilibré des échantillons des souris mâles et femelles ICR/CD-1 sauvage, entre 8 et 12 semaines vieux, ont été utilisés pour toutes les expériences. Souris doivent être traités selon les directives locales institutionnelles animalier et Comité d’urbanisme.

1. préparation des matériaux et des tampons

1. Préparer tous les tampons le jour d’utilisation et pré refroidir sur glace (voir tableau 1).
   1. Si vous utilisez le détergent-mechanical lyse, préparer le tampon de lyse détergent (> 500 μL / échantillon), tampon saccharose faible (> 6 mL par exemple), tampon de densité de saccharose (12,5 mL > par échantillon) et la solution de remise en suspension (> 1 mL).
   2. Si vous utilisez la lyse hypotonique-mécanique, préparer le tampon de lyse hypotonique (> 5 mL par exemple), tampon saccharose faible (> 3 mL par exemple), milieu HEB (> 5 mL par exemple), tampon de densité de saccharose (> 12,5 mL par exemple) et la solution de remise en suspension (> 1 mL).
   3. Ajouter 25 μL de dithiothréitol (DTT) à 25 mL de tampon saccharose faible et un autre 25 μL de la TNT à 25 mL de saccharose densité gradient tampon juste avant de commencer le protocole.
2. Couvrir la surface dissection-une feuille d’aluminium pour minimiser la contamination de l’échantillon avec des fibres de papier essuie-tout ou protecteurs de banc, qui peuvent obstruer les canaux microfluidiques utilisées pour capturer des noyaux unique.
3. Vaporiser les outils de dissection et de l’espace de banc avec une solution de décontamination de RNase. En outre, vaporisez l’intérieur du tube de homogénisateur Dounce (si vous utilisez la lyse cellulaire de détergent-mécanique) et Oak Ridge tube avec une solution de décontamination de RNase. Rincez bien le tube Dounce et Oak Ridge avec de l’eau ultrapure, RNase-libre.
4. Pré refroidir tous les tubes de prélèvement (50 mL conique, Oak Ridge) et tubes homogénéisateur Dounce sur glace.
5. Feu polonais une série de pipettes Pasteur (si vous utilisez la lyse hypotonique-mécanique cellulaire).

2. préparation de la moelle épinière

1. Si vous utilisez les tissus frais, euthanasier la souris par inhalation de CO₂ . Suite à l’euthanasie, vaporiser le pelage de la souris avec l’éthanol à 70 % pour minimiser la contamination de l’échantillon de cheveux.
2. Décapiter la souris avec des ciseaux chirurgicaux sharp, libre de RNase. Ensuite, en soulevant doucement l’abdomen la peau avec une pince et faites une incision le long du corps pour exposer les organes internes.
3. Éviscérer la souris en tirant sur les organes internes de la cavité du corps avec une pincette. N’utilisez pas de papier essuie-tout pour nettoyer la zone ou à prélever des organes comme cela peut introduire des contaminants. À l’aide de ciseaux, coupez la colonne vertébrale entre les vertèbres de la colonne vertébrale L2 et L3.
   Remarque : Avec la pratique, cette étape peut être réalisée en moins de 30 secondes.
   1. Pour éjecter la moelle épinière, adapter une seringue de 3 mL contenant PBS glacé avec une aiguille de ¼ de pouce de 25 G. Placer la pointe de l’aiguille dans l’extrémité sacrale de la colonne vertébrale. Utilisez deux doigts pour pincer les vertèbres pour créer un joint étanche autour de la pointe de l’aiguille et appuyez sur le poussoir pour éjecter la moelle épinière rostralement. Placer la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec du PBS glacée.
   2. À ce stade, geler les tissus et stocker à-80 ° C ou utiliser immédiatement pour détergent-mécanique (étape 3) ou lyse hypotonique-mécanique des (étape 4).
4. Si à l’aide de tissus congelés, maintenir le tissu sur la glace sèche, passez à la lyse (étape 4) hypotonique-mécanique ou de détergent-mécanique (étape 3).

3. lyse des cellules détergent-mécanique

1. Placer la moelle lombaire dans un homogénéisateur Dounce préalablement réfrigérée et ajouter 500 mL préalablement réfrigérées tampon de lyse détergent.
   Remarque : Une souris la moelle épinière lombaire est 325,5 mg mg 63,9 ± erreur-type de la moyenne (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g de tissus peuvent être utilisé avec succès.
2. Dounce avec 5 coups de Pilon (Pilon « lâche »), puis de 5 à 10 coups de pilon B (« serré » pilon). Éviter l’homogénéisateur hors de la solution de lyse entre coups de levage et éviter d’introduire des bulles.
3. Placez une passoire de 40 mm sur un tube conique préalablement refroidie 50 mL et prewet avec 1 mL de tampon saccharose faible.
4. Ajouter 1 mL de tampon saccharose faible à l’homogénéisateur Dounce contenant les noyaux bruts dans le tampon de lyse et mélanger doucement en pipettant également, 2 à 3 fois.
5. Passez la prep de noyaux bruts sur la crépine de 40 mm dans le tube conique préalablement refroidie 50 mL.
6. Passez un supplémentaire 1 mL de tampon de saccharose faible sur le tamis de 40 mm, ce qui porte le volume final à 3 mL du tampon saccharose faible et 500 mL de tampon lyse.
7. Répétez les étapes 3.1 à 3.6 Si vous associez plusieurs cordes, mise en commun dans le même tube conique.
8. Centrifuger l’échantillon à 3 200 x g pendant 10 min à 4 ° C. Une fois la centrifugation terminée, éliminer le surnageant. Passez à l’étape 5.

4. lyse des cellules hypotonique-mécanique

1. Placer la moelle lombaire dans 5 mL de tampon lyse hypotonique dans un plat de culture de tissus. Utilisez l’extrémité arrondie des ciseaux ressort coupent la moelle épinière, puis utilisez le ressort ciseaux pour couper le cordon en morceaux de 3 à 4 mm, mais ne pas mâché.
   Remarque : 50 mg – 1,5 g de tissu peut être utilisé avec succès.
2. Incuber sur la glace pendant 15 minutes, en remuant 2 à 3 fois.
3. Ajouter 5 mL de milieu HEB pour diluer le tampon de lyse hypotonique.
4. Triturer le tissu 10 fois avec une pipette sérologique de 5 mL, ou jusqu'à ce que tous les morceaux du tissu avec SOUPLESE dans l’ouverture de la pipette.
5. Triturer avec une série de trois pipettes de Pasteur feu poli diamètre progressivement plus étroit (~ 900-600 mm).
   1. Pour chaque pipette, triturer 5 à 15 fois, permettre aux tissus à s’installer, enlever 1 à 2 mL du surnageant contenant des noyaux dissociées et passer sur un tamis de 40 mm dans un tube conique préalablement refroidie 50 mL.
   2. Après trituration avec la pipette Pasteur de la plus petite taille, faire en sorte que l’homogénat circule en douceur grâce à l’embout de la pipette. Passez le reste de la solution sur la crépine de 40 mm dans le tube conique de 50 mL.
      Remarque : Le nombre total de triturations peut être réglé comme vous le souhaitez. Les méninges de la moelle épinière de souris restera, mais il est important de triturer des morceaux visibles de la moelle épinière. Passez l’homogénat restant sur le tamis de 40 m. Éviter d’introduire des bulles au cours de la trituration.
6. Centrifuger l’échantillon filtré à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Une fois la centrifugation terminée, décanter et éliminer le surnageant. Passez à l’étape 5.

5. homogénéisation et Gradient de densité de saccharose

1. Après l’étape 3 ou 4, resuspendre le culot à l’aide de 3 mL de tampon saccharose faible. Agiter doucement pour enlever le culot du mur pour faciliter la remise en suspension. Laisser l’échantillon s’asseoir sur la glace pendant 2 min et transférer la suspension dans un tube à Oak Ridge.
2. À l’aide de l’homogénéisateur à réglage 1, homogénéiser les noyaux dans un tampon saccharose faible pour 15 à 30 s, garder l’échantillon sur la glace.
   Remarque : Utiliser 15 s si vous utilisez une moelle épinière lombaire ou 30 s si vous utilisez en commun échantillons ou toute la moelle épinière.
3. À l’aide d’une pipette sérologique, couche 12,5 mL de tampon saccharose densité sous l’homogénat de tampon saccharose faible, prenant soin de ne pas pour créer une bulle qui perturbe les couches de densité.
4. Centrifuger les tubes à 3 200 x g pendant 20 min à 4 ° C.
5. Une fois la centrifugation terminée, immédiatement éliminer le surnageant dans un mouvement pichenette.
   Remarque : Un volume résiduel (moins de 400 mL) de tampon saccharose peut être ignoré si vous le souhaitez afin de produire un volume plus faible et le nettoyeur de l’échantillon final, mais ce volume résiduel contient-il des noyaux et peut être conservé pour maximiser le rendement de noyaux.
6. À l’aide de 100 mL - 1 mL de solution de resuspension, remettre en suspension les noyaux restant sur le mur. Éviter la myéline « froncement de sourcils » qui reste avec la préparation à base de détergent.
7. Filtrer les noyaux à travers un tamis de pores de 30 à 35 mm et de recueillir dans un tube préalablement réfrigéré.
8. Déterminer les noyaux donnent à l’aide d’un hémocytomètre pour compter des noyaux sous un objectif 10 X.
   Remarque : Le bleu Trypan peut être ajouté pour visualiser les noyaux, qui devraient apparaître en bleus. Noter la quantité de débris cellulaires.
9. Passez à l’étape 6 ou 7.

6. massivement parallèle snRNA-séquençage : plate-forme académique⁷

1. Effectuer le séquençage massivement parallèle snRNA (p. ex., Drop-Seq) méthode décrite précédemment⁷ avec les modifications suivantes :⁴
   1. Ajuster les noyaux à une concentration finale de 225 noyaux par mL.
   2. Préparer les perles avec code à barres à une concentration de 250 perles / mL.
   3. Préparer le tampon de lyse sarkosyl 0,7 %.
   4. Ajuster les débits à 35 mL / min pour les perles, 35 mL / min pour les noyaux et 200 mL / min pour le pétrole.

7. massivement parallèle snRNA-séquençage : plate-forme commerciale²⁶

1. Effectuer la snRNA-séquençage massivement parallèle à l’aide de la plateforme commerciale (p. ex., Solution de chrome unique cellule Gene Expression) des produits selon instructions²⁶ avec la modification suivante les directives du fabricant :
   1. Après transcription inverse, ajouter un cycle supplémentaire de la PCR pour le nombre de cycles d’amplification de l’ADNc basé sur la récupération de cellules ciblées afin de compenser une diminution ADNc des noyaux par rapport aux cellules.

Résultats

Ici, nous avons réalisé isolement des noyaux de la moelle lombaire de souris adultes en aval séquençage massivement parallèle de RNA. Le protocole implique trois éléments principaux : tissu perturbation et cellulaire lyse, homogénéisation et saccharose densité par centrifugation (Figure 1). Dans les secondes, la lyse de détergent-mécanique a donné une préparation de noyaux bruts avec un grand nombre de noyaux ainsi que des débris cellulaires e...

Discussion

Le but ultime de ce protocole est d’isoler les noyaux contenant ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptionnelle en aval. Nous avons adapté le snRNA-Seq méthodes afin de profil de tous les types de cellules dans la moelle épinière. Au départ, nous avons constaté que les méthodes de dissociation cellulaire typique étaient inefficaces de séquençage d’unicellulaire RNA, comme les neurones de la moelle épinière sont particulièrement vulnérables à la mort cellulaire. En outre, méthodes de dissocia...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Invitrogen	15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)	Gibco	15630-080
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
MgAc	Sigma Aldrich	M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)	Corning	MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	10197777001	Add DTT just prior to use
Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Nuclease-free water	Crystalgen	221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)	Sigma Aldrich	T2194
5 M NaCl	Sigma Aldrich	59222C
1 M MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Nonidet P40	Sigma Aldrich	74385
Hibernate-A	Gibco	A12475-01
Glutamax (100x)	Gibco	35050-061
B27 (50x)	Gibco	17504-044
1x PBS	Crystalgen	221-133-10
0.04% BSA	New England Biolabs	B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor	Lucigen	30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube	Thermo Scientific	3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)	Kimble	885303-002
Glass large clearance pestle	Kimble	885301-0002
Glass small clearance pestle	Kimble	885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer	IKA	3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)	IKA	3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
40 μm cell strainer	Falcon	352340
MACS SmartStrainers, 30 μm	Miltenyi Biotec	130-098-458
Conical tubes	Denville Scientific	1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor	Thermo Fisher Scientific	75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL	Denville Scientific	P7127
Hemocytometer	Daigger Scientific	EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads	Chemgenes	Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Invitrogen	AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)	Corning	352235
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns	10X Genomics	120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns	10X Genomics	120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns	10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)	Corning	353002