Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Resumo

Sondando a expressão de gene de uma célula individual permite que a identificação do tipo de célula e estado da célula. A sequenciação do ARN monocelulares tem emergido como uma poderosa ferramenta para estudar perfis transcriptional de células, particularmente nos tecidos heterogêneos, tais como o sistema nervoso central. No entanto, métodos de dissociação necessários para sequenciamento única célula podem levar a mudanças experimentais na morte gene expressão e celular. Além disso, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, limitando assim os estudos sobre arquivamento e material de bio-banco. Sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma alternativa atraente para estudos transcricionais, dado que com precisão identifica os tipos de células, permite o estudo de tecido que é difícil dissociar, ou congelados e reduz induzida por dissociação transcrição. Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para isolamento rápido de núcleos para jusante snRNA-Seq Esse método permite o isolamento dos núcleos de amostras frescas ou congeladas da medula espinhal e pode ser combinado com duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota.

Introdução

O sistema nervoso é composto por grupos heterogêneos de células que exibem uma disposição diversa de propriedades morfológicas, bioquímicas e eletrofisiológicas. Enquanto o sequenciamento de RNA em massa tem sido útil para determinar todo o tecido alterações na expressão do gene em condições diferentes, isso impede a detecção de alterações transcricionais no nível de célula única. Avanços recentes na célula única análise transcricional permitiram a classificação de células heterogêneas em grupos funcionais com base em seu repertório molecular e ainda podem ser aproveitados para detectar conjuntos de neurônios que tinham sido recentemente ativos. ^{1 , 2 , 3 , 4} nos últimos dez anos, o desenvolvimento de uma única célula RNA sequenciamento (scRNA-Seq) permitiu o estudo da expressão do gene em células individuais, proporcionando uma visão sobre a diversidade do tipo de célula. ⁵

O surgimento das abordagens escaláveis como maciçamente paralelo scRNA-Seq, forneceu plataformas para tecidos heterogêneos de sequência, incluindo muitas regiões do sistema nervoso central. ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} entretanto, métodos de dissociação única célula podem originar a morte celular, bem como alterações experimentais na expressão gênica. ¹⁶ trabalho recente adaptou-se métodos de sequenciamento única célula para permitir a preservação dos perfis transcriptional endógenas. ^{1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19} estas estratégias têm sido particularmente adequadas para a detecção imediata expressão de gene (IEG) inicial após estímulo sensorial ou comportamento. ^{3 , 4} no futuro, esta estratégia poderia também ser usada para estudar as mudanças dinâmicas nos tecidos nos Estados de doença ou na resposta ao estresse. Esses métodos, sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma abordagem promissora que não envolve a dissociação de células indutoras de stress e pode ser usada na difícil dissociar o tecido (por exemplo, a medula espinhal), bem como congelados tecido. ^{4 , 17 , 18 , 19} adaptado de métodos de isolamento de núcleos anteriores,^{20,21,22,23,25} snRNA-Seq normalmente utiliza celular e ruptura rápida de tecido Lise sob condições de frio, centrifugação e separação dos núcleos de restos celulares. ⁴ núcleos podem ser isolados para o sequenciamento de próxima geração a jusante em múltiplas plataformas de encapsulamento de gotículas microfluidic. ^{4 , 7 , 24 , 25} este método permite um instantâneo da atividade transcricional de milhares de células em um momento no tempo.

Existem várias estratégias para liberação de núcleos de células antes de isolamento e sequenciamento, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Aqui, descrevemos e comparar dois protocolos para permitir o isolamento dos núcleos da medula espinhal adulto para a jusante maciçamente paralelo snRNA-Seq: lise detergente-mecânica e lise hipotónica-mecânica. Lise de detergente-mecânica fornece tecido completo rompimento e um maior rendimento final de núcleos. Mecânica-lise hipotónica inclui um grau controlável de ruptura do tecido, proporcionando uma oportunidade para a seleção de um equilíbrio entre a quantidade e a pureza do rendimento final nuclear. Estas abordagens fornecem rendimento comparável do RNA, detectado um número de genes por núcleo e o tipo de célula de criação de perfil e também podem ser usados com sucesso para snRNA-Seq

Protocolo

Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com um protocolo aprovado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso cuidado do Animal e Comitê de uso. Balanceamento de amostras de masculinos e femininos, ratos do selvagem-tipo da ICR/CD-1, entre 8 e 12 semanas velho, foram usados para todos os experimentos. Os ratos devem ser tratados em conformidade com as orientações institucionais Cuidado Animal e Comitê de uso locais.

1. preparação de materiais e Buffers

1. Preparar todos os buffers no dia do uso e pre-chill no gelo (ver tabela 1).
   1. Se utilizar detergente-mecânica Lise, prepare o detergente do lysis (> 500 μL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 6 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).
   2. Se usando lise hipotónica-mecânico, preparar o tampão de Lise hipotónica (> 5 mL por amostra), médio HEB (> 5 mL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 3 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).
   3. Adicione 25 μL de ditiotreitol (DTT) para 25 mL de tampão de baixa sacarose e outra 25 μL de TDT para 25 mL de buffer de gradiente de densidade de sacarose, pouco antes de iniciar o protocolo.
2. Cubra a superfície dissecação com folha de alumínio para minimizar a contaminação da amostra com fibras de papel toalha ou protetores de banco, que podem obstruir canais microfluídicos usados para capturar o único núcleos.
3. Pulverizador ferramentas de dissecção e espaço de bancada com uma solução de descontaminação de RNase. Além disso, pulverize o interior do tubo homogenizador de homogenizacao (se estiver usando o lysis da pilha de detergente-mecânica) e tubo de Oak Ridge com uma solução de descontaminação de RNase. Enxague com água ultrapura, RNase-livre o tubo homogenizacao e Oak Ridge.
4. Pre-relaxa todos os tubos de coleta (50ml cónico, Oak Ridge) e tubos de homogeneizador homogenizacao no gelo.
5. Fogo polir uma série de pipetas Pasteur (se estiver usando o lysis da pilha hipotônica-mecânico).

2. preparação da medula espinhal

1. Se usar tecido fresco, eutanásia o mouse por inalação de CO₂ . Após eutanásia, pulverize o casaco do mouse com etanol a 70% para minimizar a contaminação de cabelo na amostra.
2. Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica afiada, RNase-livre. Em seguida, levantando suavemente o abdominal da pele com pinças e fazer uma incisão ao longo do comprimento do corpo para expor os órgãos internos.
3. Acabo com o mouse, puxando os órgãos internos da cavidade de corpo usando fórceps. Não utilize toalhas de papel para limpar a área ou para retirar os órgãos como isto pode introduzir contaminantes. Usando a tesoura, corte a coluna vertebral, entre as vértebras da coluna vertebral L2 e L3.
   Nota: Com a prática, esta etapa pode ser alcançada em menos de 30 segundos.
   1. Para ejetar a medula espinhal, cabe uma seringa de 3 mL contendo PBS gelado com uma agulha de ¼ de polegada de 25 G. Coloca a ponta da agulha no final sacral da coluna vertebral. Use dois dedos de beliscar as vértebras para criar um selo apertado em torno da ponta da agulha e pressione o êmbolo para ejetar a medula espinhal rostralmente. Lugar da medula espinhal em uma placa de Petri com PBS gelado.
   2. Neste momento, congelar o tecido e armazenar a-80 ° C ou usá-lo imediatamente para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).
4. Se usar tecido congelado, manter o tecido em gelo seco, prosseguir para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).

3. lise celular detergente-mecânica

1. Coloque a medula espinhal lombar em um homogeneizador homogenizacao pre-refrigerado e adicione 500 mL previamente refrigeradas lise detergente.
   Nota: Uma rato da medula espinhal lombar é 325,5 mg mg 63,9 ± erro-padrão da média (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso.
2. Homogenizacao com 5 golpes de pilão um (pilão 'solto'), então a 5-10 golpes de pilão B (pilão 'apertado'). Evitar levantar o homogenizador fora a solução de Lise entre traços e evitar a introdução de bolhas.
3. Coloque um filtro de 40mm sobre um tubo cónico de 50ml pre-refrigerados e prewet com 1 mL de tampão de baixa sacarose.
4. Adicionar 1 mL de tampão de baixa sacarose para o homogeneizador homogenizacao contendo os núcleos brutos na Lise e misture suavemente pipetando 2 – 3 vezes.
5. Passe a preparação de núcleos bruto o filtro de 40mm no tubo cónico de 50ml previamente refrigerados.
6. Passe um adicional 1 mL de tampão de baixa sacarose sobre o filtro de 40mm, trazendo o volume final de 3 mL do buffer baixa sacarose e 500 mL de tampão de Lise.
7. Repita as etapas 3.1 – 3.6 se combinando vários cabos, reunindo no mesmo tubo cónico.
8. Centrifugar a amostra a 3.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decante o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.

4. lysis da pilha hipotônica-mecânica

1. Lugar da medula espinhal lombar em 5 mL de tampão de Lise hipotónica em um prato de cultura de tecidos. Use o fim brusco da tesoura de mola para dividem a medula espinhal e, em seguida, use tesoura de mola para cortar o cordão em pedaços de 3 – 4 mm, mas não picar.
   Nota: 50mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso.
2. Incube no gelo por 15 min, agitando 2 – 3 vezes.
3. Adicione 5 mL de meio HEB para diluir a Lise hipotónica.
4. Triture o tecido 10 vezes com pipeta sorológica 5ml, ou até que todas as peças do tecido mover suavemente através da abertura da pipeta.
5. Triture com uma série de três pipetas Pasteur fogo-lustrado com diâmetros progressivamente mais estreitos (~ 900 – 600 mm).
   1. Para cada pipeta, Triture 5 - 15 vezes, permitir que o tecido resolver, retire 1 a 2 mL do sobrenadante contendo núcleos dissociados e passar por um filtro de 40mm em um tubo cônico de 50ml previamente refrigerados.
   2. Após a trituração com pipeta Pasteur de menor porte, certifique-se de que o homogenate flui suavemente a ponta da pipeta. Passe o restante da solução sobre o filtro de 40mm no tubo cónico de 50 mL.
      Nota: O número total de triturations pode ser ajustado como desejado. As meninges da medula espinhal do mouse permanecerá, mas é importante triture qualquer pedaços visíveis da medula espinhal. Passe o restante homogenate a peneira de 40 m. Evite a introdução de bolhas durante a trituração.
6. Centrifugar a amostra filtrada a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decantar e descartar o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.

5. homogeneização e gradiente de densidade de sacarose

1. Após a etapa 3 ou 4, resuspenda o pellet usando 3 mL de tampão de baixa sacarose. Agite suavemente para remover o sedimento da parede para facilitar a ressuspensão. Deixe a amostra sentar no gelo por 2 min e transferir a suspensão para um tubo de Oak Ridge.
2. Usando o homogenizador na configuração 1, homogeneizar os núcleos no buffer de sacarose baixa para 15 a 30 s, mantendo a amostra em gelo.
   Nota: Use 15 s se usando uma lombar da medula espinhal ou 30 s se usando em pool de amostras ou um inteiro da medula espinhal.
3. Usando uma pipeta sorológica, camada 12,5 mL de tampão de sacarose densidade sob a baixa sacarose homogenate de tampão, tomando cuidado para não criar uma bolha que interrompe as camadas de densidade.
4. Centrifugar os tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.
5. Uma vez concluída a centrifugação, imediatamente decante o sobrenadante em um movimento flicking.
   Nota: Um volume residual (inferior a 400 mL) de tampão de sacarose pode ser Descartado se desejado para produzir um volume menor e limpador amostra final, mas este volume residual contém núcleos e pode ser preservado para maximizar o rendimento de núcleos.
6. Usando 100 mL - 1 mL de solução de ressuspensão, resuspenda os núcleos restantes na parede. Evite a mielina 'cara feia' que permanece com a preparação do detergente baseada.
7. Os núcleos do filtro através de um filtro de tamanho de poro de 30 – 35 mm e recolher em um tubo previamente refrigerado.
8. Determine os núcleos rendem usando um hemocytometer a contagem de núcleos sob um objetivo X 10.
   Nota: Trypan azul pode ser adicionado para visualizar núcleos que devem aparecer azuis. Observe a quantidade de restos celulares.
9. Prossiga para o passo 6 ou 7.

6. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma académica⁷

1. Realizar o sequenciamento de snRNA maciçamente paralelo (por exemplo, Drop-Seq) método conforme descrito anteriormente⁷ com as seguintes modificações:⁴
   1. Ajuste os núcleos para uma concentração final de 225 núcleos por mL.
   2. Prepare-se grânulos de código de barras em uma concentração de 250 contas por mL.
   3. Prepare a Lise com sarkosyl de 0,7%.
   4. Ajuste as taxas de fluxo a 35 mL / min para grânulos, 35 mL / min para núcleos e 200 mL / min para o óleo.

7. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma comercial²⁶

1. Executar maciçamente paralelo snRNA-em sequência usando a plataforma comercial (por exemplo, cromo solução de expressão de Gene único de célula) produtos de acordo com instruções²⁶ com a seguinte modificação as indicações do fabricante:
   1. Seguindo transcrição reversa, adicione um ciclo PCR adicional ao número calculado de ciclos de amplificação do cDNA baseada a recuperação da célula alvo para compensar a diminuição do cDNA de núcleos em comparação com as células.

Resultados

Aqui, realizamos o isolamento dos núcleos da medula espinhal lombar rato adulto para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. O protocolo envolveu três componentes principais: tecido celular e ruptura da lise, homogeneização e sacarose densidade centrifugação (Figura 1). Em poucos segundos, a lise de detergente-mecânica rendeu uma preparação de núcleos bruto com um grande número de núcleos, bem como os restos celulares e tecido (

Discussão

O objetivo final do presente protocolo é isolar núcleos contendo RNA de alta qualidade para análise transcricional a jusante. Adaptamos snRNA-Seq métodos para o perfil de todos os tipos de células na medula espinhal. Inicialmente, achamos que métodos de dissociação típica célula eram ineficazes para sequenciamento do RNA de única célula, como os neurônios da medula espinhal são particularmente vulneráveis à morte celular. Além disso, métodos de dissociação celular induzem a expressão de vários genes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Invitrogen	15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)	Gibco	15630-080
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
MgAc	Sigma Aldrich	M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)	Corning	MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	10197777001	Add DTT just prior to use
Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Nuclease-free water	Crystalgen	221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)	Sigma Aldrich	T2194
5 M NaCl	Sigma Aldrich	59222C
1 M MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Nonidet P40	Sigma Aldrich	74385
Hibernate-A	Gibco	A12475-01
Glutamax (100x)	Gibco	35050-061
B27 (50x)	Gibco	17504-044
1x PBS	Crystalgen	221-133-10
0.04% BSA	New England Biolabs	B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor	Lucigen	30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube	Thermo Scientific	3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)	Kimble	885303-002
Glass large clearance pestle	Kimble	885301-0002
Glass small clearance pestle	Kimble	885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer	IKA	3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)	IKA	3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
40 μm cell strainer	Falcon	352340
MACS SmartStrainers, 30 μm	Miltenyi Biotec	130-098-458
Conical tubes	Denville Scientific	1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor	Thermo Fisher Scientific	75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL	Denville Scientific	P7127
Hemocytometer	Daigger Scientific	EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads	Chemgenes	Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Invitrogen	AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)	Corning	352235
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns	10X Genomics	120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns	10X Genomics	120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns	10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)	Corning	353002