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Erratum Notice

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要約

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。

要約

個々 の細胞の遺伝子発現を調査セルの種類および細胞の同定ができます。単一細胞 RNA シーケンスは、中枢神経系など異種組織の特に細胞の転写プロファイルを勉強するための強力なツールとして浮上しています。ただし、セルを 1 つのシーケンスに必要な解離メソッドは、遺伝子発現と細胞死の実験的な変更につながることができます。さらに、これらのメソッドは、一般にアーカイブに関する研究とバイオ銀行材料が少なくて、新鮮な組織に制限されます。単一核 RNA シーケンス (Seq snRNA) は転写研究、それが正確に細胞の種類を識別する、冷凍または分離することは困難である組織の研究を許可を与えられた魅力的な代替され、解離による転写。ここでは、提案する下流 snRNA シーケンスの核の急速な隔離のための高スループット プロトコルこのメソッドでは、新鮮なまたは冷凍脊髄由来の核の隔離を有効にし、2 つの並列の液滴カプセル化プラットフォームと組み合わせることができます。

概要

神経系は、形態学的、生化学的、および電気生理学的特性の多様な配列を表示するセルの異種グループで構成されます。一括 RNA シーケンスは、異なる条件下での遺伝子発現の組織全体にわたる変更を決める際に有用されている、単一細胞レベルでの転写の変化の検出ができなくなります。単一細胞の転写解析における最近の進歩は、異種細胞の機能グループ分子をレパートリーに基づく分類を有効にし、最近活躍していたニューロンのセットを検出にも利用できます。1,2,3,4過去 10 年間単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA) の開発が有効に細胞タイプの多様にビューを提供する個々 の細胞における遺伝子発現の研究。5

超並列 scRNA-Seq などの拡張性の高いアプローチの出現は、中枢神経系の多くの地域を含むシーケンス異種組織のプラットフォームを提供しています。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15ただし、単一セル解離メソッドは、遺伝子発現の実験的変化と同様、細胞死につながることができます。16最近の作品は、内因性転写プロファイルの保存を有効にする 1 つのセルの配列方法を適応しています。1,3,4,17,18,19これらの戦略は、前初期遺伝子 (IEG) 発現次の感覚的な刺激や動作を検出するために特に適しています。3,4将来、この戦略も使える組織病気の状態やストレスへの応答のダイナミックな変化を検討します。これらのメソッドの核 RNA シーケンス (Seq snRNA) はストレスを誘発する細胞解離を伴わない、(脊髄) などの組織を分離することは困難として冷凍で使用できる有望なアプローチ組織。4,17,18,19核分離従来から適合、20,21,22,23,25 snRNA Seq 通常利用して急速な組織の混乱とセル細胞の残骸から核を分離、遠心分離、冷たい条件の下での換散。4核は下流の次世代シーケンシング複数マイクロ液滴のカプセル化プラットフォーム上の分離できます。4,7,24,25のこの方法はセルの何千もの転写活性のスナップショットの時点でできます。

分離とそれぞれ独自の長所と短所を持つシーケンスの前に細胞から核を解放するための戦略は複数あります。ここで、説明と下流の並列 snRNA Seq の大人の脊髄からの核の隔離を有効にする 2 つのプロトコルを比較: 洗剤機械換散および低張性機械換散。洗剤機械換散では、完全な組織破壊と核の高い最終的な利回りを提供しています。低張性機械溶解には量と最終的に核収量の純度のバランスを選択する機会を提供する組織破壊度制御できるにはが含まれます。これらのアプローチは匹敵する RNA の収穫、核および細胞型プロファイルごとの遺伝子の検出数を提供しも両方使用できます正常に snRNA シーケンスの

プロトコル

国立神経疾患と脳卒中動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物の仕事を行った。8 の間、男性と女性の ICR/CD-1 野生型マウスのサンプルを分散し、12 週古い、すべての実験に使用されました。マウスは、地域機関動物ケアおよび使用委員会ガイドラインに沿った処理必要があります。

1. 材料とバッファーの準備

  1. すべてのバッファー使用の日の準備し、事前氷で冷やします (表 1参照)。
    1. 洗剤機械換散を使用している場合は、洗剤の換散バッファー (> 500 μ L サンプルごと)、低糖バッファー (サンプルごとの > 6 mL)、ショ糖密度バッファー (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL) を準備します。
    2. 低張性機械換散を使用すると、低張性換散バッファー (サンプルごとの > 5 mL)、なして中 (サンプルごとの > 5 mL)、低糖バッファー (サンプルごとの > 3 mL)、ショ糖濃度バッファーを準備 (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL)。
    3. プロトコルを開始する直前に 25 mL の低糖バッファーと 25 mL のショ糖密度勾配バッファーに DTT の別の 25 μ L ジチオトレイトール (DTT) の 25 μ L を追加します。
  2. 繊維紙タオルまたはベンチ プロテクターは、単一核のキャプチャに使用するマイクロ流路を詰まらせることができますからのサンプルの汚染を最小限に抑えるためにアルミ箔で解離性の表面を覆います。
  3. RNase 除去ソリューションを解離性ツールとベンチをスプレーします。また、RNase 除去ソリューション Dounce ホモジナイザー管 (洗剤機械セル換散の場合)、オークリッジ管の内側をスプレーします。超純水、RNase フリー水で Dounce とオークリッジ管を洗います。
  4. あらかじめすべてのコレクション チューブ (50 mL の円錐形、オーク リッジ) および氷の上 Dounce ホモジナイザー チューブを冷やします。
  5. (低張性機械セル換散の場合)、火はパスツール ピペットのシリーズを磨きます。

2. 脊髄の準備

  1. 新鮮な組織を使用する場合は、CO2吸入によるマウスを安楽死させます。次の安楽死、髪サンプルの汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールとマウスのコートをスプレーします。
  2. シャープ、RNase フリー手術用はさみでマウスの首をはねます。次に、腹部を優しく持ち上げる鉗子で皮膚し、内部の器官を公開する本体の長さに沿って切開を行います。
  3. マウスを骨抜きには鉗子を用いた体腔から内臓を引っ張るします。領域をクリーンアップする場合や汚染物質を導入することができるため、臓器を削除するは、ペーパー タオルを使用しないでください。はさみを使用して、L2 および L3 脊椎の脊柱をカットします。
    注: 練習では、この手順は 30 秒未満で実現できます。
    1. 脊髄を取り出し、氷冷 PBS の入った 25 G 1/4 インチ針付き 3 mL の注射器に入ります。脊柱の仙骨の端に針の先端を配置します。2 本の指を使用して、針の先端の周りタイトなシールを作成し、吻方脊髄を取り出し、プランジャーを押し下げて椎骨をピンチします。氷冷 PBS でシャーレに脊髄を配置します。
    2. この時点で、組織を凍結、-80 ° C で保存や洗剤機械 (ステップ 3) または低張性機械 (ステップ 4) 換散のいずれかをすぐに利用します。
  4. ドライアイスのティッシュの維持凍結組織を使用、場合洗剤機械 (ステップ 3) または低張性機械 (ステップ 4) 換散に進みます。

3. 洗剤機械セル換散

  1. 中古冷蔵 Dounce ホモジナイザーで腰椎の脊髄を置き、500 mL 中古冷蔵洗剤の溶解バッファーを追加します。
    注: マウスの腰椎脊髄は 325.5 mg ± 63.9 mg 平均の標準誤差 (SEM, N = 4)。50 mg – 1.5 グラムの組織を正常に使用できます。
  2. その後 5 〜 10 ストローク杵 B ('厳しい' 杵) 杵 (「緩い」杵)、5 ストロークで Dounce。ストロークの間に換散ソリューションのホモジナイザーを持ち上げることを避けるし、気泡を導入することを避けるため。
  3. あらかじめ冷やした 50 mL の円錐管と 1 ml 低糖バッファーの prewet に 40 mm のストレーナーを置きます。
  4. 換散バッファーの原油の核をもつ Dounce ホモジナイザーに 1 mL の低糖バッファーを追加、2-3 回のピペッティングで軽く混ぜます。
  5. あらかじめ冷やした 50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナーを原油核準備を通過します。
  6. 40 mm のストレーナーは、3 mL 低糖バッファーと 500 mL の溶解バッファーに最終巻をもたらすことを追加の 1 mL 低糖バッファーを通過します。
  7. 同じ円錐管でプールを複数のコードを組み合わせる場合、手順 3.1-3.6.
  8. 4 ° C で 10 分間 3,200 x g でサンプルを遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。手順 5 に進みます。

4. 低張性機械セル換散

  1. 5 mL の培養皿に低張性溶解バッファーで腰椎の脊髄を配置します。春はさみの鈍い端を使用して、脊髄を二等分し、3-4 mm 部分にコードをカットする春のはさみを使用が、飾らないしないでください。
    注: 組織の 50 mg – 1.5 グラム正常に使用されます。
  2. 旋回 2-3 回、15 分間氷の上を孵化させなさい。
  3. 低張性の換散バッファーを希釈する HEB 媒体の 5 mL を追加します。
  4. 5 mL の血清ピペットで 10 回または組織の作品のすべてをスムーズにピペットの開口部を通って移動まで組織をカップ刻んだ。
  5. 徐々 に小さく直径 3 火磨かれたパスツール ピペットのシリーズ カップ刻んだ (~ 900-600 mm)。
    1. 各ピペット用カップ刻んだ 5-15 回、解決、解離核を含む上清の 1-2 mL を削除およびあらかじめ冷やした 50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナー通過する組織を許可します。
    2. 後製粉最小サイズ パスツール ピペット、ピペット チップを磨砕液がスムーズに流れることを確認します。50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナーを残りの溶液を通過します。
      注: triturations の合計数を調整することができますに応じて。マウス脊髄の髄膜が残りますが、脊髄の任意の目に見える塊をカップ刻んだことが重要です。40 m ストレーナーを残りの磨砕液を通過します。製粉中に気泡を導入することは避けてください。
  6. 4 ° C で 10 分間 1,000 x g でフィルターが適用されたサンプルを遠心分離します。遠心分離が完了、デカントし、上澄みを廃棄します。手順 5 に進みます。

5. 均質化とショ糖密度勾配

  1. ステップ 3 か 4 で後、は、3 mL の低糖バッファーを使用してペレットを再懸濁します。ゆっくりペレットを再懸濁のため壁から削除する旋回します。サンプルを 2 分間氷の上に座るし、懸濁液をオークリッジ管に転送ができます。
  2. ホモジナイザーを使用して 1 を設定すると、15-30 秒、氷のサンプルを維持するための低糖バッファー内核を均質化します。
    注: 使用 15 s 1 腰椎脊髄または 30 を使用して場合 s を使用して場合プールのサンプルまたは脊髄全体。
  3. 血清ピペット、12.5 mL の低糖バッファー ホモジネート、密度レイヤーを混乱させるバブルを作成することの世話の下に密度ショ糖バッファー層を使用しています。
  4. 4 ° C で 20 分 3,200 x g でチューブを遠心分離します。
  5. 遠心分離が完了したら、素早く動かす動きで上清をデカントすぐに。
    注: 音量とクリーナー最終サンプルを作成必要な場合に残気量 (400 mL 未満) ショ糖バッファーが破棄できるが、この残気量、核が含まれて、核収率を最大限に維持できます。
  6. 100 mL-再懸濁溶液 1 mL を使用すると、残りの壁に核再懸濁します。洗剤ベースの準備で残っているミエリン 'しかめ面' は避けてください。
  7. 30-35 mm 孔径ストレーナー核をフィルターし、事前冷却管で収集します。
  8. 核をもたらす対物レンズ 10 倍の下で核をカウントするため、検定を使用を決定します。
    注: トリパン ブルーは青表示すべき核を視覚化する追加できます。細胞の残骸の量に注意してください。
  9. ステップ 6 または 7 のいずれかに進みます。

6. 超並列 snRNA シーケンス: 学術プラットフォーム7

  1. (例えば、ドロップ Seq) 並列 snRNA のシーケンス処理の実行方法前述したように以下の変更7 :4
    1. 最終濃度 1 mL あたり 225 核に核を調整します。
    2. 1 mL あたり 250 ビーズの濃度でバーコード ビーズを準備します。
    3. 0.7 %sarkosyl の換散バッファーを準備します。
    4. ビーズ、核、毎分 35 mL、200 mL のオイルのための分あたりの毎分 35 mL に流量を調整します。

7. 超並列 snRNA シーケンス: 商業プラットホーム26

  1. 商業のプラットフォーム (例えば、クロム単一細胞遺伝子発現ソリューション) を使用して並列の snRNA シーケンス処理の実行によると、以下の変更を製造元の指示26製品。
    1. 次の逆のトランスクリプション、核細胞と比較して減少した cDNA を補うために標的細胞の回復に基づく cDNA 増幅サイクル数の計算に追加の PCR のサイクルを追加します。

結果

ここでは、下流の並列 RNA シーケンスの成体マウスの腰椎脊髄から核の分離を行った。プロトコルは 3 つの主要なコンポーネントを関与する: 組織混乱と細胞換散、均質化、およびショ糖密度遠心分離 (図 1)。秒以内に、洗剤機械換散は細胞およびティッシュの残骸 (図 2 a, 表 2) と同様に、核の数が多いと原油?...

ディスカッション

このプロトコルの究極の目標は、下流の転写解析のための高品質の RNA を含む核を分離することです。我々 は、すべての脊髄の細胞型をプロファイルするために snRNA Seq メソッドを適応しました。当初、ことが判明した典型的な細胞解離方法ない単一細胞 RNA シーケンス、効果的な脊髄神経が細胞死を特に受けやすい。さらに、細胞解離手法は 100 倍までいくつかによるさまざまな活動とスト?...

開示事項

我々 は明らかに利害の対立があります。

謝辞

この作品は、NINDS イントラミュラル プログラムによって支えられた (1 ZIA NS003153 02) と NIDCD (1 ZIA DC000059 18)。C. ケーテ原稿を確認して、テクニカル サポートと有用な議論の c. i. Dobrott L. 李を感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
SucroseInvitrogen15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0)Gibco15630-080
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
MgAcSigma AldrichM5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0)CorningMT-46034CI
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich10197777001Add DTT just prior to use
Triton-XSigma AldrichT8787
Nuclease-free waterCrystalgen221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4)Sigma AldrichT2194
5 M NaClSigma Aldrich59222C
1 M MgCl2Sigma AldrichM1028
Nonidet P40Sigma Aldrich74385
Hibernate-AGibcoA12475-01
Glutamax (100x)Gibco35050-061
B27 (50x)Gibco17504-044
1x PBSCrystalgen221-133-10
0.04% BSANew England BiolabsB9000S
0.2 U/μL RNAse InhibitorLucigen30281-1
Oak Ridge Centrifuge TubeThermo Scientific3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL)Kimble885303-002
Glass large clearance pestleKimble885301-0002
Glass small clearance pestleKimble885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax HomogenizerIKA3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G)IKA3304000
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
40 μm cell strainerFalcon352340
MACS SmartStrainers, 30 μmMiltenyi Biotec130-098-458
Conical tubesDenville Scientific1000799
Sorvall Legend XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle RotorThermo Fisher Scientific75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mLDenville ScientificP7127
HemocytometerDaigger ScientificEF16034F
Chemgenes Barcoding BeadsChemgenesMacosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm)Corning352235
MoFlo Astrios Cell SorterBeckman CoulterB25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10X Genomics120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns10X Genomics120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)Corning353002

参考文献

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

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