Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la integridad de barrera Hematotesticular inyectando inulina-FITC en los testículos. Este es un método eficiente en vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular que puede estar comprometida por elementos genéticos y ambientales.

Resumen

Espermatogénesis es el desarrollo de espermatogonias en espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos de los testículos. Este proceso es apoyado por las ensambladuras de la célula de Sertoli en la barrera del sangre-testis (BTB), que es la barrera de tejido más apretada en el cuerpo mamífero y segrega el epitelio seminífero en dos compartimentos, una basal y adluminal un. La BTB crea un microambiente único de las células germinales en la meiosis I / II y para el desarrollo de postmeiotic espermátides en espermatozoides por medio de la espermiogénesis. Aquí, describimos un análisis confiable para monitorear la integridad BTB de testículo de ratón en vivo. Un BTB intacto bloquea la difusión de la inulina FITC conjugado desde la basal en el compartimento apical de los túbulos seminíferos. Esta técnica es adecuada para el estudio de candidatos de genes, virus o tóxicos ambientales que pueden afectar la función BTB o integridad, con un procedimiento fácil y un requisito mínimo de habilidades quirúrgicas en comparación con métodos alternativos.

Introducción

Espermatogénesis mamíferos se consideran un proceso altamente estructurado que comprende espermatogonias de auto renovación y diferenciación a espermatocitos en espermatozoides haploides por mitosis, meiosis y espermiogénesis, que dramático ocurren cambios bioquímicos y morfológicos. Células germinales en desarrollo progresivamente son transportadas desde la base de los túbulos seminíferos hacia el lumen. Este proceso está regulado por los contactos de la célula entre las células germinales y células de Sertoli^1,2. Las células de Sertoli adyacentes forman la BTB se encuentra cerca de la base del túbulo seminífero. La BTB físicamente divide el epitelio en un básico y un compartimento adluminal. Durante las etapas VIII - IX del ciclo epitelial, espermatocitos preleptotene/leptoteno de los compartimentos basals migran a través de la BTB, entrar en los compartimientos adluminal del³. Por lo tanto, la función de la BTB es proporcionar un microambiente de immunoprivileged para la terminación de la meiosis y espermiogénesis^4,5,6. A diferencia de otras sangre-tejido barreras (e.g., barrera blood - brain) que se componen sólo de uniones estrechas (TJs), el BTB está formado por cuatro diferentes cruces (TJs, especializaciones ectoplasmáticos, ensambladuras de gap y base de filamento intermedio desmosomas) entre el Sertoli de células^1,7.

Muchos estudios han utilizado ratones modificados genéticamente, infecciones por virus y sustancias tóxicas ambientales para investigar mecanismos de BTB integridad^7,8,9. La interrupción de la BTB induce la espermatogénesis deteriorada y subfertilidad o infertilidad. Puesto que la formación de la BTB y la integridad han sido confirmados para ser afectado por los contactos entre las células de Sertoli⁸, un modelo en vitro basado en cultivo primario de células de Sertoli aisladas se ha utilizado para el estudio BTB. Sin embargo, este modelo no puede imitar exactamente BTB dinámica en vivo. Por otra parte, esa cultura no Co de las células germinales con las células de Sertoli se ha establecido como capaz de reflejar todos los componentes estructurales y funcionales relevantes de la BTB^10,11.

En general, en vivo ensayos de integridad BTB se basan normalmente en moléculas pequeñas, como EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina y conjugados con FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la difusión de la biotina o inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB. Por lo tanto, somos capaces de utilizar este método para evaluar la magnitud del daño de la BTB en comparación con grupos control. Mientras que TBB puede verse comprometida con ciertos tipos de estímulos, tales como el tratamiento con cadmio cloruro (CdCl₂)¹², BTB se convierte en accesible a moléculas pequeñas, que finalmente entran en el compartimento adluminal como indicadores.

Un temprano en vivo TBB integridad ensayo implica la inyección de biotina o inulina-FITC en la vena yugular, que consiste en una cirugía y es invasiva, complicado y desperdiciador de tiempo. Además, como las sustancias reportero difunden a través de todo el cuerpo vía la circulación, la concentración local de biotina o inulina-FITC en los túbulos seminíferos es limitada. Por otra parte, la exposición sistémica puede inducir reacciones inmunes. Aquí, presentamos un sencillo y eficaz en vivo TBB integridad ensayo que permite la inyección directa de una pequeña alícuota de inulina-FITC en el intersticio de un testículo. Usando el fluorescente etiquetado método, el proceso de tinción es conveniente, como anticuerpos secundarios no son necesarios. Aquí, se visualiza el proceso de colorante fluorescente en el testículo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados han sido aprobados por el Comité de la Universidad médica de Nanjing. Ratones machos C57BL/6 fueron mantenidos bajo condiciones de fotoperíodo controlado y proveyeron de alimentos y agua.

1. preparaciones

1. Capilares de microinyección
   1. Utilice capilares de microinyección con un diámetro externo, diámetro interno y longitud de 1.0 mm, 0,8 mm y 10,0 cm, respectivamente.
   2. Tire los capilares de vidrio con un capilar extractor (figura 1A). Prueba y ajuste la configuración según la máquina extractor capilar que está siendo utilizado.
   3. Romper las puntas de pipetas con pinzas a utilizar para obtener los capilares de un diámetro de 50 μm en la punta.
      Nota: Las puntas pueden ser demasiado largas para penetrar los testículos.
   4. Afilar la punta en un ángulo de 30° usando un beveler micropipeta (figura 1).
2. Reactivos
   1. Preparar 1% pentobarbital sódico: disolver sodio pentobarbital 100 mg en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (paso 2.3.3).
   2. Preparar la inulina-FITC de 10 mg/mL: disolver 1 mg en 100 μL de PBS (paso 2.1.6) inulina-FITC.
   3. Preparación de paraformaldehído al 4%: disolver paraformaldehido (PFA) 4 g en 100 mL de PBS (paso 2.3.3).
   4. Preparar 30% sacarosa: sacarosa 3 g en 10 mL de PBS (paso 2.3.4) se disuelven.
   5. Preparación de cloruro de cadmio 0.1%: disolver 10 mg en 10 mL de PBS (paso 2.1.1) de cloruro de cadmio.

2. métodos

1. Preparación anestesia y PREQUIRGICA
   1. Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis necesaria de CdCl₂. Tratar un grupo de ratones (n = 3) con CdCl₂ (5 mg/kg p.v., i.p.) durante 3 días antes de la cirugía. Tratar a otro grupo de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 (n = 3) con PBS como control.
   2. Realizar cirugía en condiciones asépticas mediante pinzas, aguja, tijeras y jeringa estéril.
   3. Preparar la solución de trabajo de anestesia recién. La dosis requerida de la anestesia es de 70 mg de pentobarbital de sodio/kg de peso corporal. En promedio, un adulto ratón C57BL/6 a 8 semanas de edad pesa ~ 25 g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital sódico (1,75 mg por ratón).
      Nota: El pentobarbital sódico se disuelve en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). La solución es filtrada por 0.22 um unidad de filtro antes de ser utilizados.
   4. Limpiar la zona para la cirugía con etanol al 75% y cubrir la zona con una toalla de papel limpia.
   5. Encienda el calentador termostático y ajustar la temperatura a 37 ° C.
   6. Preparar solución de trabajo de inulina-FITC (10 mg/mL) en el día de la cirugía.
2. Procedimiento quirúrgico
   1. Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis requerida de la anestesia.
   2. Realizar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio utilizando la jeringa estéril de 1 mL. Mantenga el ratón en una jaula limpia.
   3. Observar la respuesta refleja del ojo y patrón de respiración del ratón para confirmar que está bajo anestesia completa.
      Nota: Generalmente, 10-15 min se necesitan hasta que el ratón está profundamente anestesiado, con una total falta de respuesta de pellizco del dedo del pie y el mantenimiento de la respiración lenta y constante.
   4. Mueva el ratón a la zona de operación y cubrir la zona de los ojos con un papel de seda húmedo para evitar la sequedad durante la anestesia (figura 2A).
   5. Afeite su pelo abdominal con una afeitadora y desinfectar el área quirúrgica con etanol al 75%.
   6. Con unas tijeras afiladas, hacer una incisión en la piel de 1 cm por encima de las glándulas prepuciales para exponer la pared abdominal. Elevar la pared abdominal con pinzas pequeñas y haga una incisión de 0.5 cm para exponer la cavidad peritoneal (figura 2B).
   7. Utilice pinzas para buscar cojines gordos todo el epidídimo y testículo. Saque con cuidado las almohadillas de grasa para exponer claramente los testículos adjunto (figura 2 y 2D). Por lo general, operan sobre un testículo a la vez.
      Nota: Evite tocar las almohadillas de grasa y testículos con las manos.
   8. Coloca un papel (9 cm de diámetro) debajo de los cojines gordos y testículo (figura 2).
   9. Inyectar inulina-FITC en una pipeta de microinyección y conéctelo a la unidad de instrumental quirúrgico (figura 1). Suavemente inserte la pipeta de microinyección en la túnica albugínea y cargar un total de 20 μL de inulina-FITC en el intersticio del testículo (Figura 2E y 2F).
      Nota: Presione con cuidado la pipeta de microinyección para evitar moverlo.
   10. Vigilar el movimiento de inulina-FITC en los testículos (figura 2).
   11. Inmediatamente Coloque los testículos en la cavidad abdominal después de la terminación de la inyección.
   12. Repita el procedimiento en el testículo contralateral. Este testículo se inyecta con 20 μL de PBS como un control.
   13. Cierre la piel con una sutura quirúrgica y mueva el ratón a una almohadilla de calor de un calentador termostático (figura 1B). Administrar una dosis de 1 mg de analgésicos (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal vía inyección subcutánea.
3. Recolección de los testículos y la preparación de secciones congeladas
   1. 40 minutos después de la inyección, eutanasia el ratón receptor mediante dislocación cervical según el cuidado de los animales y utilizar las pautas.
   2. Utilice un par de tijeras afiladas para recoger los testículos. Coloque 1 mL de PBS helada para quitar cualquier contaminación de la sangre a los testículos.
   3. Fijar los testículos en paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 ° C durante 12-24 h. descartar el 4% PFA y lavado del tejido 3 x 1,5 ml de PBS 1% a temperatura ambiente.
   4. Deshidratar los tejidos en sacarosa al 30% durante la noche. Poner los testículos en el marco de la inclusión y cubrir el tejido con la temperatura óptima de corte compuesto (OCT). Después del OCT se congela, llene el marco de la inclusión de OCT para que el testículo entero puede ser cubierto con OCT.
   5. Corte secciones de 5 μm de espesor, congeladas de los testículos en un criostato a-20 ° C y que se adhieren al portaobjetos de microscopio.
      Nota: Volver a congelar tejidos embebidos en el hielo seco puede aumentar la rigidez para el corte.
4. Requisición de imagen
   1. Coloque los portaobjetos en una caja humidificada. Caliente las diapositivas en temperatura ambiente durante 10 minutos.
   2. Lávese las secciones de 3 x con solución salina tamponada con Tris (TBS) a temperatura ambiente.
   3. Secado con aire por 5 min en la oscuridad. Limpie cualquier residual TBS con papel libre de polvo.
   4. Cubrir las secciones transversales con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Coloque el cubreobjetos invertido sobre un portaobjetos de microscopio.
   5. Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal. Un total de 20 aumentos es suficiente para la detección de la señal fluorescente brillante.

Resultados

El montaje experimental para realizar el análisis de integridad BTB se muestra en la figura 1. Tire y afilar los capilares de la microinyección con tirador capilar y beveler micropipeta, respectivamente (figura 1A y 1C). El calentador termostático y equipo para la microinyección se ilustran en la figura 1B y 1D.

Discusión

Espermatogénesis tiene lugar en el epitelio seminífero y es un proceso altamente ordenado y dinámico que está regido por las células germinales y células somáticas (p. ej., las células de Sertoli)¹³. La estructura de la BTB, que está construida por células de Sertoli, divide el epitelio seminífero en un básico y un compartimiento apical. El desarrollo de las células germinales meióticas y haploides se produce en el compartimento apical que forma una barrera inmunol?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476