Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität durch Einspritzen von Inulin-FITC in Hoden zu beurteilen. Dies ist eine effiziente in Vivo -Methode, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren, die durch genetische und umweltbedingte Elemente beeinträchtigt werden kann.

Zusammenfassung

Spermatogenese ist die Entwicklung von Spermatogonien zu reifen Spermien in den seminiferous Röhrchen der Hoden. Dieser Prozess wird von Sertoli Zelle Kreuzungen an der Blut-Hoden-Schranke (BTB), unterstützt die engste Gewebe-Barriere im Säugetier-Körper und trennt die seminiferous Epithel in zwei Kammern, eine basale und eine Adluminal. Die BTB schafft eine einzigartige Mikroumgebung für Keimzellen in Meiose ich / II und für die Entwicklung der postmeiotic Spermatids in Spermien über Spermiogenesis. Hier beschreiben wir eine zuverlässige Assays zur Überwachung der BTB Integrität der Maus Hoden in Vivo. Eine intakte BTB blockiert die Diffusion der FITC konjugiert Inulin aus der basalen zum apikalen Fach von seminiferous Röhrchen. Diese Technik eignet sich für das Studium gen Kandidaten, Viren oder Umweltgifte, die BTB Funktion oder Integrität, ein einfaches Verfahren und eine minimale Anforderung von chirurgischen Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Methoden beeinflussen können.

Einleitung

Säugetier-Spermatogenese wird einen sehr strukturierten Prozess betrachtet, der spermatogonial Selbsterneuerung und Differenzierung durch Spermatozyten in haploide Spermien über Mitose und Meiose Spermiogenesis, während die dramatischen umfasst biochemische und morphologische Veränderungen auftreten. Entwickelnden Keimzellen werden schrittweise von der Basis von seminiferous Röhrchen in Richtung Lumen transportiert. Dieser Prozess wird durch Zell-Zell-Kontakte zwischen den Keimzellen und Sertoli-Zellen^1,2geregelt. Benachbarte Sertoli-Zellen bilden die BTB, die nahe der Unterseite von seminiferous Röhrchen befindet. Die BTB teilt physisch das Epithel in eine basale und ein Adluminal Fach. In Phasen VIII - IX des Kreislaufs epithelialen migrieren Preleptotene/Leptotän Spermatozyten aus der basalen Fächer auf der BTB, Eingabe der Adluminal Fächer³. Daher soll die Funktion der BTB eine Immunabwehr Mikroumgebung für den Abschluss der Meiose und Spermiogenesis^4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Gewebeprobe Barrieren (z.B., Blut - Hirn-Schranke), die nur von tight Junctions (TJs) bestehen, bildet die BTB vier verschiedene Kreuzungen (TJs ectoplasmic Spezialisierungen, Gap Junctions und Intermediate Filament-basierte Desmosomes) zwischen den Sertoli-Zellen^1,7.

Viele Studien haben genetisch veränderte Mäuse, Virus-Infektionen und Umweltgifte verwendet, um die Mechanismen von BTB Integrität^7,8,9zu untersuchen. Die BTB-Störung induziert eingeschränkter Spermatogenese und Subfertilität oder Unfruchtbarkeit. Da die BTB Bildung und Integrität bestätigt wurden Kontakte zwischen den Sertoli-Zellen⁸betroffen zu sein, hat eine in-vitro- Modell basierend auf Primärkultur von isolierten Sertoli-Zellen verwendet worden für BTB-Studie. Dieses Modell kann nicht jedoch genau BTB Dynamik in Vivoimitieren. Darüber hinaus wurde keine solche Kokulturen von Keimzellen mit Sertoli-Zellen in der Lage, alle relevante strukturelle und funktionelle Komponenten der BTB^10,11reflektieren gegründet.

Im Allgemeinen basieren in der Regel in Vivo BTB Integrität Assays auf kleinen Molekülen, wie EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin und FITC konjugiert Inulin (Inulin-FITC). Normalerweise wird die Diffusion von Biotin oder Inulin-FITC aus dem basalen Fach von BTB Struktur blockiert. Daher sind wir in der Lage, diese Methode zu verwenden, um zu prüfen, inwieweit der BTB Schaden im Vergleich zu Kontrollgruppen. Während bestimmte Reize, wie Behandlung mit Cadmium Chlorid (CdCl₂)¹², BTB kompromittiert werden kann wird BTB für kleine Moleküle, die schließlich das Adluminal Fach als Indikatoren geben Sie zugänglich.

Ein frühe in Vivo BTB Integrität Assay wird Biotin oder Inulin-FITC in die Halsschlagader, die Chirurgie umfasst, und ist invasiv, kompliziert und zeitaufwändig. Außerdem, wie Reporter Stoffe durch den ganzen Körper über den Blutkreislauf diffundieren, beschränkt sich die lokale Konzentration von Biotin oder Inulin-FITC in seminiferous Röhrchen. Darüber hinaus kann systemische Exposition Immunreaktionen auslösen. Hier präsentieren wir Ihnen einen einfache und effektive in Vivo BTB Integrität Assay ermöglicht direkten Einspritzung von einer kleinen aliquoten Inulin-FITC in das Interstitium ein Hoden. Die fluoreszierenden Kennzeichnung Methode verwenden, ist die Färbung Prozess praktisch, da sekundäre Antikörper nicht erforderlich sind. Hier wird der Prozess der Fluoreszenzfarbstoff Eintritt in den Hoden visualisiert.

Protokoll

Alle durchgeführten Tierversuche wurden von der Nanjing Medical University-Ausschuss genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäusen wurden unter kontrollierter Photoperiode Bedingungen gehalten und waren mit Nahrung und Wasser versorgt.

1. Vorbereitungen

1. Mikroinjektion Kapillaren
   1. Verwenden Sie Mikroinjektion Kapillaren bzw. mit einem Außendurchmesser, innere Dimeter und Länge von 1,0 mm, 0,8 mm und 10,0 cm.
   2. Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Kapillar Abzieher (Abbildung 1A). Testen Sie und passen Sie die Einstellungen abhängig von der Kapillare Puller-Maschine, die verwendet wird.
   3. Brechen Sie die Pipettenspitzen mit der Pinzette verwenden, um die Kapillaren mit einem 50 µm Durchmesser an der Spitze zu erhalten.
      Hinweis: Die Tipps möglicherweise zu lang, um den Hoden zu durchdringen.
   4. Schärfen Sie die Spitze in einem 30°-Winkel mithilfe einer Mikropipette Beyeler (Abbildung 1).
2. Reagenzien
   1. Bereiten Sie 1 % Pentobarbital-Natrium: Natrium Pentobarbital 100 mg in 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Schritt 2.3.3) auflösen.
   2. 10 mg/mL Inulin-FITC vorbereiten: Auflösen von Inulin-FITC 1 mg in 100 μl PBS (Schritt 2.1.6).
   3. Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd: Auflösen von Paraformaldehyd (PFA) 4 g in 100 mL PBS (Schritt 2.3.3).
   4. 30 % Saccharose vorbereiten: Saccharose 3 g in 10 mL PBS (Schritt 2.3.4) auflösen.
   5. 0,1 % Cadmium Chlorid vorbereiten: Auflösen von Cadmium Chlorid 10 mg in 10 mL PBS (Schritt 2.1.1).

(2) Methoden

1. Anästhesie und Presurgery Vorbereitung
   1. 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von CdCl₂zu berechnen. Eine Gruppe von Mäusen zu behandeln (n = 3) mit CdCl₂ (5 mg/kg b.w., i.p.) für 3-d vor der Operation. Eine weitere Gruppe von 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse zu behandeln (n = 3) mit PBS als Kontrolle.
   2. Führen Sie Operation unter aseptischen Bedingungen mithilfe sterile Spritze, Nadel, Schere und Zange aus.
   3. Anästhesie Arbeitslösung frisch zubereiten. Die erforderliche Dosis von Anästhesie ist 70 mg Pentobarbital-Natrium/kg Körpergewicht. Im Durchschnitt wiegt ein Erwachsener C57BL/6 Mäuse im Alter von 8 Wochen ~ 25 g, das entspricht 175 μL der 1 %-Pentobarbital-Natrium (1,75 mg / Maus).
      Hinweis: Das Natrium Pentobarbital wird in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst. Die Lösung wird filtriert von 0,22 Umm Filtereinheit vor der Verwendung.
   4. Reinigen Sie den Bereich für die Chirurgie mit 75 % Ethanol und die Fläche mit einem sauberen Tuch Handtuch.
   5. Schalten Sie den Thermostat Heizung und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
   6. Inulin-FITC funktionierende Lösung (10 mg/mL) am Tag der Operation vorzubereiten.
2. Chirurgischer Eingriff
   1. 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von Anästhesie zu berechnen.
   2. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium mit der 1-mL sterile Spritze. Halten Sie die Maustaste in einem sauberen Käfig.
   3. Beachten Sie die reflex Reaktion des Auges und Atemmuster der Maus zu bestätigen, dass es komplette Narkose ist.
      Hinweis: In der Regel 10-15 min sind nötig, bis die Maus mit einen völligen Mangel an Zehe Prise Reaktion und Wartung von langsamen, stetigen Atmung tief betäubt ist.
   4. Bewegen Sie die Maus auf das OP-Feld und decken Sie ihre Augenpartie mit einem feuchten Papiertuch zu Trockenheit während der Narkose (Abbildung 2A) zu vermeiden.
   5. Rasieren Sie seinen Bauch Haare mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 75 % Ethanol.
   6. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen Hautschnitt von 1 cm oberhalb der Präputial Drüsen, die Bauchdecke verfügbar zu machen. Heben der Bauchdecke mit kleinen Zangen und einem 0,5 cm Einschnitt, der Bauchhöhle (Abb. 2 b) verfügbar zu machen.
   7. Verwenden Sie Zange zur Fettpolster um die Nebenhoden und Hoden Suche. Ziehen Sie vorsichtig die Fettpolster heraus, um den beigefügten Hoden deutlich verfügbar zu machen (Abbildung 2 und 2D). In der Regel auf einem Hoden gleichzeitig betreiben.
      Hinweis: Berühren Sie die Fettpolster und Hoden mit Händen.
   8. Legen Sie eine Papier (9 cm Durchmesser) unter dem Fettpolster und Hoden (Abbildung 2).
   9. Injizieren Sie Inulin-FITC in einer Mikroinjektion Pipette und schließen Sie es an das defekte Gerät (Abbildung 1). Sanft legen Sie die Mikroinjektion Pipette unter der Tunica Albuginea und laden Sie insgesamt 20 μL der Inulin-FITC in das Interstitium der Hoden (Abb. 2E und 2F).
      Hinweis: Drücken Sie vorsichtig die Mikroinjektion Pipette, um zu vermeiden, wenn Sie ihn bewegen.
   10. Überwachen Sie die Bewegung der Inulin-FITC in den Hoden (Abbildung 2).
   11. Sofort setzen Sie die Hoden wieder in die Bauchhöhle nach Abschluss der Injektion.
   12. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Diese Hoden wird mit 20 μl PBS als Steuerelement injiziert.
   13. Schließen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht und bewegen Sie die Maus auf einem Wärmekissen eines thermostatischen Heizung (Abbildung 1 b). Verabreichen Sie eine Dosis von 1 mg Analgetikum (Buprenorphin) pro 1 kg Körpergewicht durch subkutane Injektion.
3. Ernte der Hoden und Gefrierschnitte Vorbereitung
   1. 40 min nach der Injektion die Empfänger Maus durch zervikale Dislokation nach Tierbetreuung einschläfern und Richtlinien.
   2. Verwenden Sie ein paar der scharfen Schere um die Hoden zu sammeln. Legen Sie die Hoden in 1 mL eiskaltem PBS, Verunreinigungen Blut zu entfernen.
   3. Beheben den Hoden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C für 12-24 h. verwerfen die 4 % PFA und waschen das Gewebe 3 X mit 1,5 mL 1 % PBS bei Raumtemperatur.
   4. Das Gewebe in 30 % Saccharose über Nacht austrocknen. Den Hoden in der einbettenden Rahmen und bedecken Sie das Gewebe mit optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte (OCT). Nachdem das Office-Anpassungstool gesperrt ist, OCT füllen Sie einbetten Frame ein, so dass der ganze Hoden mit OCT abgedeckt werden kann.
   5. Schnitt 5 μm Dicke, gefrorene Querschnitte der Hoden in einem Kryostaten bei-20 ° C und lassen sie die Objektträger einhalten.
      Hinweis: Reinigungserinnerung eingebetteten Gewebe in Trockeneis erhöht die Steifigkeit zum Schneiden.
4. Bild-Suchauftrag
   1. Legen Sie die Folien in einer befeuchteten Box. Die Folien bei Raumtemperatur für 10 min warm.
   2. Waschen Sie die Abschnitte 3 X mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bei Raumtemperatur.
   3. An der Luft trocknen Sie für 5 min in der Dunkelheit. Wischen Sie alle verbleibenden TBS mit staubfreien Papier.
   4. Decken Sie die Querschnitte mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Ort der invertierten Deckglas auf einen Objektträger.
   5. Abrufen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop. Insgesamt 20 X Vergrößerung ist in der Regel ausreichend für die Erkennung der hell Fluoreszenzsignal.

Ergebnisse

Der Versuchsaufbau für die Durchführung der BTB-Integrität-Assay ist in Abbildung 1dargestellt. Ziehen und Mikroinjektion Kapillaren mit einer Kapillare Puller und Mikropipette Beyeler, bzw. zu schärfen (Abb. 1A und 1 C). Der Thermostat Heizung und Ausrüstung für die Mikroinjektion sind in Abbildung 1 b und 1Ddargestellt.

Diskussion

Spermatogenese findet in seminiferous Epithel und ist ein hoch geordneten und dynamischen Prozess, die Keimzellen und somatischen Zellen unterliegt (z. B. Sertoli-Zellen)¹³. Die BTB-Struktur, die durch die Sertoli-Zellen aufgebaut ist, teilt die seminiferous Epithel in eine basale und eine apikale Fach. Die Entwicklung der meiotischen und haploiden Keimzellen erfolgt in der apikalen Fach bildet eine immunologische Barriere¹⁴.

Di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476