В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки целостности барьер крови яичка путем впрыскивать инулин FITC в яичках. Это эффективно в vivo метод для изучения крови яички барьер целостности, которая может быть скомпрометирована генетических и экологических элементов.

Аннотация

Сперматогенез является развитие сперматогонии в зрелых сперматозоидов в семенных канальцев яичек. Этот процесс поддерживается соединения клеток Сертоли на крови яички барьер (BTB), который является плотные ткани барьер в организме млекопитающих и сегрегирует семенных эпителия в двух отсеков, базальный и adluminal. BTB создает уникальный микроокружение для клетки семенозачатка в мейоз I / II и для развития postmeiotic сперматид в сперматозоидов через spermiogenesis. Здесь мы описываем надежный пробирного контролировать целостность BTB мыши яичка в естественных условиях. Нетронутыми BTB блокирует распространение FITC-конъюгированных инулин из базальных апикальной отсек семенных канальцев. Этот метод подходит для изучения генов кандидатов, вирусы или экологических токсикантов, которые могут повлиять на функцию BTB или целостность, с простой процедурой и минимальное требование хирургических навыков, по сравнению с альтернативными методами.

Введение

У млекопитающих сперматогенез считается весьма структурированный процесс, который охватывает сперматогониальные самообновлению и дифференциация через сперматоцитах в haploid сперматозоидов через митоз, мейоз и spermiogenesis, во время которого драматического биохимические и морфологические изменения происходят. Постепенно развивающиеся клетки семенозачатка перевозятся от основания семенных канальцах сторону просвета. Этот процесс регулируется ячеек контактов между зародышевых клеток и клеток Сертоли^1,2. Соседние клетки Сертоли образуют BTB, который расположен рядом с базой семенных канальцах. BTB физически делит эпителия на базальную и adluminal отделения. Во время этапа VIII - IX эпителиальных цикла, сперматоцитах preleptotene/leptotene от базальной отсеков мигрируют по BTB, ввод в adluminal отсеков³. Таким образом функция BTB является предоставить immunoprivileged микроокружение для завершения мейоза и spermiogenesis^4,5,6. В отличие от других крови тканевые барьеры (например, blood - brain барьер) которые состоят только из плотных узлов (сомони) BTB формируется четыре различных узлов (сомони, ectoplasmic специализаций, разрыв соединения и среднего на основе накаливания Десмосомы) между Сертоли клетки^1,7.

Многие исследования использовали генетически измененных мышей, вирусных инфекций и экологических токсикантов расследовать механизмов BTB целостности^7,8,9. BTB срыв индуцирует нарушение сперматогенеза и менструальной или бесплодия. Поскольку формирование БТБ и целостность были подтверждены пострадать от контактов между клеток Сертоли⁸, была использована модель в пробирке , основанный на первичной культуре изолированных клеток Сертоли BTB исследования. Однако эта модель не может точно имитировать BTB динамика в естественных условиях. Кроме того нет такого совместного культуры зародышевых клеток с клеток Сертоли был создан как способной отражать всех соответствующих структурных и функциональных компонентов BTB^10,11.

В общем в естественных условиях BTB целостности анализов обычно основаны на малых молекул, как EZ-Link сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин и конъюгированных FITC инулин (инулин FITC). Как правило распространение биотин или инулина FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры. Таким образом мы имеем возможность использовать этот метод для оценки масштабов ущерба BTB, по сравнению с контрольными группами. В то время как BTB может быть скомпрометирована с определенными типами раздражителей, таких как лечение с Кадмий хлористый (₂CdCl)¹², BTB становится доступной для малых молекул, которые в конечном итоге войти в adluminal отделение как индикаторы.

Начале в vivo BTB целостности assay включает инъекции биотина или инулина FITC в яремной вены, которая включает операции и инвазивных, сложным и трудоемким. Кроме того как репортер веществ диффузной через все тело через кровообращение, местные концентрация биотина или инулина FITC в семенных канальцев ограничен. Кроме того системного воздействия могут вызвать иммунных реакций. Здесь мы представляем простой и эффективный в vivo BTB целостности пробирного включение прямого впрыска небольшой Алиготе инулин FITC в интерстиции яичка. Флуоресцентные метки метода, процесс окрашивания удобно использовать, как вторичные антитела не требуются. Здесь визуализировать процесс Люминесцентную краску, введя яички.

протокол

Все выполненные эксперименты на животных были утверждены Комитетом медицинского университета Нанкин. Самцов мышей C57BL/6 хранились в контролируемых фотопериода условиях и были поставлены с пищей и водой.

1. Подготовка

1. Микроинъекции капилляров
   1. Используйте микроинъекции капилляров с наружным диаметром, Внутренний диметр и длина 1,0 мм, 0.8 мм и 10,0 см, соответственно.
   2. Вытяните стеклянных капилляров с капиллярной съемник (рис. 1A). Проверить и настроить параметры в зависимости от капиллярной съемник машина, которая используется.
   3. Разорвать наконечники с щипцами для использования для получения капилляров диаметром 50 микрон на кончике.
      Примечание: Советы могут быть слишком длинным, чтобы проникать яички.
   4. Точить кончиком в угол 30° с помощью микропипеткой установка (рис. 1 c).
2. Реактивы
   1. Подготовка 1% Пентобарбитал натрия: растворить Пентобарбитал натрия 100 мг в 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (шаг 2.3.3).
   2. Подготовка 10 мг/мл инулин FITC: растворить инулин FITC 1 мг в 100 мкл PBS (шаг 2.1.6).
   3. Подготовить параформальдегида 4%: растворить параформальдегида (PFA) 4 g в 100 мл PBS (шаг 2.3.3).
   4. Подготовка 30% сахарозы: растворить сахарозы 3 g в 10 мл PBS (шаг 2.3.4).
   5. Подготовить 0,1% хлорид кадмия: растворить Кадмий хлористый 10 мг в 10 мл PBS (шаг 2.1.1).

2. методы

1. Анестезия и presurgery подготовка
   1. Весят 8-недельных самцов мышей C57BL/6 и рассчитать необходимые дозы CdCl₂. Относиться к группе мышей (n = 3) с₂ CdCl (5 мг/кг веса тела, и.п.) для 3 d до операции. Лечить еще одна группа 8-недельных самцов мышей C57BL/6 (n = 3) с PBS как элемент управления.
   2. Выполняют операции в асептических условиях с помощью стерильного шприца, иглы, ножницы и пинцет.
   3. Свеже Подготовьте анестезии рабочие решения. Необходимая доза наркоза-70 мг Пентобарбитал натрия/кг массы тела. В среднем Взрослый C57BL/6 мышь в возрасте 8 недель весит ~ 25 г, что соответствует 175 мкл Пентобарбитал натрия 1% (1,75 мг на мыши).
      Примечание: Пентобарбитал натрия растворяют в стерильной фосфат амортизированное saline (PBS). Решение фильтруется по 0,22 мкм фильтр перед их использованием.
   4. Чистота области хирургии с 75% этанола и охватывают область с полотенцем чистой ткани.
   5. Включите Термостатический подогреватель и отрегулировать температуру до 37 ° C.
   6. Подготовьте инулин FITC рабочего раствора (10 мг/мл) в день операции.
2. Хирургическая процедура
   1. Весят 8-недельных самцов мышей C57BL/6 и рассчитать необходимые дозы анестезии.
   2. Выполните внутрибрюшинного введения Пентобарбитал натрия с использованием 1 мл стерильного шприца. Держите мышь в чистой клетке.
   3. Соблюдайте глаз рефлекторной реакции и ритм дыхания, мыши, чтобы подтвердить, что она находится под полным наркозом.
      Примечание: Обычно 10-15 мин необходимы до тех пор, пока мышь находится глубоко под наркозом, полное отсутствие мыс щепотку ответ и обслуживании медленное, Постоянное дыхание.
   4. Переместить мышь в районе операции и охватывают области его глаз с влажные папиросной бумаги, чтобы избежать сухости во время анестезии (рисунок 2A).
   5. Побрить его живота волос с бритвы и дезинфицировать области хирургии с 75% этанола.
   6. Острыми ножницами делают разрез кожи 1 см выше препуция желез подвергать брюшной стенки. Поднимите брюшной стенки с небольшой щипцами и сделать 0,5 см разрез подвергать брюшной полости (рис. 2B).
   7. Используйте щипцы для поиска жировых отложений вокруг яичка и придатка яичка. Осторожно выдвиньте жировых отложений подвергать прилагаемый яички четко (рис. 2 c и 2D). Как правило работают на одного яичка одновременно.
      Примечание: Не прикасайтесь жировых отложений и яичка с руками.
   8. Поместите бумагу (9 см в диаметре) под жировых отложений и яички (рис. 2 c).
   9. Инулин FITC придать микроинъекции пипетки и подключить его к микроманипулятор блок (рис. 1 d). Аккуратно вставьте дозатор микроинъекции под белочной и загрузить в общей сложности 20 мкл инулин FITC в интерстиции яичка (Рисунок 2E и 2F).
      Примечание: Тщательно отпустите пипетки микроинъекции во избежание его перемещения.
   10. Мониторинг движения инулин FITC в яичка (рис. 2 g).
   11. Немедленно вернуть яичка в брюшной полости после завершения инъекций.
   12. Повторите процедуру на контралатеральной яички. Этот яички вводят 20 мкл PBS как элемент управления.
   13. Закройте кожи с шовного и переместить мышь на площадку тепла Термостатический подогреватель (рис. 1B). Администрирование в дозе 1 мг обезболивающее (бупренорфин) на 1 кг массы тела через подкожные инъекции.
3. Уборки семенников и замороженной секции подготовки
   1. 40 мин после инъекции, усыпить получателя мыши от шейки матки дислокации по уходу за животными и использовать руководящие принципы.
   2. Используйте пару острых ножниц собирать яички. Поместите яички в 1 мл ледяной PBS для удаления любого заражения крови.
   3. Исправить яичек в параформальдегида 4% (PFA) при 4 ° C для 12-24 ч. отменить 4% PFA и мыть ткань 3 x 1,5 мл 1% PBS при комнатной температуре.
   4. Обезвоживает ткани в 30% сахарозы на ночь. Поместить яички в рамках внедрения и покрывают ткани с оптимального раскроя температура смеси (OCT). После октября замораживается, заполните внедрения кадр с октября так, что весь яички могут быть покрыты с Окт.
   5. Cut-толщиной 5 мкм, замороженных сечений яичек в криостата при-20 ° C и пусть они придерживаться скольжениях микроскопа.
      Примечание: Замерзания встроенных ткани в сухой лед может увеличить жесткость для резки.
4. Реквизиции изображения
   1. Место слайды в коробке увлажненной. Теплый слайды при комнатной температуре в течение 10 мин.
   2. Вымойте секции 3 x с трис амортизированное saline (TBS) при комнатной температуре.
   3. Просушите на 5 мин в темноте. Стереть любые остаточные TBS с бумажной пыли.
   4. Обложка сечений с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Перевернутый coverslip место на слайде микроскопа.
   5. Получение изображений с помощью конфокального микроскопа. В общей сложности 20 X увеличение как правило, достаточно для обнаружения ярких флуоресцентного сигнала.

Результаты

Экспериментальная установка для выполнения анализа целостности BTB показан на рисунке 1. Тянуть и точить микроинъекции капилляров с капиллярной съемник и микропипеткой оборудованием, соответственно (рис. 1A и 1 C). Термостатическ...

Обсуждение

Сперматогенез занимает место в эпителии семенных и является весьма упорядоченный и динамичный процесс, который регулируется зародышевых клеток и соматических клеток (например, клеток Сертоли)¹³. BTB структуры, которая построена путем клеток Сертоли, делит семенны?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476