JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.

Abstract

יצירת זרע הוא הפיתוח של spermatogonia לתוך spermatozoa בוגרת ב בקוריאנית וכמה של בזרמה. תהליך זה נתמך על ידי צמתי תא סרטולי-מחסום דם-testis (BTB), אשר היא המכשול הכי צפופה רקמות בגוף יונקים segregates האפיתל וכמה לתוך שני תאים, על הבסיס של adluminal. BTB יוצרת microenvironment ייחודי בתאי הנבט, מיוזה אני / II ועל ההתפתחות של postmeiotic spermatids לתוך spermatozoa דרך spermiogenesis. כאן, אנו מתארים וזמינותו אמין כדי לפקח BTB שלמות של העכבר testis ויוו. BTB שלם חוסם פעפוע של FITC מצומדת אינולין מן הבסיס כדי תא הפסגה של בקוריאנית וכמה. טכניקה זו מתאימה ללמוד מועמדים הגן, וירוסים או חשיפה לרעלים סביבתיים שעשויים להשפיע על תפקוד BTB או תקינות, עם הליך קל, דרישה מינימלית של היכולות הכירורגיים לעומת שיטות אלטרנטיביות.

Introduction

בתרבית של יצירת זרע נחשב תהליך מובנה מאוד שמקיף התחדשות עצמית spermatogonial ובידול דרך spermatocytes לתוך spermatozoa הפלואידי באמצעות מיטוזה, מיוזה, spermiogenesis, שבמהלכו דרמטי שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים להתרחש. מתפתחות בתאי הנבט מועברים בהדרגה מבסיס של צנורית וכמה לכיוון לומן. תהליך זה מוסדר על ידי תאים תאים הקשר בין בתאי הנבט סרטולי תאים1,2. התאים Sertoli הסמוכים טופס BTB הממוקמת ליד בסיס צנורית וכמה. BTB מחלק פיזית האפיתל של הבסיס, תא של adluminal. בשלבים השמיני - התשיעי של מחזור אפיתל, preleptotene/leptotene spermatocytes מן התאים הבזליים לנדוד בין BTB, להזין את התאים adluminal3. לכן, תפקוד BTB נועד לספק של microenvironment immunoprivileged להשלמת מיוזה, spermiogenesis4,5,6. בניגוד רקמות דם מכשולים אחרים (למשל, מחסום הדם - מוח) רק המורכבות צמתי צר (TJs), BTB נוצרת על ידי ארבעה צמתים שונים (TJs מתמחה רוחות, הפער צמתי, ביניים מבוסס-פילמנט desmosomes) בין סרטולי תאים1,7.

מחקרים רבים השתמשו מהונדס גנטית עכברים הידבקות בווירוסים, חשיפה לרעלים סביבתיים כדי לחקור מנגנונים של BTB שלמות7,8,9. השיבוש BTB מעוררת יצירת זרע לקוי ולא subfertility או אי פוריות. מאז היווצרות BTB ותקינות אושרו להיות מושפעות מגעים בין תאי סרטולי8, במבחנה מודל המבוסס על תרבות העיקרי של תאי סרטולי מבודד שימש למחקר BTB. עם זאת, מודל זה במדויק לא יכול לחקות BTB dynamics vivo בתוך. יתר על כן, אין תרבות משותפת כזו תאי נבט עם תאי סרטולי נוצרה כמו מסוגל המשקף את כל הרכיבים פונקציונלי מבניים הרלוונטיים של ה BTB10,11.

באופן כללי, אין ויוו מבחני יושרה BTB מבוססים בדרך כלל על מולקולות קטנות, כגון EZ-קישור Sulfo-NHS-LC-ביוטין, אינולין FITC מצומדת (אינולין-FITC). בדרך כלל, פעפוע של ביוטין או אינולין-FITC מן התא הבסיס חסומה על-ידי BTB מבנה. לכן, אנו מסוגלים להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את היקף הנזק BTB לעומת קבוצות שליטה. בעוד BTB יכול להיות בסכנה עם סוגים מסוימים של גירויים, כגון טיפול עם קדמיום כלוריד (CdCl2)12, BTB הופך נגיש מולקולות קטנות, אשר בסופו של דבר הזן תא adluminal מחוונים.

מוקדם ויוו BTB שלמות assay המוחלשים ביוטין או אינולין-FITC לתוך ומוחלף על, אשר כרוך הניתוח, היא פולשנית, מסובך, גוזלת זמן. חוץ מזה, כל החומרים כתב מפוזרת באמצעות הגוף כולו דרך מחזור הדם, הריכוז המקומי של ביוטין או אינולין-FITC ב בקוריאנית וכמה הוא מוגבל. יתר על כן, חשיפה מערכתית עלול לגרום לתגובות החיסון. כאן, אנו מציגים פשוטה ויעילה ויוו BTB שלמות assay הפעלת הזרקה ישירה של aliquot קטן של אינולין-FITC לתוך interstitium של מבחן. שימוש של פלורסנט שיטת תיוג, התהליך מכתימים הוא נוח, כמו נוגדנים משניים אינם נדרשים. כאן, התהליך של הפלורסנט הזנת בזרמה הוא מדמיין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת נאנג'ינג הרפואי האוניברסיטאי. זכר C57BL/6 הוחזקו בתנאים מבוקרים photoperiod ועכברים סופקו עם מים ואוכל.

1. תכשירים

  1. נימים microinjection
    1. השתמש microinjection נימים עם הקוטר החיצוני, dimeter הפנימית, אורך של 1.0 מ מ, מ מ 0.8 ס מ 10.0, בהתאמה.
    2. משוך נימים זכוכית עם פולר נימי (איור 1 א'). לבדוק ולהתאים את ההגדרות בהתאם המכונה פולר קפילרי נמצא בשימוש.
    3. לשבור את הטיפים פיפטה עם מלקחיים להשתמש כדי להשיג נימים של קוטר 50-מיקרומטר בקצה.
      הערה: הטיפים עשוי להיות ארוך מדי לחדור בזרמה.
    4. לחדד את הטיפ בזווית של 30 מעלות על-ידי שימוש של beveler micropipette (איור 1C).
  2. ריאגנטים
    1. להכין סודיום פנטוברביטל 1%: להמיס סודיום פנטוברביטל 100 מ ג, 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (שלב 2.3.3).
    2. הכינו 10 מ"ג/מ"ל אינולין-FITC: להמיס אינולין-FITC 1 מ ג, 100 μL ל- PBS (שלב 2.1.6).
    3. להכין 4% paraformaldehyde: להמיס paraformaldehyde (PFA) 4 g ב- 100 מ של PBS (שלב 2.3.3).
    4. הכנת 30% סוכרוז: להמיס סוכרוז 3g ב 10 מ"ל ל- PBS (שלב 2.3.4).
    5. הכנת 0.1% כלוריד קדמיום: להמיס קדמיום כלוריד 10 מ ג של 10 מ"ל ל- PBS (שלב 2.1.1).

2. שיטות

  1. הכנה מטופל והרדמה
    1. שוקל 8 בת C57BL/6 עכברים זכרים ולחשב את המינון הנדרש של CdCl2. מתייחסים קבוצה של עכברים (n = 3) עם CdCl2 (5 מ"ג/ק"ג b.w., i.p.) עבור 3 d לפני הניתוח. להתייחס לקבוצה אחרת של עכברים זכר בן שבוע 8 C57BL/6 (n = 3) עם PBS הפקד.
    2. לבצע ניתוח בתנאים aseptic באמצעות מזרק סטרילי, מחט, מספריים, מלקחיים.
    3. להכין את הפתרון עובד הרדמה טרי. המינון הנדרש של הרדמה הוא 70 מ ג של סודיום פנטוברביטל/kg של משקל גוף. בממוצע, העכבר C57BL/6 מבוגרים בגיל 8 שבועות שוקל ~ 25 גרם, המתאים μL 175 של 1% סודיום פנטוברביטל (1.75 מ ג לכל העכבר).
      הערה: סודיום פנטוברביטל הוא מומס סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). הפתרון סוננו לפי 0.22 יחידת מסנן לפני השימוש בו.
    4. לנקות את האזור. למטרת ניתוח עם 75% אתנול ולכסות את האזור עם מגבת נקייה רקמות.
    5. את החימום תרמוסטטי ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס.
    6. להכין את הפתרון עובד אינולין-FITC (10 mg/mL) ביום של הניתוח.
  2. הליך כירורגי
    1. שוקל 8 בת C57BL/6 עכברים זכרים ולחשב את המינון הנדרש של הרדמה.
    2. לבצע זריקה בקרום הבטן של סודיום פנטוברביטל באמצעות המזרק עקר 1-mL. שמור את העכבר בתוך כלוב נקי.
    3. לבחון את תגובת רפלקס העין ואת דפוס הנשימה של העכבר כדי לוודא שזהו אכן בהרדמה מלאה.
      הערה: בדרך כלל, 10-15 דקות נדרשים עד העכבר עמוקות מרדימים, עם חוסר מוחלט של הבוהן קמצוץ התגובה ותחזוקה של לנשום לאט, יציב.
    4. להזיז את העכבר אל אזור הפעולה ולכסות אזור העין שלו עם נייר טישו לח למנוע יובש במהלך הרדמה (איור 2 א).
    5. לגלח את השיער בבטן שלה עם גילוח ולחטא באזור הניתוח עם 75% אתנול.
    6. עם מספריים חדות, עושים חתך בעור 1 ס"מ מעל בלוטות preputial לחשוף את דופן הבטן. הרם את דופן הבטן עם מלקחיים קטנים, עושים חתך 0.5 ס מ כדי לחשוף את חלל הצפק (איור 2B).
    7. להשתמש מלקחיים כדי לחפש עבור רפידות שומן סביב יותרת האשך testis. משוך בזהירות את רפידות השמן לחשוף בזרמה המצורפת בבירור (איור 2C ו- 2D). בדרך כלל, פועל על testis אחד בכל פעם.
      הערה: להימנע מלגעת את רפידות השמן ואת testis עם הידיים.
    8. מניחים נייר (9 ס מ קוטר) מתחת רפידות השמן ואת testis (איור 2C).
    9. להזריק אינולין-FITC לתוך פיפטה microinjection וחבר אותו ליחידה micromanipulator (איור 1D). בעדינות להוסיף על פיפטה microinjection תחת albuginea tunica, טען סך של 20 μL של אינולין-FITC interstitium של בזרמה (איור 2E ו- 2F).
      הערה: נלחצים היטב על פיפטה microinjection כדי למנוע את העברתו.
    10. לפקח על התנועה של אינולין-FITC ב בזרמה (איור 2G).
    11. מיד לשים בזרמה בחזרה לתוך חלל הבטן לאחר הסיום של הזריקה.
    12. חזור על הפעולות על בזרמה contralateral. Testis זה מוזרק עם μL 20 ל- PBS כפקד.
    13. לסגור את העור עם תפירה, להזיז את העכבר כדי כרית חום של תנור ברים, מערכות אינסטלציה (איור 1B). לנהל מינון של 1 מ ג של שיכוך כאב (הבופרנורפין) לכל 1 ק ג של משקל הגוף באמצעות הזרקה תת עורית.
  3. קציר את האשכים והכנות מקטעים קפוא
    1. 40 דקות לאחר ההזרקה המתת חסד העכבר הנמען מאת נקע בצוואר הרחם על פי טיפול בבעלי חיים ולהשתמש הנחיות.
    2. השתמש זוג מספריים חדות כדי לאסוף את האשכים. למקם את האשכים 1 מ"ל של PBS קר כקרח כדי להסיר כל זיהום בדם.
    3. לתקן האשכים ב 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12-24 ח' להשליך את 4% PFA ושטוף הרקמה 3 x 1.5 מ של 1% PBS בטמפרטורת החדר.
    4. מייבשים את הרקמה ב 30% סוכרוז למשך הלילה. לשים בזרמה במסגרת ההטבעה ולכסות את הרקמה עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב (אוקטובר). לאחר OCT מוקפא, למלא את המסגרת ההטבעה עם OCT כך בזרמה כל יכול להיות מכוסה OCT.
    5. חותכים חתכי רוחב 5-μm-עבה, קפוא של האשכים cryostat ב-20 ° C ולתת להם לדבוק שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: Refreezing רקמות מוטבע בתוך קרח יבש עשוי להגדיל את הנוקשות לחיתוך.
  4. דרישת תמונה
    1. מקם את השקופיות בקופסה humidified. חממו את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    2. לשטוף את הסעיפים 3 x בתמיסת באגירה טריס (TBS) בטמפרטורת החדר.
    3. מילה נהדרת עבור 5 דקות בחושך. . תנגב את כל TBS שיורית בנייר ללא אבק
    4. מכסים את חתכי רוחב עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי). מניחים את coverslip הפוכה על שקופית מיקרוסקופ.
    5. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. סכום כולל של 20 X הגדלה מספיקה בדרך כלל לזיהוי האות פלורסנט במאור פנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הסידור ניסיוני עבור ביצוע וזמינותו שלמות BTB מוצג באיור1. משוך, חידוד נימים microinjection עם נימי פולר, micropipette beveler, בהתאמה (איור 1A וג 1). ברים, מערכות אינסטלציה חימום וציוד microinjection מומחשים איור 1B ו- 1 D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יצירת זרע לוקח מקום האפיתל וכמה, הוא תהליך מאוד מסודר ודינמי נשלטת על ידי בתאי הנבט ותאים סומטיים (למשל, התאים Sertoli)13. המבנה BTB, אשר נבנה על ידי תאי סרטולי, מחלק וכמה האפיתל של הבסיס, תא של הפסגה. הפיתוח של meiotic, הפלואידי בתאי הנבט מתרחשת בתוך התא הפסגה המהווה מכשול אימונו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמך על ידי ה-R המפתח הלאומית & D התוכנית של סין (2016YFA0500902), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31471228, 31771653), קרן המדע ג'יאנגסו עבור חוקרים צעירים מכובד (BK20150047), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140897, 14KJA180005), התוכנית יזמיים וחדשניים של מחוז ג'יאנגסו אל K.Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Capillary puller SUTTER INSTRUMENT (USA)P-97
10x PBSHyclone (USA)SH30258.01dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma (USA)F6057
Adhesion microscope slidesCITOGLAS (China)80312-3161
Cadmium chlorideSigma (USA)655198-5G
Confocal microscopeZeiss (Germany)LSM700
Dust-free paperKimberly-Clark (USA)34120
Inulin-FITCSigma (USA)F3272
Microinjection capillariesZhengtianyi (China)BJ-401.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette bevelerNARISHIGE (JAPAN)EG-400
OCTSAKURA (JAPAN)4583
ParaformaldehydeSigma (USA)P6148
Pentobarbital sodiumMerck (Germany)P11011
Shaver Yashen (China)
Stereo microscopeNikon (JAPAN)SMZ1000
Sucrose Sangon Biotech (China)A610498
Surgical instrumentsStronger (China)scissors, forceps, needle holder
SyringeKDL (China)201631505180.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heaterKELL (Nanjing, China)KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M TrisSangon Biotech (China)A600194
1.37 M NaclSangon Biotech (China)A610476

References

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

142TestistestisFITC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved