JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.

Özet

Sperma testis seminifer tübüllerin içinde olgun sperm hücreleri içine spermatogonia gelişmedir. Bu işlem Sertoli hücre kavşaklar, memeli vücuttaki dar doku engeldir ve iki bölmeleri, bir bazal ve bir adluminal seminifer epitel diğer kan-testis bariyeri (BTB), tarafından desteklenmektedir. BTB germ hücreleri için benzersiz bir microenvironment mayoz oluşturur ı / II ve sperm ile spermiogenesis içine postmeiotic spermatids gelişimi için. Burada, fare testis içinde vivobütünlüğünü BTB izlemek için güvenilir bir tahlil açıklayın. Sağlam bir BTB FITC Birleşik seminifer tübüllerin apikal bölmesinin inulin bazal üzerinden difüzyon engeller. Bu teknik gen adaylar, virüsler veya BTB işlevi veya kolay bir prosedür ve cerrahi becerileri alternatif yöntemlerine göre en az bir şartı ile bütünlüğü etkileyen çevresel toxicants çalışmak için uygundur.

Giriş

Memeli sperma spermatogonial kendini yenileme ve spermatocytes aracılığıyla hangi dramatik sırasında farklılaşma yolu ile spermiogenesis, mitoz ve mayoz haploit sperm hücreleri içine kapsayan son derece yapılandırılmış bir süreç olarak kabul edilir biyokimyasal ve morfolojik değişiklikler oluşur. Gelişmekte olan germ hücreleri aşamalı olarak lümen doğru Seminifer tübül tabanından taşınmaktadır. Bu işlem germ hücreleri ve Sertoli hücreleri1,2arasında hücre-hücre kişiler tarafından düzenlenmiştir. Bitişik Sertoli hücreleri Seminifer tübül Bankası bulunan BTB oluştururlar. BTB fiziksel olarak bir bazal ve bir adluminal bölme epitel ayırır. VIII - IX epitel döngüsünün aşamaları sırasında bazal bölmeleri gelen preleptotene/leptotene spermatocytes adluminal bölmeleri3girme BTB karşıdan karşıya geçirin. Bu nedenle, BTB fonksiyonu mayoz ve spermiogenesis4,5,6tamamlanması için bir immunoprivileged microenvironment sağlamaktır. Sadece sıkı kavşak (TJs) oluşan diğer kan doku engelleri farklı olarak (Örneğin, kan - beyin bariyerini), BTB tarafından dört farklı kavşak (TJs, ektoplazmik Uzmanlıklar, gap kavşaklar ve ara filaman tabanlı oluşturulur desmosomes)1,7arasında Sertoli hücreleri.

Birçok çalışma mekanizmaları BTB bütünlük7,8,9araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş fare, virüs enfeksiyonları ve çevre toxicants kullandık. BTB bozulma Engelli sperma ve subfertility ya da kısırlık neden olmaktadır. BTB oluşumu ve bütünlük kişiler arasında Sertoli hücreleri8etkilenmeye teyit edilmiştir beri izole Sertoli hücre birincil kültür temel bir vitro modeli kullanılan BTB çalışma için. Ancak, bu model doğru BTB dinamiği içinde vivotaklit edemez. Ayrıca, germ hücre Sertoli hücreleri ile eş böyle kültür yok yeteneğine sahip tüm ilgili yapısal ve işlevsel bileşenleri BTB10,11yansıtan olarak kurulmuştur.

Genel olarak, VIVO BTB bütünlük deneyleri genellikle küçük moleküllerin, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin ve FITC Birleşik inulin (inulin-FITC) dayanır. Normalde, biotin veya inulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon BTB yapısı tarafından engellenir. Bu nedenle, biz kontrol grubu ile karşılaştırıldığında BTB hasar ölçüde değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. BTB sonunda adluminal bölme göstergeleri olarak girin küçük moleküller için erişilebilir süre BTB uyaranlara, kadmiyum klorür (CdCl2)12, tedaviyle gibi belirli türleri ile tehlikeye girebilir.

Bir erken vivo içinde BTB bütünlük tahlil biotin veya inulin-FITC ameliyat içerir ve invaziv, karmaşık ve zaman alıcı juguler ven enjekte içerir. Ayrıca, muhabir maddeler kan dolaşımı yoluyla tüm vücuda diffüz olarak biotin veya inulin-FITC seminifer tübüllerin içinde yerel konsantrasyonu sınırlıdır. Ayrıca, sistemik pozlama bağışıklık tepkileri neden olabilir. Burada, inulin-FITC küçük bir aliquot bir testis interstitium içine direkt enjeksiyon etkinleştirme basit ve etkili içinde vivo BTB bütünlük tahlil mevcut. İkincil antikorlar gerekli değildir olarak etiketleme yöntemi floresan, boyama işlemi uygun, kullanmaktır. Burada, floresan boya testis girme sürecinin görüntülenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm gerçekleştirilen hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması. Erkek C57BL/6 fare kontrollü photoperiod koşullar altında tutuldu ve yiyecek ve su ile temin edildi.

1. hazırlıkları

  1. Mikroenjeksiyon kılcal
    1. Mikroenjeksiyon kılcal bir dış çap, iç dimeter ve 1.0 mm, 0.8 mm ve 10,0 cm, uzunluğu ile sırasıyla kullanın.
    2. Cam kılcal kapiller çektirme (Şekil 1A) ile çek. Test ve bağlı olarak kullanılıyor kapiller çektirme makine ayarlarını yapın.
    3. Pipet ipuçları 50 µm çapı uç kılcal almak için kullanılacak forseps ile bölünürler.
      Not: İpuçları testis nüfuz için çok uzun olabilir.
    4. 30 ° açı ipucunda micropipette beveler (Şekil 1 c) kullanarak keskinleştirme.
  2. Reaktifler
    1. %1 Fentobarbital sodyum hazırlamak: Fentobarbital sodyum fosfat tamponlu tuz (PBS) (adım 2.3.3) 10 ml 100 mg geçiyoruz.
    2. 10 mg/mL inulin-FITC hazırlamak: inulin-FITC PBS (adım 2.1.6) 100 μL 1 mg geçiyoruz.
    3. %4 paraformaldehyde hazır olun: paraformaldehyde (PFA) 4 g PBS (adım 2.3.3) 100 ml geçiyoruz.
    4. % 30 sükroz hazırlamak: PBS (adım 2.3.4) 10 ml 3 g sükroz geçiyoruz.
    5. % 0.1 kadmiyum klorür hazırlamak: kadmiyum klorür PBS (adım 2.1.1) 10 ml 10 mg geçiyoruz.

2. yöntemleri

  1. Anestezi ve hastayabenzer hazırlık
    1. 8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve CdCl2gerekli doz hesaplayın. Bir grup farelerin tedavisinde (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg c.a., IP) ameliyattan önce 3 d için. Başka bir grup 8 haftalık C57BL/6 erkek farelerin tedavisinde (n = 3) denetimi olarak PBS ile.
    2. Steril enjektör, iğne, makas ve forseps kullanarak aseptik koşullar altında ameliyat.
    3. Anestezi çalışma çözüm taze hazırlayın. Anestezi gerekli doz Fentobarbital sodyum/kg vücut ağırlığı 70 mg dır. Ortalama olarak, 8 hafta-in yaş, Yetişkin bir C57BL/6 fare 175 μL % 1 Fentobarbital sodyum (1,75 mg-fare de) karşılık gelen ~ 25 g ağırlığında.
      Not: Fentobarbital sodyum steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS) feshedilmiştir. Çözüm tarafından 0.22 um filtre kullanılan önce filtre ünitesi.
    4. % 75 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz doku havlu ile alanı kapsamaktadır.
    5. Termostatik ısıtıcıyı ve 37 ° c sıcaklık ayarlama
    6. İnulin-FITC çalışma çözüm (10 mg/mL) ameliyat günü hazırlamak.
  2. Cerrahi müdahale
    1. 8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve anestezi gerekli doz hesaplayın.
    2. Mayi iğne Fentobarbital sodyum 1 mL steril Ģırınga kullanarak gerçekleştirin. Fare temiz bir kafeste tutmak.
    3. Göz refleks tepki ve nefes desen tam anestezi altında olduğunu doğrulamak için fare gözlemlemek.
      Not: Genellikle, 10-15 dk ihtiyaç vardır fare derinden, ayak çimdik yanıt toplam eksikliği ve bakım yavaş, düzenli nefes alma ile anestezi kadar.
    4. Fare operasyon alanına taşıma ve onun göz çevresi kuruluğu (Şekil 2A) anestezi sırasında önlemek için nemli bir doku kağıt ile kaplayın.
    5. Karın onun saç tıraş makinesi ile tıraş ve cerrahi alan % 75 etanol ile dezenfekte.
    6. Keskin makas ile karın duvarı ortaya çıkarmak için Prepusyal bezleri üzerinde 1 cm cilt kesi yapmak. Karın duvarına küçük forseps ile Asansör ve periton boşluğu (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için bir 0,5 cm kesi yapmak.
    7. Forseps testis ve epididim çevresinde yağ yastıkları aramak için kullanın. Dikkatli bir şekilde yağ yastıkları bağlı testis açıkça ortaya çıkarmak için çıkar (Şekil 2C ve 2D). Genellikle, bir testis teker teker çalışır.
      Not: Yağ yastıkları ve testis elleriyle dokunmaktan kaçının.
    8. Yağ yastıkları ve testis (Şekil 2C) altında bir kağıdı (9 cm çapında) yerleştirin.
    9. İnulin-FITC mikroenjeksiyon pipet enjekte ve micromanipulator birimi (Şekil 1 d) bağlayın. Yavaşça mikroenjeksiyon pipet tunica albuginea altında Ekle ve inulin-FITC 20 μL toplam (Şekil 2E ve 2F) testis interstitium yükleyin.
      Not: Dikkatli hareket önlemek için Mikroenjeksiyon pipet düşürmek.
    10. İnulin-FITC testis (Şekil 2 g) içinde hareketi izlemek.
    11. Hemen testis enjeksiyon tamamlanmasından sonra karın boşluğuna geri koymak.
    12. Kontralateral testis yordamı yineleyin. Bu testis bir denetim olarak PBS 20 μL ile enjekte edilir.
    13. Cerrahi sütür ile cilt kapatın ve termostatik ısıtıcı (Şekil 1B) ısı pad için fareyi hareket ettirin. Subkutan enjeksiyon yoluyla vücut ağırlığının 1 kg başına analjezik (buprenorfin) 1 mg doz yönetmek.
  3. Testisler ve donmuş bölümleri hazırlık hasat
    1. 40 dakika sonra enjeksiyon, hayvan bakımı göre servikal çıkığı tarafından alıcı fare ötenazi ve yönergeleri kullanın.
    2. Keskin makas testis toplamak için kullanın. Testis her türlü kan kirlilik buz gibi PBS 1 mL yerleştirin.
    3. 4 12-24 h. atma için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) testis tamir % PFA ve yıkama doku 3 x 1.5 mL % 1 PBS oda sıcaklığında ile.
    4. % 30 sükroz dokusunda gecede kurutmak. Testis gömme çerçevede koymak ve doku en iyi kesim ısı bileşik (OCT) kapsar. OKT'yi dondurulur sonra tüm sınav-ebilmek var olmak örtülü OCT ile gömme çerçeve OCT ile doldurun.
    5. Bir cryostat-20 ° C'de 5 mikron kalınlığında, dondurulmuş kesitleri testisler, kesilmiş ve onlara mikroskop slaytlar için uygun.
      Not: Kuru buz içinde katıştırılmış doku Refreezing kesme için sertlik artabilir.
  4. Görüntü talep
    1. Slaytları oksijen bir kutuya koyun. Slaytlar, oda sıcaklığında 10 dakika sıcak.
    2. Bölüm 3 yıkama x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) Oda sıcaklığında ile.
    3. Karanlıkta 5 min için kuruması. Herhangi bir kalıntı TBS tozsuz kağıt ile yok etmek.
    4. Kesitleri ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kapsar. Ters coverslip mikroskop slayttaki bir yer.
    5. Confocal mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek. Toplam 20 X büyütme parlak floresan sinyali algılamak için genellikle yeterli olur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

BTB bütünlük tahlil gerçekleştirmek için deneysel set-up Şekil 1' de gösterilen. Çekin ve mikroenjeksiyon kılcal bir kılcal çektirmenin ve micropipette beveler, sırasıyla keskinleştirmek (Şekil 1A ve 1 C). Termostatik ısıtıcı ve mikroenjeksiyon donatımı Şekil 1B ve 1 Dgösterilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sperma seminifer epitel yer alır ve germ hücreleri ve somatik hücreler tarafından yönetilir son derece düzenli ve dinamik bir süreçtir (Örneğin, Sertoli hücreleri)13. Sertoli hücreleri tarafından oluşturulur, BTB yapısı bir bazal ve apikal bir bölme seminifer epitel ayırır. Segregasyonun ve haploit germ hücre gelişimi bir bağışıklık bariyer14oluşturan apikal kompartımanda oluşur.

BTB işlev tarafınd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser ayırt edici genç bilim adamları için (BK20150047), Doğa Bilimleri ulusal anahtar R & D Çin programı (2016YFA0500902), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31471228, 31771653), Jiangsu Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Jiangsu Eyaleti (BK20140897, 14KJA180005) ve Jiangsu Eyaleti K.Z. için yenilikçi ve girişimci Program temeli

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Capillary puller SUTTER INSTRUMENT (USA)P-97
10x PBSHyclone (USA)SH30258.01dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma (USA)F6057
Adhesion microscope slidesCITOGLAS (China)80312-3161
Cadmium chlorideSigma (USA)655198-5G
Confocal microscopeZeiss (Germany)LSM700
Dust-free paperKimberly-Clark (USA)34120
Inulin-FITCSigma (USA)F3272
Microinjection capillariesZhengtianyi (China)BJ-401.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette bevelerNARISHIGE (JAPAN)EG-400
OCTSAKURA (JAPAN)4583
ParaformaldehydeSigma (USA)P6148
Pentobarbital sodiumMerck (Germany)P11011
Shaver Yashen (China)
Stereo microscopeNikon (JAPAN)SMZ1000
Sucrose Sangon Biotech (China)A610498
Surgical instrumentsStronger (China)scissors, forceps, needle holder
SyringeKDL (China)201631505180.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heaterKELL (Nanjing, China)KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M TrisSangon Biotech (China)A600194
1.37 M NaclSangon Biotech (China)A610476

Referanslar

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 142Testiskan testis bariyeriSertoli h creleriinulin FITCfarevivo i inde tahlil

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır