Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a integridade da barreira sangue-testículo injetando inulina-FITC em testículos. Este é um método eficiente na vivo para estudar a integridade de barreira sangue-testículo, que pode ser comprometida por elementos genéticos e ambientais.

Resumo

Espermatogênese é o desenvolvimento das espermatogónias em espermatozoides maduros nos túbulos seminíferos do testículo. Este processo é suportado por junções de células de Sertoli na barreira sangue-testículo (BTB), que é a barreira de tecido mais apertada no corpo dos mamíferos e segrega o epitélio seminífero em dois compartimentos, um basal e um adluminal. O BTB cria um microambiente exclusivo para as células germinativas em meiose eu / II e para o desenvolvimento de postmeiotic espermátides em espermatozoides através de acridina. Aqui, descrevemos um ensaio confiável para monitorar a integridade do BTB do rato testículo na vivo. Uma intacta BTB bloqueia a difusão de inulina FITC-Conjugado da basal para o compartimento apical dos túbulos seminíferos. Esta técnica é apropriada para o estudo de genes candidatos, vírus ou tóxicos ambientais que podem afetar a função do BTB ou integridade, com um procedimento fácil e de um requisito mínimo de habilidades cirúrgicas em comparação com métodos alternativos.

Introdução

Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli^1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo seminífero. O BTB fisicamente divide o epitélio em um basal e um compartimento adluminal. Durante estágios VIII - IX do ciclo do epitélio, preleptotene/leptóteno espermatócitos de compartimentos do basais migram através do BTB, entrando o adluminal compartimentos³. Portanto, a função do BTB é fornecer um microambiente immunoprivileged a conclusão de meiose e acridina^4,5,6. Ao contrário de outras sangue-tecido barreiras (por exemplo, barreira hemato - encefálica) que são compostas apenas de junções apertadas (TJs), o BTB é formado por quatro diferentes junções (TJs, especializações ectoplásmicas, junções e intermediário baseado no filamento desmossomas) entre Sertoli células^1,7.

Muitos estudos utilizaram-se ratos geneticamente modificados, infecções por vírus e tóxicos ambientais para investigar mecanismos de BTB integridade^7,8,9. O rompimento do BTB induz a espermatogênese prejudicada e Subfertilidade ou infertilidade. Desde a formação do BTB e integridade foram confirmados para ser afetado pelos contatos entre as células de Sertoli⁸, um modelo in vitro com base em cultura primária de células de Sertoli isoladas tem sido utilizado para o estudo do BTB. No entanto, este modelo exatamente não pode imitar BTB dinâmica em vivo. Além disso, não há tal co-cultura de células germinativas com células de Sertoli estabeleceu como capaz de refletir todos os componentes estruturais e funcionais relevantes do BTB^10,11.

Em geral, ensaios de integridade em vivo BTB normalmente são baseados em pequenas moléculas, tais como o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e inulina conjugado FITC (inulina-FITC). Normalmente, a difusão da biotina ou inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada pela estrutura do BTB. Portanto, somos capazes de usar esse método para avaliar a extensão do dano BTB em comparação com grupos de controle. Enquanto BTB pode ser comprometida com certos tipos de estímulos, tais como tratamento com cádmio cloreto (CdCl₂)¹², BTB torna-se acessível para pequenas moléculas, os quais acabaram por inserir o compartimento adluminal como indicadores.

Um início na vivo BTB integridade ensaio envolve a injeção de biotina ou inulina-FITC na veia jugular, que envolve a cirurgia e é invasiva, complicado e demorado. Além disso, como as substâncias repórter difundem por todo o corpo através da circulação, a concentração local de biotina ou inulina-FITC nos túbulos seminíferos é limitada. Além disso, a exposição sistémica pode induzir reações imunes. Aqui, apresentamos um simples e eficaz na vivo BTB integridade ensaio permitindo injeção direta de uma pequena alíquota de inulina-FITC para o interstício de um testículo. Usando o método de rotulagem fluorescente, o processo de coloração é conveniente, como anticorpos secundários não são necessários. Aqui, o processo de tintura fluorescente entrando o testículo é visualizado.

Protocolo

Todas as experiências em animais realizadas foram aprovadas pelo Comitê de Nanjing Medical University. Camundongos C57BL/6 machos foram mantidos em condições de fotoperíodo controlados e foram fornecidos com comida e água.

1. preparações

1. Capilares de microinjeção
   1. Use os capilares microinjeção com um diâmetro exterior e interior Dímetro comprimento de 1,0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, respectivamente.
   2. Puxe os capilares de vidro com um puxador capilar (figura 1A). Testar e ajustar as configurações, dependendo da máquina de extrator capilar que está sendo usado.
   3. Quebre as pontas de pipeta com fórceps usar para obter os capilares de um diâmetro de 50 µm na ponta.
      Nota: As dicas podem ser muito longas para penetrar o testículo.
   4. Afie a ponta em um ângulo de 30° usando um chanfrador micropipeta (Figura 1).
2. Reagentes
   1. Prepare-se 1% de pentobarbital de sódio: dissolver pentobarbital de sódio 100 mg em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) (etapa 2.3.3).
   2. Prepare-se 10 mg/mL inulina-FITC: dissolver inulina-FITC 1 mg em 100 µ l de PBS (etapa 2.1.6).
   3. Preparar o paraformaldeído 4%: dissolver paraformaldeído (PFA) 4 g em 100 mL de PBS (etapa 2.3.3).
   4. Prepare-se 30% de sacarose: dissolver 3 g em 10 mL de PBS (etapa 2.3.4) de sacarose.
   5. Prepare-se cloreto de cádmio de 0,1%: dissolver cloreto de cádmio 10 mg em 10 mL de PBS (etapa 2.1.1).

2. métodos

1. Preparação de anestesia e cirurgia
   1. Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de CdCl₂. Tratar um grupo de ratos (n = 3) com CdCl₂ (5 mg/kg de peso corporal, i.p.) para 3 d antes da cirurgia. Tratar de um outro grupo de camundongos machos de C57BL/6 de 8 semanas de idade (n = 3) com PBS como controle.
   2. Realizar a cirurgia sob condições assépticas usando seringa estéril, agulha, tesoura e pinça.
   3. Prepare a solução de trabalho de anestesia na hora. A dose necessária de anestesia é 70 mg de pentobarbital de sódio/kg de peso corporal. Em média, um rato adulto de C57BL/6 às 8 semanas de idade pesa ~ 25g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital de sódio (1,75 mg / rato).
      Nota: O pentobarbital de sódio é dissolvido em salina tampão fosfato (PBS). A solução é filtrada por 0.22 hum unidade de filtro antes de serem utilizados.
   4. Limpar a área para cirurgia com 75% de etanol e cobrir a área com uma toalha de tecido limpo.
   5. Ligar o aquecedor termostático e ajustar a temperatura a 37 ° C.
   6. Prepare a solução de trabalho de inulina-FITC (10 mg/mL) no dia da cirurgia.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de anestesia.
   2. Realize uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio utilizando a seringa de 1 mL estéril. Manter o mouse em uma gaiola limpa.
   3. Observe a resposta reflexa de olho e o padrão de respiração do rato para confirmar que é sob anestesia completa.
      Nota: Geralmente, 10-15 min são necessários até que o mouse é profundamente anestesiado, com manutenção de respiração lenta, constante e uma total falta de resposta de pitada de dedo do pé.
   4. Mova o mouse para a área de operação e cobrir a área dos olhos com um papel absorvente úmido para evitar o ressecamento durante a anestesia (Figura 2A).
   5. Raspar seu cabelo abdominal com uma máquina de barbear e desinfetar a área de cirurgia com 75% de etanol.
   6. Com uma tesoura afiada, faça uma incisão de 1 cm de pele acima as glândulas prepuciais para expor a parede abdominal. Levante a parede abdominal com pequenas pinças e faça uma incisão de 0,5 cm para expor a cavidade peritoneal (Figura 2B).
   7. Utilize pinças para pesquisar por almofadas de gordura ao redor do epidídimo e testículo. Puxe cuidadosamente as almofadas de gordura para expor o testículo anexado claramente (Figura 2 e 2D). Normalmente, operam em um testículo de cada vez.
      Nota: Evite tocar as almofadas de gordura e testículos com as mãos.
   8. Coloque um papel (9 cm de diâmetro), sob as almofadas de gordura e o testículo (Figura 2).
   9. Injetar uma pipeta de microinjeção de inulina-FITC e conectá-lo à unidade micromanipulador (Figura 1). Suavemente Insira a pipeta de microinjeção sob a túnica albugínea e carregar um total de 20 μL de inulina-FITC para o interstício do testículo (Figura 2E e 2F).
      Nota: Pressione cuidadosamente a pipeta de microinjeção para evitar movê-lo.
   10. Monitore a movimentação de inulina-FITC no testículo (Figura 2).
   11. Imediatamente devolva o testículo na cavidade abdominal após a conclusão da injeção.
   12. Repita o procedimento no testículo contralateral. Esse testículo é injetado com 20 μL de PBS como um controle.
   13. Fechar a pele com uma sutura cirúrgica e mover o mouse para uma almofada de calor de um aquecedor termostático (figura 1B). Administre uma dose de 1 mg de analgésico (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal, via subcutânea.
3. Colhendo os testículos e preparação de seções congeladas
   1. 40 min após a injeção, eutanásia o mouse destinatário por deslocamento cervical de acordo com cuidado animal e usar as diretrizes.
   2. Use um par de tesouras afiadas para coletar os testículos. Coloque os testículos em 1 mL de PBS gelado para remover qualquer contaminação de sangue.
   3. Corrigir os testículos em paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C, durante 12-24 h.. descarte o 4% PFA e lave o tecido 3 x com 1,5 mL de PBS 1% à temperatura ambiente.
   4. Desidrate o tecido em 30% de sacarose durante a noite. Ponha o testículo no quadro de incorporação e cobrir o tecido com a temperatura ideal de corte composto (OCT). Depois a OCT é congelada, preencha o quadro de encastre com OCT, para que o testículo inteiro pode ser coberto com OCT.
   5. Corte 5 μm de espessura, congeladas seções transversais dos testículos em um criostato a-20 ° C e deixá-los a aderir às corrediças do microscópio.
      Nota: Recongelar tecidos incorporados em gelo seco pode aumentar a rigidez para o corte.
4. Requisição de imagem
   1. Coloque os slides em uma caixa de umidificado. Aquecer as lâminas à temperatura ambiente por 10 min.
   2. Lave as seções 3 x com salino Tris (TBS) à temperatura ambiente.
   3. Secar ao ar por 5 min no escuro. Limpe qualquer TBS residual com papel livre de poeira.
   4. Cobrir as seções transversais com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lamela em uma corrediça do microscópio invertida de lugar.
   5. Adquira imagens usando um microscópio confocal. Um total de ampliação de 20 X é geralmente suficiente para detectar o sinal fluorescente brilhantemente.

Resultados

A montagem experimental para a realização do ensaio de integridade BTB é mostrada na Figura 1. Puxe e aguçar os capilares microinjeção com um extrator capilar e chanfrador micropipeta, respectivamente (figura 1A e 1C). O aquecedor termostático e equipamentos para o microinjection estão ilustradas na figura 1B e 1D.

Discussão

Espermatogênese ocorre no epitélio seminífero e é um processo altamente ordenado e dinâmico que é regido por células germinativas e células somáticas (por ex., células de Sertoli)¹³. A estrutura do BTB, que é construída pelas células de Sertoli, divide o epitélio seminífero em um basal e um compartimento apical. O desenvolvimento das células germinativas haploides e meióticas ocorre no compartimento apical que forma uma barreira imunológica¹⁴

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476