Copolímeros de bloque sin capacidad de ejecución funcionalización de metionina para la entrega de ADN de plásmido dirigido

Resumen

Este trabajo presenta la preparación de copolímeros de bloque biocompatibles funcionalizados de metionina (mBG) a través del método reversible de transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). También se investigó la capacidad de complejidad del ADN plásmido del mBG obtenido y su eficiencia de transfección. El método RAFT es muy beneficioso para la polimerización de monómeros que contienen grupos funcionales especiales.

Resumen

La polimerización reversible de la transferencia de cadena de fragmentación de adición (RAFT) integra las ventajas de la polimerización radical y la polimerización viva. Este trabajo presenta la preparación de copolímeros de bloque biocompatible funcionalizados de metionina a través de la polimerización RAFT. En primer lugar, N,N-bis(2-hidroxietilo)metacrilamida-b-N-(3-aminopropyl)metacrilamida (BNHEMA-b-APMA, BA) se sintetizó a través de la polimerización RAFT utilizando 4,4'-azobis(4-ácido cianovalórico) (ACVA) como un agente iniciador y ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CTP) como agente de transferencia de cadena. Posteriormente, N,N-bis(2-hidroxietilo)methacrilamida-b-N-(3-guanidinopropyl)metacrilamida (metionina injertada BNHEMA-b-GPMA, mBG) se preparó modificando grupos de aminas en APMA con metionina y guanidina Grupos. Se sintetizaron tres tipos de polímeros de bloque, mBG1, mBG2 y mBG3, para la comparación. Se utilizó una reacción de ninhydrin para cuantificar el contenido de APMA; mBG1, mBG2 y mBG3 tenían 21%, 37% y 52% de APMA, respectivamente. Los resultados de la cromatografía por permeación en gel (GPC) mostraron que los copolímeros BA poseen pesos moleculares de 16.200 (BA1), 20.900 (BA2) y 27.200(BA3) g/mol. También se investigó la capacidad de complejo del ADN plásmido (ADNp) de los portadores del gen del copolímero de bloque obtenido. Las relaciones de carga (N/P) eran 8, 16 y 4 cuando pDNA se complejoba completamente con mBG1, mBG2, mBG3, respectivamente. Cuando la relación N/P de los polipleplexs mBG/pDNA fue superior a 1, el potencial Zeta de mBG fue positivo. En una relación N/P entre 16 y 32, el tamaño medio de partícula de los poliplexos mBG/pDNA estaba entre 100-200 nm. En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la síntesis portadora de copolímero de bloque.

Introducción

En los últimos años, la terapia génica ha surgido para la entrega terapéutica de ácidos nucleicos como fármacos para tratar todo tipo de enfermedades¹. El desarrollo de fármacos genéticos, como el ADN plásmido (PDNA) y el pequeño ARN interferente (SIRNA), se basa en la estabilidad y eficiencia del sistema de administración de fármacos (DDS)². Entre todos los DDS, los portadores de polímeros catiónicos tienen las ventajas de una buena estabilidad, baja inmunogenicidad, y fácil preparación y modificación, que dan a los portadores de polímeros catiónicos amplias perspectivas de aplicación^3,4. Para aplicaciones prácticas en biomedicina, los investigadores deben encontrar un portador de polímero catiónico con alta eficiencia, baja toxicidad y buena capacidad de focalización⁵. Entre todos los portadores de polímeros, los copolímeros de bloque sin hogar son uno de los sistemas de administración de medicamentos más utilizados. Los copolímeros de bloque se estudian intensamente por sus propiedades de autoensamblaje y sus capacidadespara formar micelas, microesferas y nanopartículas en la administración de fármacos 5. Los copolímeros de bloque se pueden sintetizar a través de métodos de polimerización viva o de química de clics.

En 1956, Szwarc y otros plantearon el tema de la polimerización viva, definiéndolo como una reacción sin reacciones de ruptura en cadena^6,7. Desde entonces, se habían desarrollado múltiples técnicas para sintetizar polímeros utilizando este método; por lo tanto, la polimerización viva es vista como un hito de la ciencia de polímeros⁸. La polimerización viva se puede clasificar en polimerización aniónica viva, polimerización catiónica viva y polimerización radical de desactivación reversible (RDRP)⁹. Las polimerizaciones aniónicas/catiónicas vivas tienen un alcance limitado de aplicación debido a sus estrictas condiciones de reacción¹⁰. La polimerización radical controlada/viva (CRP) tiene condiciones de reacción leves, disposición conveniente y buen rendimiento y, por lo tanto, ha sido un foco de investigación importante en los últimos años^11. En la PCC, las cadenas de propagación activas se pasivan reversiblemente en las inactivas para reducir la concentración de radicales libres y evitar la reacción bimolecular de propagar los radicales de la cadena. La polimerización adicional sólo puede continuar si las cadenas de propagación latentes inactivas se animan reversiblemente en radicales de cadena. Como una de las formas más prometedoras de polimerización radical viva, la polimerización reversible de la transferencia de cadena de fragmentación de adición (RAFT) es un método aplicable para producir polímeros de bloque sin peso y estructura molecular controlados, peso molecular estrecho distribución y transporte de grupos funcionales¹². La clave para el éxito de la polimerización RAFT es el efecto de los agentes de transferencia de cadena, generalmente ditioestras, que poseen una constante de transferencia de cadena muy alta.

En este artículo, se diseñó un método de polimerización RAFT para preparar el polímero de bloque BNHEMA-b-APMA, tomando 4,4'-azobis(4-ácido cianoovalico) (ACVA) como agente iniciador y 4-cianopentanoico ácido dithiobenzoato (CTP) como agente de transferencia de cadena. La polimerización RAFT se utilizó dos veces para introducir BNHEMA en los portadores de polímeros catiónicos. Posteriormente, los grupos de aminas en la cadena APMA fueron modificados con metionina y el reactivo de guanidinilación 1-amidinopyrazol clorhidrato. Haciendo uso de las cargas positivas del reactivo de guanidinilación y la estructura del esqueleto del polímero de metacrilamida, se mejoró la eficiencia de admisión celular de los portadores de polímeros de bloque obtenidos.

Protocolo

1. Síntesis del polímero BNHEMA (PBNHEMA)

1. Disolver 1,87 g de N, N-bis(2-hidroxietilo)metacrilamida (BNHEMA) en 1 ml de agua destilada en una botella de polimerización.
   NOTA: La botella de polimerización es un matraz de fondo redondo con un tapón de goma y un agitador magnético.
2. Disolver 0,03 g de ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CTP) y 0,02 g de 4,4'-azobis (4-cianoovalericácido) (ACVA) en 0,5 ml de 1,4 dioxanos en un vaso de precipitados de 5 ml. A continuación, agregue la solución CTP y ACVA a la botella de polimerización del paso 1.1.
3. Ventile el sistema de reacción en la botella de polimerización con nitrógeno a través de tres ciclos de congelación-bomba-descongelación.
   1. En detalle, congelar la solución en el frasco de polimerización utilizando una trampa de condensado, fijar la botella de polimerización al soporte de hierro, y aspirar e inyectar nitrógeno en la mezcla de reacción a través de un conducto inclinado con una aguja (#9 aguja, diámetro interior 0,65 mm, diámetro exterior 0,9 mm). Selle la botella de polimerización y descontece la solución a temperatura ambiente durante 30 min.
   2. Repita los ciclos de congelación-bomba-descongelación tres veces.
4. Poner la botella de polimerización en un baño de aceite de 70oC y dejar que la solución reaccione durante 24 horas bajo la atmósfera de nitrógeno.
5. Enfríe la botella de polimerización a 0 oC y abra el tapón de goma para terminar el proceso de polimerización.
6. Preenfríe la acetona en un refrigerador de -20 oC durante 2 h y luego mezcle con la solución de reacción del paso 1.5 a 50:1 (v/v). Después de eso, centrífuga a 8.200 x g durante 10 minutos para eliminar la acetona y recoger el precipitado.
7. Para purificar el PBNHEMA sintetizado, disolver el precipitado recogido en 2 ml de agua pura y luego mezclarlo con 100 ml de acetona preenfriada, en la proporción de 1:50 (v/v). Centrifugar la solución a 8.200 x g durante 10 min y recoger el precipitado. Repita este proceso tres veces.
8. Seque el PBNHEMA producido con un secador de vacío de 50 oC. Una vez secado, pesar el polvo con una balanza. Calcule la tasa de rendimiento de acuerdo con la Ecuación 1.
   (1)
   NOTA: En este experimento, el rendimiento obtenido fue del 77,2%.

2. Síntesis del polímero BNHEMA-b-APMA (BA)

1. Disolver 0,96 g de N-(3-aminopropyl)clorhidrato de metacrilamida (APMA) y 0,93 g PBNHEMA en 5 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 10 ml.
2. Disolver 0,01 g de 4,4'-azobis (4-ácido cianoovalrico) (ACVA) en 0,5 ml de 1,4-dioxano y mezclar con la solución APMA-PBNHEMA de la parte 2.1.
3. Transfiera la mezcla a una botella de polimerización y ventile con nitrógeno seco durante 1 h.
4. Poner la botella de polimerización en un baño de aceite de 70oC y dejar que reaccione durante 24 h bajo la atmósfera de nitrógeno.
5. Enfríe la botella de polimerización a 0 oC y abra el tapón de goma para terminar el proceso de polimerización.
6. Transfiera la solución a la acetona refrigerada desde el paso 1.6, y luego centrifugar la solución a 8.200 x g durante 10 minutos para precipitar el BA.
7. Disolver el BA en 2 ml de agua destilada y precipitar el polímero en acetona refrigerada. Repita tres veces.
8. Seque el BA producido en un secador al vacío de 50oC y pese el polvo obtenido. Calcular la tasa de rendimiento de acuerdo con la ecuación 2.
   
   NOTA: En este experimento, la tasa de rendimiento se calculó en 82,0%.

3. Determinar el porcentaje de lunar de APMA en copolímero BA a través del método ninhydrin

NOTA: La espectrofotometría se utiliza para determinar el contenido de aminoácidos multicomponente. El principio es una reacción de color de ninhydrin y aminoácidos donde la absorbancia está correlacionada con el contenido de aminoácidos hasta cierto punto^13,14.

1. Disolver 5 g de ninhydrin en 125 ml de agua destilada hirviendo. Además, disolver 5 g de vitamina C en 250 ml de agua destilada tibia. Añadir los 250 ml de solución de vitamina C en gota a la solución de ninhydrin bajo agitación magnética. Continúe revolviendo durante 15 minutos y luego enfríe la solución de reacción en un refrigerador de 4 oC.
2. Saque la solución de la nevera y filtre mediante succión utilizando un embudo Buchner para obtener ninhydrin reducido. Recoger el precipitado y preservarlo en un deshidratador de pentóxido de fósforo.
3. Disolver 85 mg de ninhydrin y 15 mg de ninhydrin reducido en 10 ml de éter monometil etilenglicol para preparar la solución colorante de ninhydrin.
   NOTA: La solución colorante de Ninhydrin puede reaccionar con el aminoácido en el APMA y formar un compuesto violeta con una estructura como se describe en un estudio anterior¹⁵.
4. Diluir 1 ml de soluciones de monómero APMA de 0, 1, 10, 100, 1.000 mg/ml con 1 ml de tampón de acetato (2 M, pH 5.4) y, a continuación, añadir 1 ml de solución colorante de ninhidrina, respectivamente.
5. Calienta las mezclas durante 15 minutos en un baño de agua hirviendo y luego enfríalas con agua corriente. Deje que las soluciones se sientan durante 5-10 min y diluya con 3 ml de alcohol etílico al 60% y mezcle bien. Mida la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrofotómetro y dibuje la curva estándar (Ecuación 3).
   
   NOTA: La ecuación 3 se deriva del ajuste lineal de la absorbancia a 570 nm frente a la concentración de APMA.
6. Disolver 0,01 g de BA en 1 ml de agua destilada; añadir 1 ml de tampón de acetato (2 M, pH 5.4) y 1 ml de solución para colorear ninhydrin. Calcular el contenido molar de APMA según la absorbancia a 570 nm.
   
   (5)
   
   NOTA: Las fórmulas de cálculo son las siguientes (Ecuaciones 3-6).

4. Síntesis del polímero BA injertado de metionina (mBA)

1. Disolver 8,9 mg de Fomc-Metionina en 5 ml de DMSO en un matraz de recuperación.
2. Añadir 6,92 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) clorhidrato de carbodiimida (EDCl) y 4,86 mg de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) al matraz de recuperación y reaccionar a 0 oC durante 0,5 h.
3. Disolver 2,59 g de BA en 5 ml de solución de DMSO y luego añadir 50 ml de trimetilamina; añadir esta solución gota al matraz de recuperación (paso 4.2) y dejar que la solución reaccione durante 0,5 h a temperatura ambiente.
4. Dialyze para eliminar DMSO y trimetilamina de la solución ba en el paso 4.3 utilizando una bolsa de diálisis (MWCO 10 kDa) en un vaso de precipitados de 2 L durante 24 h; reemplazar el agua desionizada cada 6 h.
5. Secar con gel de mBA obtenido y pesar para calcular la tasa de rendimiento de acuerdo con la Ecuación7.
   
   NOTA: En este caso, se determinó que la tasa de rendimiento era del 71%.
6. Cuantificar el NH₂ que contiene mBA midiendo la absorbancia a 570 nm para calcular la cantidad de metionina injertada. Calcular el contenido molar de metionina de acuerdo con la ecuación 8.
   

5. Síntesis de polímero conjugado de guanidinated y metionina BNHEMA-b-APMA (mBG)

NOTA: Se sintetizaron tres copolímeros mBA1, mBA2 y mBA3 diferentes. El copolímero mBA3 se utiliza como ejemplo en los pasos siguientes.

1. Disolver mBA3 que contiene 60 émol de grupo amino en 5 ml de agua pura.
   NOTA: El contenido del grupo amino se cuantificó utilizando el método ninhydrin como se describe en el paso 3.5.
2. Disolver 40,6 mg (300 omol) de reactivo de guanidinilación 1-amidinopirazol clorhidrato en soluciones mBA.
3. Ajuste el pH a 9,0 con la solución saturada de carbonato sódico y déjelo estabilizar durante 24 horas a temperatura ambiente.
4. Dializar el producto mBG con agua desionizada utilizando una bolsa de diálisis en un vaso de precipitados (MWCO 10 kDa, 2 L) y conservarlo en forma de polvo liofilizado.
   El porcentaje de rendimiento se calculó en 85% a través de la Ecuación 8.
   (8)
5. Disolver el polvo mBG en D₂O en los tubos de RMN y caracterizarlo utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear de ¹H (¹H RmN)¹⁶.

6. Preparación y caracterización de polipleplexs mBG/pDNA

1. Disolver 50 g de PDNA en 50 ml de agua libre de RNase/DNase.
2. Disolver 1 mg de copolímeros mBG en 1 ml de agua libre de RNase/DNase.
3. Agregue la solución de copolímeros mBG directamente en la solución de pDNA de acuerdo con diferentes proporciones de alimentación, es decir, diferentes relaciones N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 y 32:1).
   NOTA: La relación N/P se define como la relación molar del grupo de guanidina en el polímero y el grupo fosfato en pDNA, a saber, la relación molar de la cadena GPMA en el polímero y el mononucleótido en pDNA. La relación N/P se calcula de acuerdo con los pesos moleculares del nitrógeno amino (N) en mBG y el grupo de fosfato (P) en pDNA.
4. Mezcle las soluciones con un mezclador de vórtice y permítalas reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, disperse la mezcla en la solución tampón de fosfato (PBS, pH 7.4) y conserve los poliplexos mBG/pDNA obtenidos a 4 oC para los experimentos de seguimiento.
   NOTA: El tamaño medio de las partículas y el potencial Zeta de mBG y los complejos se detectaron mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS)¹⁷.
5. Diluir 10 l de las soluciones poliplex mBG/pDNA con 1 ml de PBS (pH 7.4) en las células de muestra potenciales de DLS y Zeta.
   NOTA: El tamaño de las partículas y la detección del potencial de Zeta se realizaron tres veces y se tomó un promedio de los tres valores.

7. Experimento de retardo electroforético de polipleplexs mBG/pDNA

NOTA: Se llevó a cabo un experimento de retardo electroforético para determinar la relación de carga mínima.

1. Tome cinco grupos de los polipleplexs mBG/pDNA con diferentes relaciones N/P (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 y 32:1) que contienen 50 g de pDNA .
2. Añadir búfer de carga de 6x a las muestras de poliplex mBG/pDNA a una concentración final de 1x.
3. Añadir las soluciones a los geles de agarosa del 1,5% y ejecutar el gel a 90 mV durante 15 min, utilizando pDNA como control.
4. Tome fotos de los geles usando un imager de gel.

8. Citotoxicidad de los poliplexos mBG/pDNA

1. Seed MCF-7 células en las placas de 96 pocillos a una densidad de 10⁴ células por pozo. A continuación, el cultivo de las células durante 12 h utilizando medio DMEM (10% FBS y1% antibiótico) en una incubadora humidificada de 37 oC suministrada con 5% de CO2.
2. Sustituya el medio de cultivo por medios de cultivo DMEM libres de antibióticos que contengan un 10% de suero bovino fetal (FBS) y polipleplexs mBG/pDNA de diferentes relaciones de carga (N/P 4, 8, 16 y 32, n-6) durante 6 h, tomando las células añadidas con volúmenes iguales de solución de PBS como control. A continuación, sustituya el medio de cultivo por 150 ml de medio fresco 1640 y vuelva a cultivar las células durante 24 h.
3. Añadir 5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenittrazolium bromuro (MTT) solución (20 l /pozo) a las placas de 96 pocillos y seguir cultivando las células durante 4 h.
4. Retire la solución y agregue 150 s de DMSO a cada poca y agite las placas de 96 pocillos 30 s.
5. Mida la densidad óptica (OD) a 490 nm con un lector de microplacas para mostrar la viabilidad celular. Calcule el porcentaje de viabilidad de la celda de acuerdo con la Ecuación 9.
   Viabilidad celular % s (9)

9. Eficiencia de transfección de los poliplexos mBG/GFP-pDNA

1. Disolver 50 g de PDNA que contiene el gen reportero proteína fluorescente verde (GFP) pDNA (GFP-pDNA) en 50 l de agua libre de RNase/DNase. A continuación, disolver 1 mg de copolímeros mBG en 1 ml de agua libre de RNase/DNase. Mezclar la solución pDNA y mBG a una relación de carga (N/P) de 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 y 32:1 e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Disperse la solución de poliplexes mBG/GFP-pDNA utilizando ondas ultrasónicas (30 s) y guárdela a 4 oC para los experimentos de seguimiento.
   NOTA: La relación N/P se calcula de acuerdo con los pesos moleculares del nitrógeno amino (N) en mBG y el grupo de fosfato (P) en pDNA .
2. Células de semilla MCF-7 a una densidad de 2 x 10⁵ células por pocido en una placa de 6 pocillos y cultivarlas a 37 oC y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada durante 12 h.
3. Sustituya el medio de cultivo por el medio de cultivo fresco que contiene poliplejeses mBG/GFP-pDNA de diferentes relaciones N/P (4, 8, 16 y 32) durante 6 h.
4. Sustituya el medio por 2 ml de medio fresco RPMI1640 y cultivo por 48 h.
5. Recoger las células y detectar la fluorescencia verde con un citómetro de flujo.

Resultados

El BNHEMA se alimentó de acuerdo con el grado objetivo de polimerización que se muestra en el Cuadro1; el procedimiento de síntesis de mBG se muestra en la Figura1. En primer lugar, el homopolímero BNHEMA se preparó a través del método reversible de transferencia de cadena de fragmentación de adición (RAFT) en el sistema de dioxano de agua, utilizando el ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico como agente de transferencia de cadena. En segundo lugar, PBNHEMA se ut...

Discusión

Este estudio introdujo una serie de portadores de genes catiónicos de polímero de bloque BNHEMA-b-APMA. Estos polímeros de bloque se sintetizaron a través del método reversible de transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). El segmento hidrófilo BNHEMA se introdujo para mejorar la solubilidad. Se modificaron los grupos de metionina y guanidina paramejorar la capacidad objetivo y la eficiencia de transfección 5. El contenido de la cadena APMA aumentó y la guanidinilación en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxybenzotriazole	Macklin Biochemical Co., Ltd,China	H810970	≥97.0%
1,4-dioxane	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10008918	AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	A107935	98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	E106172	AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid)	Aladdin Co., Ltd., China	A106307	Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid	Aladdin Co., Ltd., China	C132316	>97%(HPLC)
Acetate	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	81014818	AR
Acetone	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10000418	AR
Agarose	Aladdin Co., Ltd., China	A118881	High resolution
Ascorbic acid	Aladdin Co., Ltd., China	A103533	AR
DMSO	Aladdin Co., Ltd., China	D103272	AR
Ethylene glycol	Aladdin Co., Ltd., China	E103319	AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	N129096	≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide	ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China	CF259748	≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin	Aladdin Co., Ltd., China	N105629	AR
PBS buffer	Aladdin Co., Ltd., China	P196986	pH 7.4
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	pDNA-EGFP	pDNA-EGFP
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	Pdna	pDNA
Sodium carbonate decahydrate	Aladdin Co., Ltd., China	S112589	AR
Trimethylamine	Aladdin Co., Ltd., China	T103285	AR