표적 플라스미드 DNA 전달을 위한 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체

요약

이 작품은 가역적 첨가 단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 메티오닌 기능화된 생체 적합성 블록 공중합체(mBG)의 제조를 제시한다. 얻어진 mBG및 이들의 형질감염 효율의 플라스미드 DNA 복합성도 조사되었다. RAFT 방법은 특수 작용기 포함 단량체를 중합하는 데 매우 유용합니다.

초록

가역적 첨가-단편화 사슬 전달(RAFT) 중합은 라디칼 중합 및 살아있는 중합의 장점을 통합합니다. 이 작품은 RAFT 중합을 통해 메티오닌 기능화 생체 적합성 블록 공중합체의 준비를 제시한다. 첫째,N,N-비스(2-하이드록세틸)메타크릴라미드-b-N-(3-아미노프로필) 메타크릴라미드(BNHEMA-b-APMA, BA)를 사용하여 래프트 중합을 통해 합성하였다 4,4'-아조비스(4-시안발산)(ACVA)로 체인 전달제로서 개시제 및 4-시안펜타노산 디티오벤조에이트(CTP)를 개시한다. 이어서,N,N-비스(2-hydroxyethyl)메타크릴라미드-b-N-(3-guanidinopropyl) 메타크릴라미드(메티오닌 접목BNHEMA-b-GPMA, mBG)는 메티오닌 및 과니딘과 함께 APMA에서 아민 군을 변형시킴으로써 제조하였다. 그룹. 3종의 블록 폴리머, mBG1, mBG2 및 mBG3의 3가지 블록을 비교하기 위해 합성되었다. Ninhydrin 반응은 APMA 함량을 정량화하기 위하여 이용되었습니다; mBG1, mBG2 및 mBG3는 각각 21%, 37%, 52%의 APMA를 가졌다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 결과는 BA 공중합체가 16,200(BA1), 20,900(BA2) 및 27,200(BA3) g/mol의 분자량을 가지고 있음을 보여주었다. 수득된 블록 공중합체 유전자 운반체의 플라스미드 DNA(pDNA) 복합성 도 조사되었다. 전하비(N/P)는 pDNA가 mBG1, mBG2, mBG3으로 완전히 복합화되었을 때 8, 16 및 4였습니다. mBG/pDNA 폴리플렉스의 N/P 비율이 1보다 높았을 때, mBG의 제타 전위는 양수였다. 16과 32 사이의 N/P 비율에서 mBG/pDNA 폴리펙스의 평균 입자 크기는 100-200 nm 사이였습니다. 전반적으로, 이 작업은 블록 공중합체 반송파 합성을 위한 간단하고 편리한 프로토콜을 나타낸다.

서문

최근에는 모든 종류의 질병을 치료하는 약물로서 핵산의 치료적 전달을 위한 유전자 요법이 등장하고^있다1. 플라스미드 DNA(pDNA) 및 소형 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 유전자 약물의 개발은 약물 전달 시스템(DDS)^2의안정성 및 효율성에 의존한다. 모든 DDS 중에서, 양이온 성 중합체 담체는 양호한 안정성, 낮은 면역원성 및 허수제 및 변형의 장점을 가지고 있으며, 이는 양이온 성 중합체 담체광범위한 응용 적 전망^3,4를준다. 생물 의학에서 실용적인 응용을 위해, 연구원은 높은 효율, 낮은 독성 및 좋은 표적화 능력^5를가진 양이온 폴리머 캐리어를 찾아야 합니다. 모든 폴리머 캐리어 중에서 블록 공중합체는 가장 널리 사용되는 약물 전달 시스템 중 하나입니다. 블록 공중합체는 약물 전달에서 미셀, 마이크로스피어 및 나노입자를 형성하는 자기 조립특성 및 능력에 대해 집중적으로 연구된다 5. 블록 공중합체는 살아있는 중합 또는 클릭 화학 방법을 통해 합성될 수 있습니다.

1956 년, Szwarc 등은 살아있는 중합의 주제를 제기, 연쇄 파괴 반응없이 반응으로 정의^6,7. 그 이후로, 이 방법을 사용하여 중합체를 합성하기 위해 여러 기술이 개발되었다; 따라서, 살아있는 중합은 폴리머 과학8의 이정표로 간주됩니다. 살아있는 중합체는 살아있는 음이온 중합, 살아있는 양이온 중합, 및 가역적 불활성화 라디칼 중합(RDRP) 9로 분류될 수^있다. 살아있는 이온/양이온 중합은 그들의 엄격한 반응 조건^10으로인해 제한된 적용 범위를 가지는다. 제어/살아있는 라디칼 중합(CRP)은 온화한 반응 조건, 편리한 처리량 및 양호한 수율을 가지며, 따라서 최근 몇 년 동안 주요 연구 초점이 되었다^11. CRP에서, 활성 전파 사슬은 자유 라디칼의 농도를 감소시키고 전파 사슬 라디칼의 이중 분자 반응을 피하기 위해 휴면 으로 가역적으로 전달됩니다. 추가 된 중합은 비활성 휴면 전파 사슬이 가역적으로 사슬 라디칼로 애니메이션되는 경우에만 계속할 수 있습니다. 살아있는 라디칼 중합의 가장 유망한 형태 중 하나로서, 가역적 첨가 단편화 사슬 전달 (RAFT) 중합은 조절 된 분자량과 구조, 좁은 분자량을 가진 블록 폴리머를 항복시키는 방법에 적용 가능한 방법입니다. [1] 및 운반기능군^12. 성공적인 RAFT 중합의 핵심은 매우 높은 사슬 전달 상수를 보유한 체인 전달제( 일반적으로 디티오에스테르)의 효과입니다.

이 논문에서, 뗏목 중합 방법은 BNHEMA-b-APMA 블록 폴리머를 제조하도록 설계되었으며, 4,4'-아조비스(4-시안산)(ACVA)를 개시제및 4-시안펜타노산 디티오벤조에이트(CTP)를 사슬 전달제로 복용하였다. RAFT 중합은 BNHEMA를 양이온 성 중합체 담체 내로 도입하기 위해 두 번 사용되었습니다. 이어서, APMA 사슬내의 아민 기는 메티오닌 및 구니디닐화 시약 1-아미디노피라졸 염산염으로 변형되었다. 구니디닐화 시약 및 메타크릴아미드 폴리머 골격 구조의 양전하를 이용하여, 얻어진 블록 폴리머 담체의 세포 섭취 효율이 향상되었다.

프로토콜

1. BNHEMA 폴리머의 합성 (PBNHEMA)

1. 1.87 g의 N,N-비스(2-하이드록세틸)메타크릴아미드(BNHEMA)를 중합 병에 증류수 1 mL에 용해시켰다.
   참고 : 중합 병은 고무 스토퍼와 자기 교반기와 둥근 바닥 플라스크입니다.
2. 0.03 g의 4-시안펜타노산 디티오벤조이트(CTP)와 0.02 g의 4,4'-아조비스(4-시안발라제드)(ACVA)를 5 mL 비커에 0.5 mL의 다이옥산에 녹입니다. 이어서, CTP 및 ACVA 용액을 1.1단계에서 중합 병에 첨가한다.
3. 3개의 동결 펌프 해동 주기를 통해 질소로 중합 병의 반응 시스템을 환기시다.
   1. 구체적으로, 응축수 트랩을 사용하여 중합 병에서 용액을 동결하고, 중합 병을 철 지지체에 고정하고, 바늘(#9 바늘, 내경 0.65 mm)으로 기울어진 도관을 통해 반응 혼합물에 질소를 진공 및 주입하고, 외경 0.9 mm). 중합 병을 밀봉하고 30 분 동안 실온에서 용액을 해동합니다.
   2. 동결 펌프 해동 주기를 세 번 반복합니다.
4. 중합 병을 70°C 오일 욕조에 넣고 질소 대기 하에서 24시간 동안 반응합니다.
5. 중합 병을 0°C에서 냉각시키고 고무 스토퍼를 열어 중합 공정을 종료합니다.
6. -20°C 냉장고에서 2시간 동안 아세톤을 프리쿨한 다음 50:1(v/v)에서 1.5단계의 반응 용액과 혼합합니다. 그 후, 8,200 x g에서 10 분 동안 원심 분리를 제거하고 침전지를 수집합니다.
7. 합성 된 PBNHEMA를 정화하기 위해 수집 된 침전물을 순수한 물 2 mL에 녹인 다음 1 :50 (v / v)의 비율로 100 mL의 미리 냉각 된 아세톤과 혼합하십시오. 용액을 8,200 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 침전지를 수집합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다.
8. 50°C 진공 건조기를 사용하여 제조된 PBNHEMA를 건조시다. 일단 건조, 균형분말무게. 방정식 1에 따라 수율 속도를 계산합니다.
   (1)
   참고: 본 실험에서 얻은 수율은 77.2%였습니다.

2. BNHEMA-b-APMA 폴리머 (BA)의 합성

1. N-(3-아미노프로필) 메타크릴라미드 염산염(APMA) 및 0.93 g의 PBNHEMA를 증류수 5 mL에 10 mL 비커에 용해시.
2. 0.01 g의 4,4'-아조비스(4-시안아노발산)(ACVA)를 1,4-다이옥산의 0.5 mL에 용해시키고 2.1부에서 APMA-PBNHEMA 용액과 혼합합니다.
3. 혼합물을 중합 병으로 옮기고 1 시간 동안 건조한 질소로 환기하십시오.
4. 중합 병을 70 °C 오일 욕조에 넣고 질소 대기하에서 24 시간 동안 반응시키십시오.
5. 중합 병을 0°C에서 냉각시키고 고무 스토퍼를 열어 중합 공정을 종료합니다.
6. 1.6단계에서 냉각된 아세톤으로 용액을 옮긴 다음, 10분 동안 8,200 x g의 용액을 원심분리하여 BA를 침전시한다.
7. 증류수 2 mL에 BA를 용해시키고 중합체를 차가운 아세톤으로 침전시합니다. 세 번 반복합니다.
8. 제조된 BA를 50°C 진공 건조기에서 건조시키고 얻어진 분말을 계량한다. 방정식2에 따라 수율을 계산합니다.
   
   참고: 이 실험에서 수율 비율은 82.0%로 계산되었습니다.

3. 닌히드린 방법을 통해 BA 공중합체에서 APMA의 두더지 백분율을 결정합니다.

참고 : 분광광도법은 다성분 아미노산의 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 원리는 흡광도가 어느 정도 아미노산 함량과 상관되는 닌히드린과 아미노산의 색 반응이다^13,14.

1. 끓는 증류수 125 mL에 닌히드린 5 g을 녹입니다. 또한 따뜻한 증류수 250 mL에 비타민 C 5 g을 녹입니다. 250 mL의 비타민 C 용액을 마그네틱 교반 하에 닌히드린 용액에 떨어뜨립니다. 15분 동안 계속 저은 다음 반응 용액을 4°C 냉장고에서 식힙니다.
2. Buchner 깔때기를 사용하여 흡입하여 냉장고에서 용액을 꺼내서 린하이드린을 줄입니다. 침전물을 수집하고 인 펜트 옥사이드 탈수기에서 보존하십시오.
3. 에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 10 mL에 85 mg의 닌히드린과 15 mg의 감소 된 닌히드린을 용해하여 닌히드린 착색 액을 준비하십시오.
   참고: 닌히드린 착색액은 APMA에서 α-아미노와 반응하고 이전 연구^15에기재된 바와 같이 구조를 가진 보라색 화합물을 형성할 수 있다.
4. 1 mL의 0, 1, 10, 100, 1,000 mg/mL APMA 단량체 용액을 아세테이트 버퍼 1mL(2M, pH 5.4)로 희석한 다음, 각각 1mL의 닌하이드린 착색액을 첨가합니다.
5. 끓는 물 욕조에서 15 분 동안 혼합물을 가열 한 다음 흐르는 물을 사용하여 식힙니다. 용액을 5-10 분 동안 앉아서 60 % 에틸 알코올 3 mL로 희석하고 철저히 혼합하십시오. 분광광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를측정하고 표준 곡선을 그립니다(수학식 3).
   
   참고: 수학식 3은 APMA 농도대 570 nm에서의 흡광도의 선형 피팅으로부터 유래되었다.
6. 증류수 1 mL에 BA 0.01 g을 용해; 아세테이트 버퍼 1 mL (2 M, pH 5.4)와 닌히드린 착색 용액 1 mL을 추가하십시오. 570 nm에서 흡광도에 따라 APMA의 어금니 함량을 계산합니다.
   
   (5)
   
   참고: 계산 수식은 다음과 같습니다(수학식3-6).

4. 메티오닌 접목 BA 폴리머 (mBA)의 합성

1. 8.9 mg의 Fomc-Methionine을 DMSO 5 mL에 회수 플라스크에 녹입니다.
2. 6.92 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(EDCl) 및 4.86 mg의 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)을 회수 플라스크에 넣고 0.5시간 동안 0°C에서 반응한다.
3. 2.59 g의 BA를 DMSO 용액 5 mL에 용해한 다음 50 μL의 트리메틸아민을 첨가합니다. 이 용액을 회수 플라스크(4.2단계)에 드롭와이즈로 추가하고 실온에서 0.5시간 동안 반응하도록 하십시오.
4. 투석은 24시간 동안 2L 비이커에 투석 백(MWCO 10 kDa)을 사용하여 4.3단계에서 BA 용액으로부터 DMSO 및 트리메틸아민을 제거하는 단계; 6시간마다 탈이온수를 교체하십시오.
5. 얻어진 mBA를 동결 건조하고 수학식7에 따라 수율을 계산하기 위해 무게를 재는다.
   
   참고: 이 경우 수율은 71%로 결정되었습니다.
6. 570 nm에서 흡광도를 측정하여 mBA를 함유하는 NH2를 정량화하여 접목된 메티오닌의 양을 계산한다. 수학식8에 따라 메티오닌의 어금니 함량을 계산합니다.
   

5. 구니디네이드 및 메티오닌 응고 BNHEMA- b-APMA 폴리머(mBG)의 합성

참고: 3개의 다른 mBA1, mBA2 및 mBA3 공중합체가 합성되었다. mBA3 공중합체는 다음 단계에서 예로 사용된다.

1. 순수한 물 5 mL에 아미노 그룹의 60 μmol을 함유 한 mBA3를 용해하십시오.
   참고: 아미노기 함량은 3.5단계에서 기재된 바와 같이 닌히드린 방법을 사용하여 정량화하였다.
2. 40.6 mg (300 μmol)의 구니디닐화 시약 1-아미디노피라졸 염산염을 mBA 용액에 용해하십시오.
3. 탄산나트륨의 포화 용액으로 pH를 9.0으로 조정하고 실온에서 24시간 동안 안정화시키십시오.
4. 비커(MWCO 10 kDa, 2L)에 투석 백을 사용하여 탈이온수로 mBG 제품을 투석하고 동결 건조 분말의 형태로 보존한다.
   수율 백분율은 수학식8을 통해 85%로 계산되었습니다.
   (8)
5. MBG 분말을NMR 튜브에 D2 O에 용해시키고 ^1H핵 자기 공명 분광법(1 H NMR)^16을사용하여 특성화합니다.

6. mBG /pDNA 폴리 플렉스의 준비 및 특성화

1. 50 μg의 pDNA를 RNase/DNase 가 없는 물에 녹입니다.
2. RNase/DNase가 없는 물 1 mL에 mBG 공중합체 1 mg을 녹입니다.
3. mBG 공중합체 용액을 상이한 공급 비, 즉 상이한 N/P 비율(1:1, 4:1, 8:1, 16:1 및 32:1)에 따라 pDNA 용액에 직접 첨가한다.
   참고: N/P 비는 pDNA에서 중합체 및 인산염 군에서의 구아니딘 그룹의 몰 비, 즉 pDNA내의 GPMA 사슬의 몰 비 및 pDNA의 단핵구로 정의된다. N/P 비율은 pDNA에서 mBG 및 인산염 군 (P)에서 아미노 질소 (N)의 분자량에 따라 계산됩니다.
4. 용액을 와류 믹서와 혼합하고 실온에서 30 분 동안 방치하십시오. 그 후, 인산염 완충액(PBS, pH 7.4)에 혼합물을 분산시키고 후속 실험을 위해 4°C에서 얻어진 mBG/pDNA 폴리플렉스를 보존한다.
   참고: mBG 및 복합체의 평균 입자 크기 및 제타 전위는 동적 광 산란(DLS)^17을사용하여 검출되었다.
5. DLS 및 제타 전위 샘플 세포에서 1 mL의 PBS (pH 7.4)로 mBG/pDNA 폴리플렉스 용액의 10 μL을 희석합니다.
   참고: 입자 크기와 Zeta 전위 검출은 3회 수행되었고 세 값의 평균을 취했습니다.

7. mBG /pDNA 폴리플렉스의 전기 적 지연 실험

참고: 최소 전하비를 결정하기 위해 전기적 지연 실험이 수행되었습니다.

1. pDNA 50 μg를 포함하는 다른 N/P 비율(1:1, 4:1, 8:1, 16:1 및 32:1)을 가진 mBG/pDNA 폴리플렉스의 5개의 단을 취하십시오.
2. mBG/pDNA 폴리플렉스 샘플에 6x 로딩 버퍼를 추가하여 최종 농도를 1x로 표시합니다.
3. 1.5% 아가로즈 젤에 용액을 추가하고 pDNA를 제어로 사용하여 90 mV에서 15 분 동안 젤을 실행하십시오.
4. 젤 이미저를 사용하여 젤사진을 찍습니다.

8. mBG/pDNA 폴리플렉스의 세포 독성

1. 종자 MCF-7 세포는 웰 당 10⁴ 셀의 밀도로 96 웰 플레이트내로. 이어서, 가습된 37°C 인큐베이터에서 DMEM 배지(10% FBS 및 1% 항생제)를 사용하여 12시간 동안 세포를 배양하여 5% CO2를 공급하였다.
2. 배양 배지를 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 mBG/pDNA 폴리플렉스(N/P 4, 8, 16 및 32, n=6)를 함유하는 항생제 없는 DMEM 배양 배지로 6시간 동안 대조군으로 동일한 부량의 PBS 용액을 첨가한 세포를 복용한다. 이어서, 배양배지를 신선한 1640 배지의 150 μL로 대체하고 24시간 동안 세포를 추가로 배양하였다.
3. 5 mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT) 용액(20 μL/well)을 96웰 플레이트에 첨가하고 세포를 4시간 동안 배양한다.
4. 용액을 제거하고 각 우물에 150 μL의 DMSO를 추가하고 96 웰 플레이트를 30 초 흔들어줍니다.
5. 490 nm에서 마이크로플레이트 리더로 광학 밀도(OD)를 측정하여 세포 생존 가능성을 보여준다. 수학식9에 따라 셀 생존율 백분율을 계산합니다.
   세포 생존율 % = (9)

9. mBG / GFP-pDNA 폴리플렉스의 형질 전환 효율

1. 리포터 유전자 녹색 형광 단백질 (GFP) pDNA (GFP-pDNA)를 포함하는 pDNA 50 μg를 RNase /DNase 가없는 물 50 μL에 용해시다. 그런 다음 RNase/DNase가 없는 물 1 mL에 mBG 공중합체 1 mg을 용해시고. pDNA 및 mBG 용액을 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 및 32:1의 충전비(N/P)로 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 초음파 (30 초)를 사용하여 mBG / GFP-pDNA 폴리 플렉스 용액을 분산시키고 후속 실험을 위해 4 °C에서 저장하십시오.
   참고 : N / P 비율은 pDNA에서 mBG 및 인산염 그룹 (P)에서 아미노 질소 (N)의 분자량에 따라 계산됩니다.
2. 종자 MCF-7 세포는 6웰 플레이트에서 웰당 2×10⁵ 세포의 밀도로 12시간 동안 가습된 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서 배양하였다.
3. 배양 배지를 6시간 동안 다른 N/P 비(4, 8, 16 및 32)의 mBG/GFP-pDNA 폴리플렉스를 함유하는 신선한 배양 배지로 교체한다.
4. 배지를 신선한 RPMI1640 배지 2mL로 교체하고 48시간 동안 배양합니다.
5. 세포를 수집하고 유동 세포계로 녹색 형광을 감지합니다.

결과

BNHEMA는 표1에 나타낸 중합의 객관적인 정도에 따라 공급되었다; mBG의 합성 절차는 그림1에 나와 있습니다. 첫째, BNHEMA 호모폴리머는 물-다이옥산 시스템에서 가역적 첨가-단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 제조하였으며, 4-시안펜타노산 디티오벤조에이트사슬 전달제로서 사용하였다. 둘째, PBNHEMA는 BNHEMA-b-APMA 블록폴리머를 준비하는 사슬 전달제로서 사?...

토론

본 연구는 일련의 BNHEMA-b-APMA 블록 폴리머 양이온 유전자 운반체를 소개하였다. 이들 블록 중합체는 가역적 첨가-단편화 사슬 전달(RAFT) 방법을 통해 합성되었다. 친수성 세그먼트 BNHEMA는 용해도를 향상시키기 위하여 소개되었습니다. 메티오닌 및 구아니딘 기는 표적 능력 및 형질감염 효율을 향상시키기 위해 수정되었다^5. MBG 공중합체에서 APMA 사슬 함량이 증가하고 관과이니디?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxybenzotriazole	Macklin Biochemical Co., Ltd,China	H810970	≥97.0%
1,4-dioxane	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10008918	AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	A107935	98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	E106172	AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid)	Aladdin Co., Ltd., China	A106307	Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid	Aladdin Co., Ltd., China	C132316	>97%(HPLC)
Acetate	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	81014818	AR
Acetone	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10000418	AR
Agarose	Aladdin Co., Ltd., China	A118881	High resolution
Ascorbic acid	Aladdin Co., Ltd., China	A103533	AR
DMSO	Aladdin Co., Ltd., China	D103272	AR
Ethylene glycol	Aladdin Co., Ltd., China	E103319	AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	N129096	≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide	ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China	CF259748	≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin	Aladdin Co., Ltd., China	N105629	AR
PBS buffer	Aladdin Co., Ltd., China	P196986	pH 7.4
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	pDNA-EGFP	pDNA-EGFP
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	Pdna	pDNA
Sodium carbonate decahydrate	Aladdin Co., Ltd., China	S112589	AR
Trimethylamine	Aladdin Co., Ltd., China	T103285	AR