Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler

Özet

Bu çalışma, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler (mBG) hazırlanması sunar. Elde edilen mBG 'nin plazmid DNA 'Sı karmaşıklığı ve transfeksiyon verimliliği de incelenmiştir. Raft yöntemi, özel fonksiyonel gruplar içeren polimerleştirici monomerlerin için çok yararlıdır.

Özet

Ters dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) polimerizasyon radikal polimerizasyon ve yaşam polimerizasyonu avantajlarını birleştirir. Bu çalışma RAFT polimerizasyonu ile metionin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler hazırlanması sunar. Öncelikle, n, n-bis(2-hidroksiilil) metakrilamid-b-n-(3-AMINOPROTRANSL) metakrilamid (BNHEMA-b-apma, ba), 4, 4 '-AZOBIS (4-SIYANOVALERIK asit) (Acva) kullanarak Raft polimerizasyonu ile sentezlenmiş Aracı ve 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoate (CTP) zincir transfer ajanı olarak başlatılıyor. Daha sonra, n, n-bis(2-hidroksiil) metakrilamid-b-n-(3-guanidinoprog) methacrylamid (metiyonin gredyle bnhema-b-gpma, MBG), apma 'daki Amin gruplarını metiyonin ve guanidin ile değiştirerek hazırlanmıştır. Grup. Üç çeşit blok polimerleri, mBG1, mBG2 ve mBG3 karşılaştırılması için sentezlenmiş. APMA içeriğini ölçmek için bir ninhidrin reaksiyonu kullanıldı; mBG1, mBG2 ve mBG3 sırasıyla APMA% 21, 37% ve 52% vardı. Jel geçirgenlik Kromatografi (GPC) sonuçları, BA kopolimerlerin 16.200 molekül ağırlıklarına (BA1), 20900 (BA2) ve 27200 (BA3) g/mol 'e sahip olduğunu göstermiştir. Elde edilen blok kopolimer gen taşıyıcıların Plasmid DNA (pDNA) karmaşıklığı da incelenmiştir. PDNA sırasıyla mBG1, mBG2, mBG3 ile tamamen karmaşıkken şarj oranları (N/P) 8, 16 ve 4 idi. MBG/pDNA polyplexes N/P oranı 1 ' den yüksek olduğunda, mBG Zeta potansiyeli pozitif oldu. 16 ile 32 arasında bir N/P oranı, mBG/pDNA polyplexes ortalama parçacık boyutu 100-200 Nm arasındadır. Genel olarak, bu çalışma blok kopolimer taşıyıcı sentezi için basit ve kullanışlı bir protokol göstermektedir.

Giriş

Son yıllarda, her türlü hastalıkları tedavi etmek için ilaç olarak nüklütik asitlerin terapötik teslim edilmesi için gen terapisi ortaya çıkmıştır¹. Plasmid DNA (pDNA) ve küçük müdahale RNA (siRNA) dahil gen ilaçların geliştirilmesi, ilaç teslim sistemi (DDS)²' nin stabilitesi ve verimliliğine dayanır. Tüm DDS arasında, cationıc polimer taşıyıcılar iyi stabilite avantajları vardır, düşük immünogenisite, ve facile hazırlama ve modifikasyon, hangi katort polimer taşıyıcılar geniş uygulama umutları vermek^3,4. Biyolojik olarak pratik uygulamalar için, araştırmacılar yüksek verimlilik, düşük toksisite ve iyi hedefleme yeteneği⁵ile bir katyonik polimer taşıyıcı bulmak zorundadır. Tüm polimer taşıyıcılar arasında blok kopolimerler en yaygın olarak kullanılan ilaç teslim sistemlerinden biridir. Blok kopolimerler yoğun kendi kendi kendine montaj özelliği ve yetenekleri micelles, microspheres ve ilaç teslim⁵nanopartiküller oluşturmak için incelenmiştir. Blok kopolimerler yaşam polimerizasyonu veya tıklama Kimya yöntemleri ile sentezlenmiş olabilir.

1956 yılında, Szwarc ve al. canlı polimerizasyon konusunu kaldırdı, zincir kırma reaksiyonları olmadan bir reaksiyon olarak tanımlayarak^6,7. O zamandan beri, bu yöntemi kullanarak polimerleri sentezlemek için birden fazla teknik geliştirilmiştir; Böylece, yaşayan polimerizasyon Polimer bilim bir kilometre taşı olarak görülebilir⁸. Yaşayan polimerizasyon yaşam anyonik polimerizasyon, yaşam katyonik polimerizasyon ve geri dönüşümlü deaktivasyon radikal polimerizasyon (RDRP)⁹sınıflandırılabilir. Yaşayan anyonik/katyonik polimerizasyon, sıkı reaksiyon koşulları nedeniyle sınırlı bir uygulama kapsamına sahiptir¹⁰. Kontrollü/yaşayan radikal polimerizasyon (CRP) hafif reaksiyon koşulları, uygun eğilim ve iyi verim ve böylece son yıllarda büyük bir araştırma odağı olmuştur¹¹. CRP 'de, aktif yayılma zincirleri, serbest radikallerin konsantrasyonunu azaltmak ve zincir radikallerinin yayılmasının bimoleküler reaksiyonu önlemek için uyuyan olanlara geri döndürülebilir. Ek polimerizasyon, yalnızca aktif olmayan uyuyan yayılma zincirleri ters şekilde zincir radikallerine animasyonsa devam edebilir. Radikal polimerizasyon yaşayan en umut verici formlardan biri olarak, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) polimerizasyon kontrollü molekül ağırlığı ve yapısı ile blok polimerleri verim için uygulanabilir bir yöntemdir, dar moleküler ağırlık Dağıtım ve fonksiyonel gruplar¹²taşıma. Başarılı RAFT polimerizasyonu için anahtar zincir transfer ajanları etkisi, genellikle çok yüksek zincir transfer sabiti sahip dithioesters.

Bu yazıda, bir sal polimerizasyon yöntemi, bir başlatıcı ajan olarak 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric acid) (ACVA) ve zincir transfer ajanı olarak 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat (CTP) alarak BNHEMA-b-apma blok polimer hazırlamak için tasarlanmıştır. Raft polimerizasyon iki kez bnhema 'ya katyonik polimer taşıyıcıları tanıtmak için kullanıldı. Daha sonra, APMA zincirindeki Amin grupları metiyonin ve guanidinilasyon reaktifinin 1-amidinopyrazol hidroklorür ile değiştirildi. Guanidinilasyon reakajının ve metakrilamid polimer iskelet yapısının pozitif ücretlerinin kullanımı, elde edilen blok polimer taşıyıcıların hücresel Alım verimliliği iyileştirildi.

Protokol

1. BNHEMA polimer sentezi (PBNHEMA)

1. Polimerizasyon şişesinde 1 mL distile suyunda 1,87 g , n-bis(2-hidroksiil) METAKRILAMID (bnhema) çözülür.
   Not: polimerizasyon şişesi, kauçuk stoper ve manyetik karıştırıcı ile yuvarlak alt Flask olduğunu.
2. 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat (CTP) ve 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericacid) (ACVA) 0,03 g, 5 mL 'Lik bir Beaker 'da 1, 4-dioxane, 0,5 mL çözülür. Ardından, CTP ve ACVA çözeltisi adım 1,1 polimerizasyon şişesine ekleyin.
3. Üç donma-pompa-çözme döngüsü yoluyla azot ile polimerizasyon şişesinde reaksiyon sistemini havalandırın.
   1. Ayrıntılı olarak, bir kondens tuzağı kullanarak polimerizasyon şişesinde solüsyonu dondurmak, demir desteğine polimerizasyon şişesini düzeltin ve iğne ile uçlu bir boru ile reaksiyon karışımına azot enjekte et (#9 iğne, iç çapı 0,65 mm, dış çapı 0,9 mm). Polimerizasyon şişesini mühürleyin ve solüsyonu oda sıcaklığında 30 dakika çözün.
   2. Donma pompası çözme döngülerini üç kez tekrarlayın.
4. Polimerizasyon şişesini 70 °C ' lik yağ banyosuna koyun ve çözeltinin nitrojen atmosferinin altında 24 saat tepki vermesini sağlar.
5. Polimerizasyon şişesini 0 °C ' de soğutur ve polimerizasyon sürecini sonlandırmak için kauçuk stoper açın.
6. 2 h için bir-20 °C buzdolabında precool aseton ve sonra 50:1 (v/v) adım 1,5 reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Bundan sonra, 10 dk için 8.200 x g santrifüjün aseton kaldırmak ve çökelme toplamak.
7. Sentezlenmiş PBNHEMA arındırmak için, toplanan çökeltiye 2 mL saf su içinde çözülür ve sonra 1:50 (v/v) oranında, 100 mL presoğutmalı aseton ile karıştırın. Solüsyonu 10 dakika 8.200 x g 'de santrifüjle toplayın ve çökelme topla. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
8. 50 °C vakum kurutıcısı kullanarak üretilen PBNHEMA 'nın kurutun. Kurutulmuş bir kez, bir denge ile toz tartın. Denklemi 1 ' e göre verim hızını hesaplayın.
   1
   Not: Bu deneyde elde edilen verim% 77,2 idi.

2. BNHEMA-b-apma polimer sentezi (BA)

1. 10 mL 'Lik bir Beaker içinde 5 mL distile su içinde N-(3-aminoprotransl) metakrilamid hidroklorür (apma) ve 0,93 g PBNHEMA 0,96 g çözülür.
2. 1, 4-dioxane 0,5 mL 'de 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric asit) (ACVA) 0,01 g çözülür ve Bölüm 2,1 APMA-PBNHEMA çözeltisi ile karıştırın.
3. Karışımı bir polimerizasyon şişesine aktarın ve 1 saat boyunca kuru nitrojen ile havalandırın.
4. Polimerizasyon şişesini 70 °C ' lik yağ banyosuna koyun ve nitrojen atmosferinin altında 24 saat tepki gösterelim.
5. Polimerizasyon şişesini 0 °C ' de soğutur ve polimerizasyon sürecini sonlandırmak için kauçuk stoper açın.
6. Adım 1,6 soğutulmuş aseton için çözüm transferi ve sonra 10 dakika için 8.200 x g çözüm SANTRIFÜJLE ba çökeltmek için.
7. BA 'yı 2 mL distile su içinde eritin ve soğutulmuş aseton içinde polimeri çökeltir. Üç kez tekrarlayın.
8. Üretilen BA 'yı 50 °C ' lik vakum kurutıcısı ile kurutun ve elde edilen tozu tartın. Denklemi 2' ye göre verim hızını hesaplayın.
   
   Not: Bu denemede, verim oranı% 82,0 olarak hesaplanır.

3. BA kopolimer içinde ninhidrin yöntemi ile APMA 'nın mol yüzdesini belirleyin

Not: spektrofotometri çok bileşenli amino asitlerin içeriğini belirlemek için kullanılır. Prensip olarak, emilikte amino asit içeriği ile ilişkili olduğu ninhidrin ve amino asitin renk reaksiyonu^13,14.

1. 125 mL kaynar damıtılmış su içinde ninhidrin 5 gr çözülür. Ayrıca, sıcak distile su 250 mL 'de C vitamini 5 g çözülür. Manyetik karıştırma altında ninhidrin solüsyona dropwise C vitamini çözeltisi 250 mL ekleyin. 15 dakika boyunca karıştırın ve sonra 4 °C buzdolabında reaksiyon solüsyonu Chill devam edin.
2. Buzdolabından çözüm alın ve azaltılmış ninhidrin elde etmek için bir Buchner hunisi kullanarak emiş tarafından filtre. Çökeltmek toplamak ve bir fosfor pentoksit kurutucu içinde korumak.
3. Çözülen 85 mg ninhidrin ve 15 mg azaltılmış ninhidrin 10 mL etilen glikol monomoetil eter içinde ninhidin-boyama çözeltisi hazırlamak için.
   Not: Ninhidin-boyama solüsyonu APMA 'da α-amino ile reaksiyon verebilir ve bir önceki çalışmada¹⁵' te açıklandığı gibi bir yapıya sahip bir menekşe bileşiği oluşturur.
4. Seyreltici 1 mL 0, 1, 10, 100, 1.000 mg/mL APMA monomer çözeltileri 1 mL asetat tampon (2 M, pH 5,4), ve ardından 1 mL ninhidin-boyama solüsyonu ekleyin, sırasıyla.
5. Bir kaynar su banyosunda 15 dakika için karışımları ısı ve sonra su çalışan kullanarak serin. Çözümler 5-10 dk oturmak ve 3 mL% 60 etil alkol ile seyreltmeli ve iyice karıştırın edelim. Bir spektrofotometre kullanarak 570 nm 'de emici ölçün ve standart eğri (Denklem 3) çizin.
   
   Not: Denklem 3, 570 nm 'de APMA konsantrasyonuna karşı emilme doğrusal bağlantı öğesinden türetilmiştir.
6. 1 mL damıtılmış suda 0,01 g BA çözülür; 1 ml asetat tamponu (2 M, pH 5,4) ve 1 mL ninhidrin boyama çözeltisi ekleyin. 570 nm de emici göre APMA molar içeriğini hesaplayın.
   
   5
   
   Not: hesaplama formülleri aşağıdaki gibidir (denklemler 3-6).

4. metiyonin grepi BA polimer sentezi (mBA)

1. Çözülür 8,9 mg FOMC-Methionine 5 mL DMSO bir iyileşme Flask.
2. Ekleme 6,92 mg 1-etil-3-(3-dimetylaminopropil) kardiimid hidroklorür (EDCl) ve 4,86 mg 1-hidroxybenzotriazol (HOBT) kurtarma Flask ve tepki 0 °C için 0,5 h.
3. 5 mL DMSO çözeltisi içinde BA 2,59 g çözülür ve sonra 50 μL trimetilamin ekleyin; Kurtarma Flask bu çözüm dropwise ekleyin (adım 4,2) ve çözüm oda sıcaklığında 0,5 h için tepki izin.
4. Dialyze bir diyaliz çantası (mwco 10 kDa) 24 saat için 2 L kabı kullanarak adım 4,3 ba çözümden DMSO ve trimetilamin kaldırmak için; her 6 saat deiyonize su yerine.
5. Elde edilen mBA 'nin donma-kurumasını yapın ve denklem 7' ye göre verim oranını hesaplamak için tartın.
   
   Not: Bu durumda, verim oranı% 71 olarak belirlendi.
6. 570 nm 'de emilen metiyonin miktarını hesaplamak için emilme ölçmek suretiyle mBA içeren NH₂ ' nin ölçülmesi. Denklem 8' e göre metiyoninin molar içeriğini hesaplayın.
   

5. guanidinated ve metiyonin konjudik BNHEMA-b-apma polimer sentezi (MBG)

Not: üç farklı mBA1, mBA2 ve mBA3 kopolimer sentezlenmiş. mBA3 kopolimer aşağıdaki adımlarda örnek olarak kullanılır.

1. 5 mL saf suda 60 μmol amino grup içeren mBA3 çözülür.
   Not: amino grup içeriği 3,5 adımda açıklandığı gibi ninhidrin yöntemi kullanılarak niceleyilmiş.
2. MBA çözümlerinde guanidinilasyon reaktifinde 1-amidinopyrazol hidroklorür 40,6 mg (300 μmol) çözülür.
3. Sodyum karbonat doymuş çözeltisi ile 9,0 pH ayarlayın ve oda sıcaklığında 24 saat için stabilize edelim.
4. MBG ürününü deiyonize su ile bir kabı içinde diyaliz çantası kullanarak (mwco 10 kDa, 2 L) Dialyze ve dondurmalı toz şeklinde koruyun.
   Verim yüzdesi denklem 8ile% 85 olarak hesaplanır.
   8
5. NMR tüpleri D₂O MBG tozu çözülür ve ¹h nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (¹h NMR)¹⁶kullanarak karakterize.

6. mBG/pDNA polyplexes hazırlama ve karakterizasyonu

1. 50 μL RNase/DNase-serbest su içinde 50 μg pDNA çözülür.
2. 1 mL RNase/DNase içermeyen su içinde 1 mg mBG kopolimer çözülür.
3. MBG kopolimerler çözümünü, farklı besleme oranlarına göre doğrudan pDNA çözümüne ekleyin, yani farklı N/P oranları (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1).
   Not: N/P oranı, polimerde guanidin grubunun molar oranı ve pdna 'daki fosfat grubunda, yani polimer içinde gpma zincirinin molar oranı ve pdna 'daki mononükleotid olarak tanımlanır. N/P oranı, mBG 'de amino nitrojen (N) molekül ağırlıklarına ve pDNA 'daki fosfat grubunda (P) göre hesaplanır.
4. Çözeltileri bir Vortex karıştırıcı ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika durmalarına izin verin. Bundan sonra, fosfat tampon çözeltisi (PBS, pH 7,4) karışımı dağıtmak ve takip denemeleri için 4 °C ' de elde edilen mBG/pDNA polyplexes korumak.
   Not: mBG ve kompleksleri ortalama parçacık boyutu ve Zeta potansiyeli dinamik ışık saçılma (DLS)¹⁷kullanılarak tespit edildi.
5. DLS ve Zeta olası örnek hücrelerinde 1 mL PBS (pH 7,4) ile mBG/pDNA Polyplex çözümleri 10 μL seyreltmeli.
   Not: parçacık boyutu ve Zeta potansiyel algılama üç kez gerçekleştirilen ve üç değerin ortalama alınmıştır.

7. mBG/pDNA polyplexes elektroforetik retardasyon deneyi

Not: minimum şarj oranını belirlemek için elektroforetik bir gerilme deneyi yapılmıştır.

1. MBG/pDNA polyplexes farklı N/P oranları (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1) içeren beş grup pDNA 50 μg alın.
2. 6x yükleme arabelleği mBG/pDNA Polyplex örneklerine 1x son konsantrasyonuna ekleyin.
3. Çözümler ekleyin 1,5% agaroz jelleri ve 90 MV at jel çalıştırmak 15 dakika, kontrol olarak pdna kullanarak.
4. Jel görüntüleştirici kullanarak jellerin fotoğraflarını çekin.

8. mBG/pDNA polyplexes sitotoksisitesi

1. Seed MCF-7 hücreler içine 96-kuyu plakaları bir yoğunlukta 10⁴ hücreler başına iyi. Daha sonra,% 5 CO₂ile sağlanan bir nemlendirilmiş 37 °c ' lik inkükote dmem Orta (% 10 FBS ve% 1 antibiyotik) kullanarak 12 h için hücreler kültür.
2. Kültür ortamını, 6 h için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve mBG/pDNA polyplexes (N/P 4, 8, 16, ve 32, n = 6) içeren antibiyotik içermeyen DMEM kültür medyası ile değiştirin, kontrol olarak PBS çözeltisi eşit hacimlerle eklenen hücreleri alarak. Daha sonra, kültür ortamını 150 μL taze 1640 orta ve daha fazla kültür ile değiştirmek için hücreler 24 saat.
3. Ekle 5 mg/mL 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-il)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT) çözüm (20 μL/Well) 96-kuyu plakaları ve daha fazla kültür için hücreler 4 h.
4. Çözümü çıkarın ve 150 μL DMSO her iyi için ekleyin ve 96-kuyu plakaları 30 saniye sallayın.
5. Hücre viability göstermek için bir Mikroplaka Okuyucu ile 490 nm optik yoğunluğu (OD) ölçün. Denklem 9' a göre hücre canlılığı yüzdesini hesaplayın.
   Hücre canlılığı% = (9)

9. mBG/GFP-pDNA polyplexes transfeksiyon verimliliği

1. 50 μL RNase/DNase-ücretsiz su içinde Reporter gen yeşil floresan protein (GFP) pDNA (GFP-pDNA) içeren pDNA 50 μg çözülür. Daha sonra 1 mg mBG kopolimer ' i 10 mL RNase/DNase-serbest suda eritin. PDNA ve mBG çözümünü 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 ve 32:1 oranında bir ücret oranıyla (N/P) karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın. Ultrasonik dalgalar (30 s) kullanarak mBG/GFP-pDNA polyplexes solüsyonu dağıtın ve takip denemeleri için 4 °C ' de saklayın.
   Not: N/P oranı, mBG 'de amino nitrojen (N) molekül ağırlıklarına ve pDNA 'daki fosfat grubunda (P) göre hesaplanır.
2. Tohum MCF-7 hücrelerin bir yoğunluğu 2 × 10⁵ hücreler başına iyi bir 6-kuyu plaka ve kültür onları 37 °c ve 5% Co₂ için bir nemlendirici kuluçk 12 h.
3. Kültür ortamını, 6 h için farklı N/P oranlarının (4, 8, 16 ve 32) mBG/GFP-pDNA polyplexes içeren taze kültür ortamı ile değiştirin.
4. 48 h için taze RPMI1640 orta ve kültür 2 mL ile orta değiştirin.
5. Hücreleri toplayın ve bir akış cytometer ile yeşil floresans algılayın.

Sonuçlar

BNHEMA, Tablo 1' de gösterilen polimerizasyon derecesine göre beslendi; mBG sentezi prosedürü Şekil 1' de gösterilir. Öncelikle, BNHEMA homopomer, su-dioxane sistemindeki geri dönüşümlü ek parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile, bir zincir transfer ajanı olarak 4-cyanopentanoik asit dithiobenzoat kullanılarak hazırlanmıştır. İkincisi, PBNHEMA BNHEMA-b-apma blok polimer hazırlamak için bir zincir transfer ajanı olarak kullanılmışt?...

Tartışmalar

Bu çalışmada bir dizi BNHEMA-b-APMA blok polimer cationıc gen taşıyıcıları tanıtıldı. Bu blok polimerleri, geri dönüşümlü toplama-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile sentezlenmiş. Hidrofilik segment BNHEMA çözünürlüğünü artırmak için tanıtıldı. Metionin ve guanidin grupları hedef yeteneği ve transfeksiyon verimliliğini artırmak için değiştirilmiş⁵. APMA zincir içeriği arttı ve mBG kopolimer guanidinylation mBG/pDNA polyplexes parçacık boyut...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxybenzotriazole	Macklin Biochemical Co., Ltd,China	H810970	≥97.0%
1,4-dioxane	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10008918	AR
1-amidinopyrazole Hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	A107935	98%
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	E106172	AR
4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid)	Aladdin Co., Ltd., China	A106307	Analytical reagent (AR)
4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid	Aladdin Co., Ltd., China	C132316	>97%(HPLC)
Acetate	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	81014818	AR
Acetone	Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China	10000418	AR
Agarose	Aladdin Co., Ltd., China	A118881	High resolution
Ascorbic acid	Aladdin Co., Ltd., China	A103533	AR
DMSO	Aladdin Co., Ltd., China	D103272	AR
Ethylene glycol	Aladdin Co., Ltd., China	E103319	AR
N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride	Aladdin Co., Ltd., China	N129096	≥98.0%(HPLC)
N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide	ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China	CF259748	≥98.0%(HPLC)
Ninhydrin	Aladdin Co., Ltd., China	N105629	AR
PBS buffer	Aladdin Co., Ltd., China	P196986	pH 7.4
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	pDNA-EGFP	pDNA-EGFP
Plasmid DNA	BIOGOT Co., Ltd, China	Pdna	pDNA
Sodium carbonate decahydrate	Aladdin Co., Ltd., China	S112589	AR
Trimethylamine	Aladdin Co., Ltd., China	T103285	AR