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Resumen

Transformación mediada por Agrobacterium utilizando un método de inmersión floral puede ser empleado con éxito para crear líneas transgénicas estables del modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Presentamos un protocolo modificado de eso para Arabidopsis thaliana, teniendo en cuenta los hábitos de crecimiento diferentes y características fisiológicas de la extremophyte.

Resumen

Schrenkiella parvula es un extremophyte adaptado a varios abiótico, incluyendo múltiples tensiones de la toxicidad de iones. A pesar de recursos genómicos de alta calidad disponibles para el estudio de cómo las plantas se adaptan a ambiente destaca, su valor como un modelo de genómica funcional y la herramienta ha sido limitada por la falta de un sistema de transformación posible. En este protocolo, informe cómo generar transgénicos estable S. parvula líneas utilizando un método de inmersión floral mediada por Agrobacterium. Modificamos el protocolo de transformación utilizado para a. thaliana para tener en cuenta las características únicas de S. parvula, como un hábito de floración indeterminada y un contenido alto de cera epicuticular en las hojas. Brevemente, las semillas de S. parvula se estratificaron a 4 ° C durante cinco días antes de la siembra. Las plantas fueron cultivadas en un fotoperiodo de luz 14 h y 10 h oscuro y una 130 μmol m-2s-1 intensidad de la luz, a 22 ° C a 24 ° C. Ocho a nueve semanas de edad las plantas con inflorescencias múltiples fueron seleccionado para la transformación. Estas inflorescencias se sumergieron en una solución de infiltración de Agrobacterium tumefaciens GV3101 llevan el plásmido pMP90RK . Se realizaron dos rondas de flor de inmersión con un intervalo de tres a cuatro semanas para aumentar la eficiencia de transformación. Las semillas de T1 fueron recogidas y secadas durante cuatro semanas en un recipiente con desecante antes de germinación a pantalla para candidato transforma líneas. Resistencia a la BASTA fue utilizada para plantas de T1. Pulveriza la solución BASTA tres veces con un intervalo de tres días a partir de dos semanas de edad las plantas reducir falsos positivos. Se realizó una prueba de gota BASTA de sobrevivir las plantas individuales para identificar transformantes positivo verdadero. La eficiencia de transformación fue 0,033%, obtención de plantas transgénicas de 3 a 4 por 10.000 semillas T1 propagadas.

Introducción

En este protocolo, se describen el crecimiento y establecimiento de líneas transgénicas estables para el modelo extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilidad de un sistema eficiente de transformación es una característica distintiva de cualquier modelo genético. Plantas que prosperan en ambientes extremos, que se refiere como extremophytes, proporcionan un recurso crítico para la comprensión de adaptaciones de la planta al estrés ambiental. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula y Eutrema parvulum) es una modelo extremophyte, con la expansión de recursos genómicos1,2,3,4,5. Sin embargo, protocolos de transformación aún no han sido denunciados por S. parvula en estudios publicados.

El genoma de S. parvula es el primer genoma de extremophyte publicado en Brassicaceae (familia de mostaza-col) y muestra un extenso synteny genoma total con el modelo no-extremophyte,1de Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, estudios comparativos entre la a. thaliana y S. parvula podrían beneficiarse de la riqueza de los estudios genéticos realizados en a. thaliana para hacer hipótesis informativas sobre cómo ha evolucionado y regulado el genoma de S. parvula diferente para hacer frente a extremos ambientales destaca5,6,7. Parvula de S. es una de las especies más tolerantes a la sal (basadas en suelo NaCl LD50) entre conocidos parientes silvestres de a. thaliana8. Además de la tolerancia de NaCl, S. parvula sobrevive y completa su ciclo de vida en presencia de varios iones sal a altas concentraciones de tóxicos para la mayoría de las plantas7. En respuesta al estrés abiótico en su hábitat natural, ha evolucionado varios rasgos, entre los cuales varios han sido estudiados en la bioquímica o fisiológica nivel 8,9,10, 11.

Desde 2010, ha habido más de 400 publicaciones peer-reveiwed que utilizan S. parvula como una especie de objetivo o utilizan en comparación con otros genomas de plantas. Sin embargo, un evidente cuello de botella se podía identificar con un vistazo de qué tipo de estudios se han realizado. La mayoría de estos informes discutir el potencial uso de parvula S. en futuros estudios o usos en genómica comparativa y estudios de phylogenomic. Debido a la falta de un protocolo de prueba de concepto de transformación establecido por S. parvula, no se ha utilizado en estudios de genómica funcional, a pesar de tener uno de los genomas de plantas de calidad más alta disponibles hasta la fecha (> 5 Mb contig N50) montado y anotado en pseudomolecules nivel del cromosoma1.

El método de transformación mediada por Agrobacterium de inmersión floral se ha convertido en el método más ampliamente usado para crear líneas trasngenic en a. thaliana, y el desarrollo de un sistema reproducible de transformación fue un factor decisivo en su éxito como una modelo genético12,13. Sin embargo, no todas las especies de Brassicaceae se han demostrado para ser transformado con éxito usando el método de inmersión floral desarrollado de a. thaliana. Especialmente, las especies de Brassicaceae Lineage II que incluyen S. parvula ha sido recalcitrante a los métodos de transformación base floral dip14,15.

El hábito de crecimiento indeterminado de la floración de S. parvula, combinado con su morfología de hoja estrecha, ha hecho difícil adoptar el método de transformación de floral dip estándar mediada por Agrobacterium. En este estudio, Divulgamos el protocolo modificado que hemos desarrollado para la transformación reproducible de S. parvula.

Protocolo

1. crecimiento de la planta

  1. Esterilización de las semillas (opcional)
    1. Preparar la lejía de 50% en agua destilada doble (ddH2O) con 1 o 2 gotas de un detergente no iónico (véase Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL. Invertir el tubo varias veces para mezclar la solución.
      Nota: Es preferible llevar a cabo la esterilización de las semillas en un flujo laminar con una superficie esterilizada UV durante 15 minutos.
    2. Añadir la solución de lejía a ~ 100-200 semillas S. parvula en un tubo de 1,5 mL. Mezcle bien y deje el tubo durante 5 minutos.
    3. Quitar el cloro del tubo y añadir etanol al 70%. Lavar las semillas mediante pipeteo varias veces y retire inmediatamente la solución de etanol.
    4. Lavar las semillas en agua esterilizada para extraer etanol y exceso de lejía y luego quitar el agua. Repita este paso 5 o 6 veces.
  2. Estratificación de semillas
    1. Sumergir las semillas en agua esterilizada y guardar durante 5 a 7 días a 4 ° C. Alternativamente, siembre semillas secas no esterilizadas directamente en suelo mojado y coloque la bandeja de suelo de 5 a 7 días a 4 ° C.
  3. Cultivo de plantas en la preparación de la transformación
    1. Llenar el suelo mezclar (véase Tabla de materiales) en macetas de 7 x 6 cm2 , remojo las macetas en agua y rociar el agua de la parte superior para asegurar un medio de crecimiento uniformemente húmedo. Agregar granos de 5 – fertilizante (véase Tabla de materiales) en la superficie del suelo de cada maceta.
      Nota: Como hemos experimentado, S. parvula crece bien en cualquier mezcla de suelo donde puede crecer a. thaliana .
    2. Usando un palillo de dientes mojado, transferencia 20 ~ 25 semillas por maceta en la superficie del suelo.
      Nota: Una práctica conveniente es poner un lote de 4 a 5 semillas en las cuatro esquinas y el centro de la maceta (figura 1, día 15, el panel izquierdo).
    3. Cubrir la bandeja del pote con una cúpula transparente para mantener las semillas bajo alta humedad durante la germinación.
    4. Mantenga las bandejas de planta en una cámara de crecimiento con una intensidad de luz fijada en 130 μmol m−2 s−1 luz, 22 – 24 ° C de temperatura y 14 h por día/10 h / ciclo de noche. Retire las cúpulas 7-10 días después de la germinación. Añadir agua de la parte inferior de la bandeja para mantener el suelo humedecido uniformemente en un nivel deseable.
    5. Eliminar las plantas de semillero extras y dejar sólo 4 – 5 plántulas sanas por maceta bien separada entre sí (figura 1, día 15, panel derecho).
    6. Regar las plantas cada dos días y fertilizar con 0.2 x solución16 de Hoagland una vez cada dos semanas.
      Nota: Mantener la humedad del suelo a un nivel uniforme es clave al cultivo S. parvula constantemente y sano.
    7. Siguen creciendo las plantas para 8-10 semanas hasta inflorescencias múltiples producen 100 – 150 yemas florales por planta (figura 1, día 60 – 80). En el día previsto para la transformación de base floral dip (paso 4.5), quite todas silicuas maduras y en desarrollo de las plantas.

2. clonación en un Vector el elemento genética/genómica de interés para la transformación de la planta

  1. Amplificar el fragmento de ADN de destino utilizando la polimerasa de reacción en cadena (PCR)17 y aislar el producto PCR mediante una extracción de gel kit (véase Tabla de materiales) según el protocolo del kit o cualquier otro método apropiado para purificar ADN mediante gel de agarosa electroforesis17,18. Verificar la secuencia de lo aislado del producto de PCR mediante secuenciación de Sanger19.
  2. Clon el producto deseado de la PCR en el vector de clonación y transformar el constructo clonado en la competente e. coli las células usando una topoisomerasa clonación basada en kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Extensión 50 μl de los productos transformados en Luria-Bertani20 (LB) agar crecimiento bacteriano los medios de comunicación (tabla 1) con los antibióticos apropiados, ej., 50 μg / mL espectinomicina (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C durante la noche.
  4. Al día siguiente, seleccione colonias solo 5 – 10, inocular en medio LB líquido con los antibióticos apropiados e incubar con agitación suave a 37 ° C durante la noche.
  5. Plásmidos aislados mediante un aislamiento del plásmido kit (véase Tabla de materiales) y verificar a través de la secuenciación de Sanger19 si la secuencia de destino amplificada en 2.1 se clona correctamente.
  6. Transferir el producto de PCR clonado y verificado a un vector de destino para la transformación de la planta compatible con clonación basada en la recombinación (véase Tabla de materiales), utilizando una mezcla de enzima recombinase kit siguientes (véase Tabla de materiales), instrucciones del fabricante del kit. Repita del paso 2.3 paso 2.5 para aislar y verificar clones albergar construcciones de plásmido adecuado.

3. transformar la construcción de vectores para la transformación de la planta de Agrobacterium tumefaciens

  1. Transformar el plásmido de la construcción del vector de 2,6 en la cepa de a. tumefaciens GV3101:pMP90RK21, que abriga un gene de resistencia rifampicina para la selección de fondo cromosómica. Uso de antibióticos apropiados, por ejemplo, gentamicina o kanamicina (véase Tabla de materiales), para la selección de la planta de transformación construir (plásmido Ti). Un protocolo breve de a. tumefaciens transformación por electroporación está incluido en la sección 3.2.
  2. A. tumefaciens transformación por electroporación
    1. Descongelar las células competentes de a. tumefaciens 22 en hielo. Mezclar 0.1 – 1 μg de plásmido preparado a partir de 2.6, disuelto en 1-2 μl de ddH2O, con células competentes en el hielo. Transferir la mezcla en una cubeta de electroporación (véase Tabla de materiales).
    2. Realizar electroporación en la mezcla de células competentes de 3.2.1, usando un electroporator y plásmidos (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: Limpie la superficie de la cubeta antes de la electroporación.
    3. Transferir la mezcla de reacción de la cubeta a un tubo de microcentrífuga que contiene 1,5 mL de LB líquido y mezclar bien con el pipeteo e incubar durante 1 h a 28 ° C con agitación suave.
  3. Inocular la transformada a. tumefaciens de la sección 3.2 en placas de LB que contengan antibióticos de selección apropiada (p. ej. kanamicina 25 μg / mL, espectinomicina 50 μg / mL, gentamicina 25 μg / mL y rifampicina 50 μg / mL) e incubar a 28 ° C durante 3 días.

4. mediada por Agrobacterium transformación de S. parvula

  1. Inocular el solo transforman colonias de las placas en 10 mL de medio líquido LB que contienen antibióticos (igual que en 3.3) en una estéril 50 mL cónico del tubo (véase Tabla de materiales). Incubar durante 24 h en un incubador de agitación (véase Tabla de materiales) a 250 rpm a 28 ° C.
  2. Transferir la solución bacteriana de 3.4.1 a un matraz estéril de 250 mL, agregar 40 mL de medio líquido LB con los antibióticos apropiados e incubar 12 h hasta que la densidad óptica en longitud de onda 600 nm (OD600) alcanza alrededor de 2.0.
  3. Centrifugar el a. tumefaciens cultureat 3.100 x g durante 10 minutos Retire el sobrenadante y resuspender el cultivo bacteriano en 40 mL de solución de infiltración de a. tumefaciens (tabla 1).
  4. Diluir el resuspendido a. tumefaciens con solución de infiltración para un final de OD600 de 0,8. Añadir 25 μl de solución de surfactante (tabla 1) a 50 mL de a. tumefaciens diluida de la solución y mezclar invirtiendo varias veces.
  5. Inmersión de la inflorescencia de las plantas en la solución de a. tumefaciens preparado en la sección 4.4 para 20 s. una fresca solución bacteriana después de la inmersión inflorescencia de seis botes. Asegúrese de que todas las flores están en contacto con la solución. Soluciones bacterianas pipeta directamente flores situados en la parte inferior de la inflorescencia no se sumergieron en la solución.
    Nota: Para la transformación de la primera ronda, asegúrese de quitar todos silicuas maduras y en desarrollo, utilizando un bisturí afilado o tijeras pequeñas. No retire silicuas en caso de transformación por segunda vez.

5. transformación de la planta cuidado y la segunda transformación

  1. Coloque las plantas florales-cruce horizontalmente en charolas limpias con cúpulas para cubrir las plantas y colocar en una habitación oscura crecimiento durante 1 – 2 días.
    Nota: Mantener las flores bajo alta humedad es importante en esta etapa (figura 1, las plantas después de la transformación).
  2. Volver las plantas a una posición vertical y las plantas de transferencia a un cuarto de crecimiento con un h 14 por día/10 h por ciclo nocturno, 130 μmol m-2 s-1 intensidad de la luz y temperatura de 22 a 24 ° C.
  3. Supervisar las inflorescencias sumergidas en la semana siguiente. Si un número significativo de las flores abortan (figura 2), repetir la inmersión floral (paso 4) después de 4 semanas o después de que recientemente ha desarrollado un gran número de flores.
    Nota: A diferencia de la etapa de preparación para la primera transformación (paso 1.3.7), no retire la preexistente o en desarrollo silicuas (figura 2) antes de la segunda ronda de la transformación.
  4. Crecer las plantas hasta que las semillas maduran y cosechan semillas en ~ 21 semanas.
  5. Semillas secas durante 2 – 3 semanas a temperatura ambiente en un recipiente hermético con llenan de desecantes (véase Tabla de materiales).

6. selección de transformantes positivo

  1. Planta las semillas de la T1 como se describe para las semillas de tipo salvaje en pasos 1.2 a 1.3.
  2. Crecer las plantas hasta que se convierten las 2 primeras hojas verdaderas, aproximadamente de 10 a 14 días después de la germinación.
  3. Realizar la primera selección para resistencia a los herbicidas (figura 3A y 3B) como se detalla a continuación.
    1. Diluir el herbicida glufosinato-amonio (11.3%) (o BASTA) (tabla 1) para 1:1,000 (v/v). Spray solución diluida BASTA las plantas de semillero y las plantas con bóvedas de la cubierta durante la noche.
    2. BASTA pulverizar 2-3 veces de repetir cada 5 – 7 días.
  4. Realizar la segunda selección mediante una prueba de gota BASTA como se detalla a continuación.
    1. Identificar las plantas que sobreviven después de ser rociada 3-4 veces con solución BASTA. Crecer las plantas para otro 2-3 semanas hasta 3 a 5 hojas desarrollan un área superficial relativamente grande.
    2. Seleccione la hoja madura más grande por planta, frote la superficie de la hoja suavemente con un dedo para eliminar la capa de cera y coloque una gota de la solución diluida BASTA (de paso 6.3.1).
      Nota: Marque la ubicación de la hoja aplicada con la gota BASTA colocando una cinta de papel sobre el tronco más cercano.
    3. Seguimiento de las hojas aplicadas con la gota BASTA para detectar signos de marchitez durante hasta una semana. Seleccionar las plantas con hojas inafectadas por las gotas BASTA.
      Nota: Hojas de las plantas más falsos positivos comienzan a marchitarse dentro de dos días, mientras que hojas de verdaderos positivos están intactas, incluso después de que la gota de la solución BASTA seca (figura 3C).
  5. Confirman positivo transformantes mediante PCR genomic.
    1. Obtener 2-3 hojas de las plantas sobrevivientes al paso 6.4.5.
    2. Extracto de ADN genómico de las hojas utilizando el método CTAB23 o cualquier otro DNA extracción método apropiado.
    3. Realizar PCR utilizando muestras de ADN genómicas extraídas de las plantas, las plantas de tipo salvaje (como controles negativos) y la construcción del plásmido en el paso 3.1 (como control positivo). Utilice un par apropiado de cebadores PCR específicas para el gen marcador selectivo, por ejemplo,, gen BASTA-resistente (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (en adelante) y GTCAACCACTACATCGAGACAA (atrás).
      1. Para los iniciadores de la polimerización en cadena de ejemplo contra el gen bar , utilice las siguientes condiciones PCR: el paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s; seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 ° C por 30 s, recocido a 59 ° C por 30 s y extensión a 72 ° C por 30 s; y la extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.
        Nota: Para asegurar la inserción de la DNA de T toda, se recomienda también realizar genómica polimerización en cadena usando una cartilla PCR del gen marcador selectivo y otra cartilla PCR específica para la secuencia de destino clonados en el vector de transformación de plantas en el paso
    4. Confirmar la presencia del tamaño esperado del producto PCR amplificado bar por gel de agarosa electroforesis17 para las muestras de destino (figura 4A), así como mediante la secuenciación de aislados PCR producto19 usar el mismo procedimiento como en el paso 2.1.

Resultados

Hemos desarrollado un protocolo de transformación que permite recolección de semillas de T0 a 150 días, utilizando un método de inmersión floral modificado de la de a. thaliana. La figura 1 muestra un resumen de la línea de tiempo y S. parvula plantas que representan la etapa óptima para ejecutar la transformación a través de floral dip. Se seleccionaron S. parvula plantas con 70 –80 flores en inflorescencias m...

Discusión

El estado fisiológico de la planta influye significativamente en la eficiencia de transformación25. El uso de plantas sanas y vigorosas para la transformación es un requisito clave para la exitosa transformación en S. parvula. Agua o luz plantas tendrán menos flores en comparación con las plantas saludables ideales para la transformación (figura 1, panel central). Parvula de S. puede crecer en una intensidad de luz inferior a 130 μmol m-...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por un premio de la Fundación Nacional de Ciencias 1616827 de MCB.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWR International, Radnor, PA90000-762Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitaminsSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1019Gamborg’s Vitamin Solution
DesiccantW A Hammond Drierite, Xenia, OH22005Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformationTAIRVector:6531113857pKGWFS7
Electroporation cuvetteUSA Scientific9104-5050Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
ElectroporatorBIO-RAD Laboratories, Hercules, CA1652100MicroPulser Electroporator
Fertilizer beadsOsmocote Garden, Marysville, OHN/AOsmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kitiNtRON Biotechnology, Boston, MA17289MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
GentamicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1914-5GGentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)Bayer environmental science, Montvale, NJN/AFINALE herbicide
KanamycinVWR International, Radnor, PA200004-444Kanamycin monosulfate
MESBioworld, Dublin, OH41320024-2MES, Free Acid
MS saltMP Biomedicals, Santa Anna, CA092621822Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MOB32746-Benzylaminopurine solution
NaClSigma-AlrichS7653Sodium chloride
Non-ionic detergentSigma-Aldrich, St. Louis, MO9005-64-5TWEEN 20 
Plasmid isolation kitZymo Research, Irvine, CAD4036Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kitLife Technology11791-020Gateway LR Clonase II Enzyme mix
RifampicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOR3501-1GRifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubatorThermoFisher Scientific, Waltham, MASHKE4450MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mixSun GroSUN239223328CFLPSun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
SpectinomycinVWR International, Radnor, PAIC15206705
Sterile 50ml conical tubesUSA Scientific, Ocala, FL1500-181150 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
SucroseVWR International, Radnor, PA57-50-1Sucrose, ACS
Surfactant solutionLehle seeds, Round Rock, TXVIS-02Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kitLife Technologies, Carlsbad, CAK240020pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
TryptoneVWR International, Radnor, PA90000-282BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast ExtractVWR International, Radnor, PA90000-722 BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

Referencias

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