Croissance des plantes et la Transformation par Agrobacterium Floral creux de la Extremophyte Schrenkiella parvula

Résumé

La transformation par Agrobacterium en utilisant une méthode floral creux peut être employée avec succès pour créer des lignées transgéniques stables du modèle extremophyte Schrenkiella parvula. Nous présentons un protocole modifié de celui d' Arabidopsis thaliana, compte tenu des habitudes de croissance différent et les caractéristiques physiologiques de l’extremophyte.

Résumé

Schrenkiella parvula est une extremophyte adaptée aux différents stress abiotiques, y compris les multiples contraintes de la toxicité d’ion. Malgré la qualité des ressources génomiques disponibles pour étudier comment les plantes s’adaptent à l’environnement souligne, sa valeur comme un modèle de génomique fonctionnelle et outil ont été limité par l’absence d’un système de transformation possible. Dans ce protocole, nous rapportons comment générer transgéniques stable S. parvula lignes en utilisant une méthode d’immersion à floral par Agrobacterium. Nous avons modifié le protocole de transformation utilisé pour a. thaliana pour tenir compte des caractéristiques uniques du S. parvula, comme une habitude de floraison pour une période indéterminée et une teneur en cires épicuticulaire élevé sur les feuilles. En bref, S. parvula graines ont été stratifiées à 4 ° C pendant cinq jours avant la plantation. Les plantes ont été cultivées à une photopériode d’une lumière de 14 h et 10 h d’obscurité et une 130 µmol m^-2s^-1 intensité lumineuse, à 22 ° C à 24 ° C. Huit à neuf semaines plantes avec plusieurs inflorescences ont été sélectionnés pour la transformation. Ces inflorescences sont trempés dans une solution d’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens GV3101 portant le plasmide pMP90RK . Nous avons effectué deux séries de fleur plongeant avec un intervalle de trois à quatre semaines pour augmenter l’efficacité de la transformation. Les graines de T1 ont été recueillies et séchées pendant quatre semaines dans un récipient avec gel de silice avant la germination pour dépister le candidat transformé lignes. Résistance aux BASTA a été utilisée pour dépister les plantes T1. Nous avons pulvérisé la solution BASTA trois fois avec un intervalle de trois jours à partir de deux semaines centrales pour réduire les faux positifs. Une épreuve de chute BASTA a été réalisée sur la survie des plantes individuelles afin d’identifier les vrais positifs transformants. L’efficacité de la transformation a été 0,033 %, ce qui donne des plantes transgéniques de 3 – 4 10 000 graines T1 propagées.

Introduction

Dans ce protocole, nous décrivons la croissance et la création de lignées transgéniques stables pour le modèle extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilité d’un système efficace de transformation est une caractéristique de n’importe quel modèle génétique polyvalent. Plantes qui se développent dans des environnements extrêmes, mentionné comme extremophytes, fournissent une ressource cruciale pour comprendre les adaptations des plantes aux stress environnementaux. Schrenkiella parvula (anciennement Thellungiella parvula et Eutrema parvula) est un tel modèle extremophyte, avec l’expansion des ressources génomiques^1,2,3,4,5. Toutefois, des protocoles de transformation n'ont pas encore été signalées pour S. parvula études publiées.

Le génome de S. parvula est le premier génome d’extremophyte publiés dans Brassicaceae (famille de la moutarde-chou) et montre une vaste synténie du génome globale avec le modèle non-extremophyte, Arabidopsis thaliana¹. Ainsi, des études comparatives entre a. thaliana et S. parvula pourraient bénéficier de la richesse des études génétiques effectuées sur a. thaliana , faire des hypothèses informatives sur comment le génome de s. parvula a évolué et réglementé différemment pour faire face aux extrêmes environnementaux souligne^5,6,7. S. parvula est une des espèces plus tolérantes au sel (basés sur sol NaCl LD50) parmi les parents sauvages connues d’a. thaliana⁸. En plus de la tolérance de NaCl, S. parvula survit et termine son cycle de vie en présence de plusieurs ions salins à de fortes concentrations de toxiques pour la plupart de plantes⁷. En réponse aux stress abiotiques dans son habitat naturel, il a évolué des traits différents, parmi lesquels plusieurs ont été étudiés à la biochimiques ou physiologiques niveau ^{8,9,10, 11}.

Depuis 2010, ont été plus de 400 publications peer-reveiwed utilisé S. parvula comme espèce cible ou utilisèrent dans une comparaison avec d’autres génomes de plantes. Toutefois, un goulot d’étranglement clair pourrait être identifié avec un examen approfondi de ce type d’études ont été menées. La majorité de ces rapports discute l’utilisation potentielle de S. parvula dans de futures études ou l’utilise dans la génomique comparative ou études de phylogenomic. En raison de l’absence d’un protocole de validation de la transformation établie pour S. parvula, il n’a pas été utilisé dans les études de génomique fonctionnelles, malgré avoir un des plus hautes génomes de plantes de qualité disponibles à ce jour (> 5 Mo contig N50) assemblés et annoté en pseudomolécules au niveau du chromosome¹.

La méthode de la transformation par Agrobacterium floral creux est devenue la méthode la plus largement utilisée pour créer des lignes de trasngenic dans Arabidopsis, et l’élaboration d’un système reproductible de transformation a été un facteur essentiel à son succès comme un modèle génétique^12,13. Cependant, pas toutes les espèces de Brassicaceae ont démontré être transformée avec succès en utilisant la méthode floral creux mis au point pour a. thaliana. Spécialement, les espèces de Brassicaceae Lineage II qui incluent S. parvula a été récalcitrant à floral creux transformation fonction méthodes^14,15.

L’habitude de croissance floraison pour une période indéterminée de S. parvula, combinée à sa morphologie de feuille étroite rend difficile d’adopter la méthode de transformation de floral creux standard par Agrobacterium. Dans cette étude, nous présentons le protocole modifié, que nous avons développé pour transformation reproductible de S. parvula.

Protocole

1. la croissance des plantes

1. Stérilisation des semences (facultative)
   1. Préparer 50 % eau de Javel dans l’eau bidistillée (ddH₂O) avec 1 ou 2 gouttes d’un détergent non ionique (voir Table des matières) dans un tube de 50 mL. Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger la solution.
      Remarque : Il est préférable de procéder à la stérilisation des semences dans un flux laminaire avec une surface stérilisée UV pendant 15 min.
   2. Ajouter la solution d’eau de Javel à ~ 100-200 S. parvula graines dans un tube de 1,5 mL. Bien mélanger et laisser le tube pendant 5 min.
   3. Retirer le tube de l’eau de Javel et ajouter de l’éthanol à 70 %. Laver les graines en pipettant également plusieurs fois et retirez immédiatement la solution d’éthanol.
   4. Lavez les graines dans de l’eau stérilisée pour éliminer l’éthanol et eau de Javel excès, puis enlever l’eau. Répétez cette étape 5 à 6 fois.
2. Stratification des graines
   1. Plonger les graines dans de l’eau stérilisée et stocker pendant 5 à 7 jours à 4 ° C. Vous pouvez aussi semer des graines séchées non stérilisées directement sur le sol humide et placez le plateau de sol de 5 à 7 jours à 4 ° C.
3. La culture de plantes en vue de la transformation
   1. Remplir le sol mélanger (voir Table des matières) dans des pots de 7 x 6 cm² , tremper les pots dans l’eau et pulvériser de l’eau par le haut pour assurer un milieu de croissance uniformément humide. Ajouter 5 – engrais perles (voir Table des matières) sur la surface du sol de chaque pot.
      Remarque : Comme nous l’avons connu, S. parvula pousse bien sur n’importe quel mélange de terre où a. thaliana peut grandir.
   2. À l’aide d’un cure-dent humide, transférer 20 ~ 25 graines par pot sur la surface du sol.
      Remarque : Une commode est recommandé de placer un lot de 4 à 5 graines dans les quatre coins et au centre de la casserole (panneau de gauche dela Figure 1du jour 15,).
   3. Recouvrir le plateau de pot avec un dôme transparent pour garder les graines sous une humidité élevée pendant la germination.
   4. Garder les plateaux de la plante dans une chambre de croissance avec une intensité lumineuse fixé à 130 µmol m⁻² s⁻¹ lumière, température de 22 à 24 ° C et 14 h par jour/10 h par cycle de nuit. Enlevez les dômes après 7-10 jours après la germination. Ajouter de l’eau depuis le fond de la caissette pour garder le sol imbibé de façon uniforme à un niveau souhaitable.
   5. Éliminer les plantules supplémentaires et laisser seulement 4 – 5 plants sains par pot bien séparé de l’autre (Figure 1, jour 15, panneau de droite).
   6. Délicatement, arroser les plantes tous les deux jours et fertiliser avec 0,2 x solution^{16 de Hoagland} une fois toutes les deux semaines.
      Remarque : Garder l’humidité du sol à un niveau uniforme est essentiel à la croissance de S. parvula régulièrement et sainement.
   7. Continuer à cultiver les plantes pour 8 à 10 semaines, jusqu'à ce que plusieurs inflorescences produisent des bourgeons floraux 100 – 150 par plante (Figure 1, jour 60 – 80). Le jour prévu pour la transformation de la base floral creux (étape 4.5), enlever toutes les siliques matures et en développement sur les plantes.

2. l’élément génétique/génomique d’intérêt le clonage dans un vecteur pour la Transformation des plantes

1. Amplifier le fragment d’ADN cible à l’aide de polymerase chain reaction (PCR)¹⁷ et isoler le produit PCR à l’aide d’une gel extraction kit (voir Table des matières) selon le protocole du kit ou toute autre méthode appropriée pour purifier l’ADN à l’aide de gel d’agarose l’électrophorèse^17,18. Vérifier la séquence du produit PCR isolé par le biais de séquençage Sanger¹⁹.
2. Clone le produit PCR désiré dans le vecteur et le transformer la construction clonée dans le compétent e. coli cellules utilisant une topoisomérase clonage clonage kit (voir Table des matières) suite aux directives du fabricant.
3. Répartis 50 µL de produits transformés sur Luria-Bertani milieux de croissance bactérienne avec agar de²⁰ (LB) (tableau 1) avec des antibiotiques appropriés, par ex.., 50 µg / mL spectinomycine (voir Table des matières) et incuber à 37 ° c C pendant la nuit.
4. Le jour suivant, sélectionnez 5 – 10 colonies individuelles, ensemencer un milieu LB liquide avec des antibiotiques appropriés et incuber avec agitant doucement à 37 ° C pendant la nuit.
5. Les plasmides isoler à l’aide d’un isolement de plasmide kit (voir Table des matières) et vérifier par le biais de séquençage Sanger¹⁹ si la séquence cible amplifiée 2.1 est correctement clonée.
6. Transférer le produit PCR cloné et vérifié à un vecteur de destination pour la transformation des plantes compatible avec axée sur la recombinaison de clonage (voir Table des matières), en utilisant un mélange d’enzymes recombinase kit qui suit (voir Table des matières), instructions du fabricant de la trousse. Répétez étape 2.3 à l’étape 2.5 d’isoler et de vérifier les clones hébergeant des constructions de plasmide approprié.

3. comment transformer le vecteur de construire pour la Transformation des plantes Agrobacterium tumefaciens

1. Le plasmide de la construction de vecteur de 2,6 à transformer la souche a. tumefaciens GV3101:pMP90RK²¹, qui recèle un gène de résistance de Rifampicin pour sélection de fond chromosomiques. Utiliser des antibiotiques appropriés, par exemple, gentamycine ou kanamycine (voir Table des matières), pour la sélection d’usine de transformation a construire (plasmide Ti). Un protocole bref pour transformation d’a. tumefaciens par électroporation est inclus dans la section 3.2.
2. A. tumefaciens transformation par électroporation
   1. Décongeler les cellules compétentes d’a. tumefaciens ²² sur la glace. Mix 0,1 et 1 µg du plasmide préparé à partir de 2.6, dissoute dans 1-2 µL de ddH₂O, avec des cellules compétentes sur la glace. Transférer le mélange dans une cupule d’électroporation (voir Table des matières).
   2. Effectuer l’électroporation sur le mélange des plasmides et des cellules capables de 3.2.1, à l’aide d’un électroporateur (voir la Table des matières) suivant les directives du fabricant.
      Remarque : Nettoyer la surface de la cuvette avant de commencer l’électroporation.
   3. Transférer le mélange réactionnel de la cuvette dans un tube de microcentrifuge qui contient 1,5 mL de liquide LB et mélangez bien avec le pipetage et incuber pendant 1 h à 28 ° C sous agitation douce.
3. Ensemencer la transformée a. tumefaciens de section 3.2 sur plaques LB contenant des antibiotiques une sélection appropriée (p. ex. kanamycine 25 µg / mL, la spectinomycine 50 µg / mL, gentamicine 25 µg / mL et rifampicine 50 µg / mL) et incuber à 28 ° C pendant 3 jours.

4. par Agrobacterium Transformation de S. parvula

1. Inoculer le single transformé colonies de plaques dans 10 mL de support liquide LB contenant des antibiotiques (les mêmes qu’en 3.3) dans une conique stérile de 50 mL de tube (voir Table des matières). Incuber pendant 24 h dans un incubateur à agitation (voir Table des matières) à 250 tr/mn à 28 ° C.
2. Transférer la solution bactérienne de 3.4.1 dans un flacon stérile 250 mL, ajouter 40 mL de milieu liquide LB avec des antibiotiques appropriés et incuber pendant 12 heures, jusqu'à ce que la densité optique à une longueur d’onde de 600 nm (OD₆₀₀) atteint environ 2.0.
3. Centrifuger l’a. tumefaciens cultureat 3 100 x g pendant 10 min. retirer le surnageant et remettre en suspension les cultures bactériennes dans 40 mL de solution d’infiltration a. tumefaciens (tableau 1).
4. Diluer l' extrait a. tumefaciens avec une solution d’infiltration pour un final de l’OD₆₀₀ de 0,8. Ajouter 25 µL de solution de surfactant (tableau 1) à 50 mL de dilué a. tumefaciens solution et mélanger en retournant plusieurs fois.
5. Tremper l’inflorescence des plantes dans la solution d’a. tumefaciens préparée dans la section 4.4 à 20 s. utiliser une solution bactérienne fraîche après inflorescence de six pots de trempage. Assurez-vous que toutes les fleurs sont en contact avec la solution. Solutions bactériennes pipette directement sur les fleurs situés dans la partie inférieure de l’inflorescence s’ils ne peuvent pas être plongés dans la solution.
   Remarque : Pour la transformation de la première ronde, assurez-vous d’enlever toutes les siliques matures et en développement, à l’aide d’un scalpel tranchant ou petits ciseaux. Ne pas enlever les siliques si vous effectuez la transformation pour la deuxième fois.

5. soin des plantes après la transformation et la deuxième Transformation

1. Placez les plantes florales-plongé horizontalement dans des plateaux propres avec dômes à couvrir les plantes et les placer dans une pièce sombre croissance pendant 1 à 2 jours.
   Remarque : Garder les fleurs sous humidité élevée est important à ce stade (Figure 1, les plantes après transformation).
2. Retourner les plantes à la verticale et transférer les plantes dans une chambre de croissance avec un 14 h par jour/10 h par cycle nuit, 130 µmol m^-2 s^-1 intensité de la lumière et la température de 22 à 24 ° C.
3. Surveiller les inflorescences plongés dans la semaine suivante. Si un nombre important de fleurs s’interrompt (Figure 2), répétez la trempette florale (étape 4) après environ 4 semaines ou après qu’un grand nombre de fleurs ont récemment mis au point.
   Remarque : Contrairement à l’étape de préparation de la première transformation (étape 1.3.7), ne pas enlever le préexistants ou développer des siliques (Figure 2) avant le second tour de la transformation.
4. Cultiver les plantes jusqu'à ce que les graines mûrissent et récoltent les graines à ~ 21 semaines.
5. Graines sèches pendant 2 – 3 semaines à température ambiante dans une boîte hermétique avec remplis de gel de silice (voir Table des matières).

6. sélection des Transformants positifs

1. Plantez les graines à T1 comme pour le type sauvage de graines dans les étapes 1,2 à 1,3.
2. Cultiver les plantes jusqu'à ce que les 2 premières vraies feuilles développent, environ 10 à 14 jours après la germination.
3. Effectuer une première sélection pour la résistance aux herbicides (Figure 3A et 3 b) comme indiqué ci-dessous.
   1. Diluer l’herbicide glufosinate-ammonium (11,3 %) (ou BASTA) (tableau 1) de 1 : 1 000 (v/v). Vaporiser la solution diluée de BASTA sur les semis et couvrir les plantes avec des coupoles du jour au lendemain.
   2. Répétez BASTA pulvériser 2 à 3 fois tous les 5 – 7 jours.
4. Effectuer la deuxième sélection utilisant un test de BASTA-déposer tel que décrit ci-après.
   1. Identifier les plantes qui survivent après avoir pulvérisé 3 à 4 fois avec la solution BASTA. Cultiver les plantes pour encore 2 à 3 semaines jusqu'à ce que 3 à 5 feuilles développent une surface relativement importante.
   2. Sélectionner la plus grande feuille mature par plante, frotter la surface de la feuille délicatement avec un doigt pour enlever la couche de cire et déposez une goutte de la solution diluée de BASTA (de l’étape 6.3.1).
      Remarque : Marquez l’emplacement de la feuille, appliquée avec la chute BASTA en plaçant une bande de papier sur la tige le plus proche.
   3. Surveiller les feuilles appliquées avec la chute de BASTA pour signes de flétrissement pendant une semaine. Sélectionner les plantes avec feuilles pas affectées par les gouttes BASTA.
      Remarque : Feuilles de plantes plus de faux-positifs commencent à se faner dans les deux jours, tandis que les feuilles de true-positifs sont intactes, même après que la goutte de solution BASTA sèche vers le haut (Figure 3C).
5. Confirmer les transformants positifs par PCR genomic.
   1. Recueillent les 2 – 3 feuilles de plantes survivants à étape 6.4.5.
   2. Extraire l’ADN génomique des feuilles à l’aide de la méthode CTAB²³ ou approprié toute autre méthode d’extraction de l’ADN.
   3. Effectuer la PCR à l’aide d’extraits des échantillons d’ADN génomiques de plantes cibles, les plantes de type sauvage (comme les contrôles négatifs) et la construction plasmidique de l’étape 3.1 (à titre de témoin positif). Utilisez une paire appropriée d’amorces PCR spécifiques au gène marqueur sélectif, par exemple, pour le gène résistant à BASTA (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (avant) et GTCAACCACTACATCGAGACAA (revers).
      1. Pour les amorces PCR exemple ciblant le gène bar , utiliser les conditions suivantes de la PCR : l’étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s ; suivi de 30 cycles de dénaturation à 98 ° C pendant 30 s, recuit à 59 ° C pendant 30 s et s’étendant à 72 ° C pendant 30 s ; et l’extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
         Remarque : Afin d’assurer l’insertion de l’ADN-T ensemble, nous recommandons de procéder aussi génomique PCR utilisant une amorce PCR du gène marqueur sélective et une autre amorce PCR spécifique de la séquence cible cloné à vecteur de transformation de la plante à l’étape
   4. Confirmer la présence de la taille attendue du produit PCR amplifiés bar par agarose gel électrophorèse¹⁷ pour les échantillons de cible (Figure 4A) ainsi que par le produit PCR isolés¹⁹ utilisant le séquençage la même procédure qu’à l’étape 2.1.

Résultats

Nous avons développé un protocole de transformation qui permet la récolte de graines₀ T dans les 150 jours suivant, en utilisant une méthode d’immersion à floral modifiée de celle d’a. thaliana. La figure 1 montre un résumé de la chronologie et les plantes de S. parvula qui représentent le stade optimal pour l’exécution de la transformation par le biais de floral-dip. Nous avons choisi S. parvula plantes a...

Discussion

L’état physiologique de la plante influence significativement l’efficacité de transformation²⁵. L’utilisation de plants sains et vigoureux pour transformation est une condition essentielle pour la réussite de la transformation en S. parvula. L’eau ou lumière des plantes stressées auront moins de fleurs par rapport à l’idéal de transformation (Figure 1, panneau central) des plantes saines. S. parvula peuvent pousser à une intensité ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR International, Radnor, PA	90000-762	Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1019	Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant	W A Hammond Drierite, Xenia, OH	22005	Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation	TAIR	Vector:6531113857	pKGWFS7
Electroporation cuvette	USA Scientific	9104-5050	Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator	BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA	1652100	MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads	Osmocote Garden, Marysville, OH	N/A	Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit	iNtRON Biotechnology, Boston, MA	17289	MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1914-5G	Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)	Bayer environmental science, Montvale, NJ	N/A	FINALE herbicide
Kanamycin	VWR International, Radnor, PA	200004-444	Kanamycin monosulfate
MES	Bioworld, Dublin, OH	41320024-2	MES, Free Acid
MS salt	MP Biomedicals, Santa Anna, CA	092621822	Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B3274	6-Benzylaminopurine solution
NaCl	Sigma-Alrich	S7653	Sodium chloride
Non-ionic detergent	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	9005-64-5	TWEEN 20
Plasmid isolation kit	Zymo Research, Irvine, CA	D4036	Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit	Life Technology	11791-020	Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R3501-1G	Rifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC)
Shaking incubator	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	SHKE4450	MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix	Sun Gro	SUN239223328CFLP	Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin	VWR International, Radnor, PA	IC15206705
Sterile 50 mL conical tubes	USA Scientific, Ocala, FL	1500-1811	50 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose	VWR International, Radnor, PA	57-50-1	Sucrose, ACS
Surfactant solution	Lehle seeds, Round Rock, TX	VIS-02	Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit	Life Technologies, Carlsbad, CA	K240020	pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone	VWR International, Radnor, PA	90000-282	BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract	VWR International, Radnor, PA	90000-722	BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences