Роста и Agrobacterium опосредованной цветочно цинкования трансформации Extremophyte Schrenkiella parvula

Резюме

Agrobacterium опосредованной преобразования с помощью метода цветочные цинкования успешно может использоваться для создания стабильной трансгенных линий модели extremophyte Schrenkiella parvula. Мы представляем протокол изменения от того для Arabidopsis thaliana, учитывая различные роста привычки и физиологические характеристики extremophyte.

Аннотация

Schrenkiella parvula является extremophyte, адаптированных к различным абиотическим стрессам, включая несколько напряжений токсичности ионов. Несмотря на высокое качество геномных ресурсов для изучения, как растения адаптироваться к окружающей среды подчеркивает ее значение как модель функциональной геномики, и средство было ограничено отсутствием возможности трансформации системы. В этом протоколе, мы приводим как генерировать стабильные трансгенных S. parvula линий, с помощью метода Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования. Мы изменили преобразования протокол, используемый для A. thaliana отчитаться за уникальные черты S. parvula, как неопределенный цветения привычку и содержанием высокого epicuticular воска на листьях. Вкратце S. parvula семена были стратифицированы на 4 ° C за 5 дней до посадки. Растения выращивались на Фотопериод свет 14 h и 10 h темно и 130 мкмоль м^-2s^-1 интенсивности света, при 22 ° C до 24 ° C. Восьми до девяти недельных растений с несколькими соцветий были выбраны для преобразования. Эти соцветий были ближнего в проникновения раствора Agrobacterium tumefaciens GV3101 проведение pMP90RK плазмиды. Мы провели два раунда цветок погружения с интервалом в три-четыре недели для повышения эффективности преобразования. T1 семена были собраны и сушат в течение четырех недель в контейнере с осушители до прорастания экран для кандидата преобразовать линии. Сопротивление BASTA был использован для экрана T1 растений. Мы распылять раствор БАСТА три раза с интервалом в три дня, начиная с двух недельных растений для уменьшения ложных срабатываний. Испытание на падение BASTA была выполнена на сохранившихся отдельных растений, чтобы определить истинный положительный трансформантов. Эффективность преобразования был 0,033%, уступая трансгенных растений 3-4 на 10 000 T1 семена распространяются.

Введение

В этом протоколе мы описываем, рост и создание стабильных трансгенных линий для модели extremophyte Schrenkiella parvula. Отличительной чертой любой универсальный генетический модели является наличие эффективной трансформации системы. Растения, которые процветают в экстремальных условиях, упоминаемый как extremophytes, обеспечивают жизненно важным ресурсом для понимания адаптации растений к экологическим стрессам. Schrenkiella parvula (ранее Thellungiella parvula и Eutrema parvulum) является одной из таких моделей extremophyte, с расширением геномных ресурсов^1,2,3,4,5. Однако протоколы преобразования не пока не поступало для S. parvula в опубликованных исследованиях.

Геном S. parvula Геном первой опубликованной extremophyte в капустные (горчица капуста семьи) и показывает обширную общую генома synteny с не extremophyte модель, Arabidopsis thaliana¹. Таким образом сравнительные исследования между A. thaliana и S. parvula выиграют от богатства генетических исследований, выполненных на A. thaliana сделать информативный гипотез о как развивалась и регулируется геном S. parvula по-разному справиться с экстремальных экологических подчеркивает^5,6,7. S. parvula является одним из наиболее солевыносливых видов (основанный на почве NaCl LD50) среди известных диких сородичей A. thaliana⁸. В дополнение к терпимости NaCl S. parvula выживает и завершает свой жизненный цикл в присутствии нескольких соли ионов при высоких концентрациях токсичен для большинства растений⁷. В ответ к абиотическим стрессам, распространенных в своей естественной среде обитания она развивалась различные черты, среди которых несколько учился в биохимических и физиологических уровня ^{8,9,10, 11}.

С 2010 года были более 400 публикаций сверстников reveiwed, которые использованы S. parvula как вид целевого или использовать его в сравнении с другими геномов растений. Однако ясно узким местом может быть отождествлен с пристальный взгляд какой тип исследований были проведены. Большинство этих сообщений обсуждают потенциальное использование S. parvula в будущих исследованиях или использовать его в сравнительной геномной или phylogenomic исследований. Из-за отсутствия доказательства в концепция преобразования протокола создана для S. parvula, он не был использован в функциональных геномных исследований, несмотря на то, что один из высокого качества завода геномов имеющейся на сегодняшний день (> 5 МБ contig N50) собрал и заметки в pseudomolecules хромосомы уровня¹.

Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования преобразования метод стал наиболее широко используемым методом для создания trasngenic линий в A. thalianaи развитие воспроизводимые системы трансформации было решающим фактором ее успеха как генетическая модель^12,13. Однако не все виды капустные было показано, быть успешно преобразованы с помощью метода цветочные цинкования, разработанные для A. thaliana. Специально капустные Lineage II виды, которые включают S. parvula был непокорным цветочные цинкования на основе преобразования методов^14,15.

Привычка роста неопределенного цветения S. parvula, в сочетании с его узкие листья морфология сделала сложно принять стандартный Agrobacterium опосредованной цветочные цинкования трансформации метода. В этом исследовании мы приводим измененный Протокол, который мы разработали для воспроизводимых трансформации S. parvula.

протокол

1. завод рост

1. Семя стерилизации (опционально)
   1. Подготовка 50% отбеливатель в двойной дистиллированной воды (ddH₂O) с 1 или 2 капли неионных моющего средства (см. Таблицу материалы) в 50 мл трубки. Инвертируйте трубке несколько раз перемешать раствор.
      Примечание: Он является предпочтительным для проведения стерилизации семян в поток Ламинарный шкаф с поверхностью УФ стерилизовать 15 мин.
   2. Добавить раствор отбеливателя в ~ 100 – 200 S. parvula семена в 1,5 мл. Тщательно перемешать и пусть трубе сидеть в течение 5 мин.
   3. Удалите отбеливатель из трубки и добавить на 70% спирте. Вымойте семена, закупорить несколько раз и затем немедленно удалить этанола раствор.
   4. Вымойте семена в стерилизованные водой, чтобы удалить избыток отбеливателя и этанола, а затем удалите воду. Повторите этот шаг 5-6 раз.
2. Стратификация семян
   1. Погружать семена в стерилизованные воды и хранить для 5-7 дней при 4 ° C. Кроме того сушеные нестерилизованных семена непосредственно на влажную почву и место почвы лоток для 5-7 дней при 4 ° C.
3. Выращивание растений в подготовке трансформации
   1. Заливки почвы mix (см. Таблицу материалы) в 7 x 6 см² кастрюли, Замочите горшки в воду и брызги воды сверху для обеспечения роста равномерно влажной среде. Добавьте 5 – удобрение бусины (см. Таблицу материалы) на поверхности почвы каждого банка.
      Примечание: Насколько мы испытали, S. parvula растет на любой почвенной смеси, где A. thaliana может расти.
   2. С помощью мокрой зубочисткой, передачи 20 ~ 25 семян на горшок на поверхности почвы.
      Примечание: Удобный рекомендуется помещать пакет 4 – 5 семян в четырех углах и центр горшок (рис. 1, 15 день, левая панель).
   3. Обложка кастрюлю лоток с прозрачный купол сохранить семена при высокой влажности во время прорастания.
   4. Держите растение лотков в камере роста с интенсивностью освещения на 130 мкмоль m⁻² s⁻¹ света, 22 – 24 ° C температура и 14 часа в день/10 h за ночь цикл. После 7-10 дней после прорастания, удалите куполов. Добавьте воду из нижней части лотка держать почвы увлажняется равномерно на желательный уровень.
   5. Отсеять дополнительных саженцев и оставить только 4-5 здоровых саженцев на горшок, хорошо отделены друг от друга (рис. 1, день 15, справа).
   6. Аккуратно поливать растения каждые два дня и удобрять с 0,2 x Хоугланд решение¹⁶ раз в две недели.
      Примечание: Сохраняя влажности почвы на единообразный уровень является ключом для выращивания S. parvula , последовательно и здорово.
   7. Продолжать расти растения для 8-10 недель, пока несколько соцветий производят 100 – 150 цветочные бутоны на заводе (рис. 1, день 60-80). В день, запланированных на основе преобразования цветочные цинкования (шаг 4.5) удалите все Зрелые и развивающиеся siliques из растений.

2. клонирование гена/геномной элемент интерес в вектор трансформации растений

1. Усилить целевой фрагмент ДНК, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)¹⁷ и изолировать ПЦР продукта с помощью извлечения геля комплекта (см. Таблицу материалы) согласно комплект протокола или любой другой соответствующий метод для того чтобы очистить с помощью геля агарозы дна электрофорез^17,18. Проверьте последовательность изолированных ПЦР продукта через Сэнгер последовательности¹⁹.
2. Клон, желаемый продукт PCR клонирования вектор и преобразование, клонированные конструкции в сведущее Escherichia coli клеток с помощью топоизомеразы based клонирование комплекта (см. Таблицу материалы) после рекомендации производителя.
3. Распространения 50 мкл преобразованные продуктов на Лурия Бертани²⁰ (LB) агар бактериальных питательных сред (Таблица 1) с соответствующие антибиотики, например., 50 мкг / мл спектиномицин (см. Таблицу материалы) и Инкубируйте на 37 ° C на ночь.
4. На следующий день, выберите один колоний 5 – 10, прививать в жидкой среде LB с соответствующие антибиотики и проинкубируйте с нежным тряску при 37 ° C ночь.
5. Изолировать плазмид, используя плазмида изоляции комплекта (см. Таблицу материалы) и проверить через Сэнгер последовательности¹⁹ ли последовательности целевых объектов, усиленный в 2.1 правильно клонируются.
6. Перевод продукта PCR клонирования и проверенной назначения вектор трансформации растений совместим с рекомбинацией based клонирование (см. Таблицу материалы), используя сочетание фермента рекомбиназа комплект следующее (см. Таблицу материалы), Инструкция комплект Производитель. Повторите шаг 2.3 шаг 2,5 изолировать и проверить клоны, укрывательство надлежащего плазмидные конструкции.

3. преобразование векторных построить завод преобразования в Agrobacterium tumefaciens

1. Трансформировать плазмидные конструкции вектора от 2.6 в A. tumefaciens штамм GV3101:pMP90RK²¹, который затаивает рифампицин сопротивления ген для отбора хромосомных фона. Использовать соответствующие антибиотики, например, гентамицина или канамицин (см. Таблицу материалы), для подбора растений преобразования построить (Ti плазмида). Краткий протокол для преобразования A. tumefaciens через электропорации входит в раздел 3.2.
2. A. tumefaciens преобразование Электропорация
   1. Оттепель в A. tumefaciens сведущие клетки²² на льду. Mix 0,1-1 мкг плазмида, приготовленный из 2.6, растворенного в 1-2 мкл ddH₂O, с компетентным ячеек на льду. Передача смеси в кювет электропорации (см. Таблицу материалы).
   2. Выполните электропорации на смесь плазмидов и сведущие клетки от 3.2.1, используя electroporator (см. Таблицу материалы) после рекомендации производителя.
      Примечание: Чистота поверхности кювета перед началом электропорации.
   3. Передавать реакционную смесь из кювета microcentrifuge трубку, содержащую 1,5 мл жидкого фунтов и хорошо перемешать с закупорить и инкубировать 1 час на 28 ° C с нежным встряхивания.
3. Прививать преобразованные A. tumefaciens из раздела 3.2 на тарелках LB, содержащий соответствующий выбор антибиотиков (например канамицин 25 мкг / мл, спектиномицин 50 мкг / мл, гентамицина 25 мкг / мл и рифампицин 50 мкг / мл) и Инкубируйте на 28 ° C в течение 3 дней.

4. при посредничестве Agrobacterium преобразование S. parvula

1. Прививать сингл превратил колонии от пластин в 10 мл LB жидких сред, содержащих антибиотики (так же, как и 3.3) в стерильных 50 мл Конические трубки (см. Таблицу материалы). Проинкубируйте 24 ч в тряску инкубатора (см. Таблицу материалы) на 250 r.p.m. 28 ° c.
2. Передавать бактериальных решение от 3.4.1 флакон 250 мл стерильного, добавить 40 мл жидких сред LB с соответствующие антибиотики и инкубировать 12 h до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 600 Нм (₆₀₀OD) достигает около 2.0.
3. Центрифуга A. tumefaciens cultureat 3100 x g 10 мин удалить супернатант и вновь приостановить бактериальной культуры в 40 мл раствора инфильтрации A. tumefaciens (Таблица 1).
4. Развести ресуспензированы A. tumefaciens раствором проникновения до окончательного ОД₆₀₀ 0,8. Добавить 25 мкл раствора поверхностно-активных веществ (Таблица 1) 50 мл разбавленной A. tumefaciens решения и микс от переворачивать несколько раз.
5. Окуните соцветие растений в A. tumefaciens раствор, приготовленный в разделе 4.4 для 20 s. использование свежих бактериальных решение после погружения соцветия из шести горшки. Убедитесь, что все цветы соприкасаются решение. Накапайте бактериальных решения непосредственно на цветы, расположенный в нижней части соцветие, если они не могут быть погружается в решение.
   Примечание: Для преобразования первого раунда не забудьте удалить все Зрелые и развивающиеся siliques, используя острый скальпель или маленькие ножницы. Не удаляйте siliques, если выполнение преобразования во второй раз.

5. После преобразования завод уход и второй преобразования

1. Поместите растения, цветочные, смоченной горизонтально в чистые подносы с купола для покрытия растений и место в комнате темно роста на 1 – 2 дней.
   Примечание: Сохранение цветов при высокой влажности имеет важное значение на данном этапе (рис. 1, растения после преобразования).
2. Возвращение растения в вертикальном положении и передачи растения к роста комнате с 14 ч в день/10 h за ночь цикла, 130 мкмоль м^-2 s^-1 интенсивности света и 22-24 ° C температуры.
3. Контролировать Ближний соцветия на следующей неделе. Если значительное количество цветов прервать (рис. 2), повторите цветочные dip (шаг 4) после 4 недель или после того, как недавно разработали большое количество цветов.
   Примечание: В отличие от подготовки шаг для первого преобразования (шаг 1.3.7) не удаляйте до второго раунда трансформации существующих или разработки siliques (рис. 2).
4. Растут растения, до тех пор, пока семена созревать и урожай семян на ~ 21 недель.
5. Сухие семена для 2-3 недель при комнатной температуре в герметичном контейнере с заполнены с осушители (см. Таблицу материалы).

6. Выбор положительных трансформантов

1. T1 семена растений, как описано для семена дикого типа шагов 1.2 к 1.3.
2. Растут растения, до тех пор, пока первые 2 истинный листья развиваться, примерно 10-14 дней после прорастания.
3. Выполните первый выбор для гербицидов сопротивления (рис. 3A и 3B) как описано ниже.
   1. Разбавить гербициду глюфосинату аммония (11,3%) (или БАСТА) (Таблица 1) до 1:1,000 (v/v). Spray разбавленный раствор БАСТА на рассаду и покрывают растения с куполами на ночь.
   2. Повторите БАСТА, опрыскивание 2 – 3 раза каждые 5 – 7 дней.
4. Выполните второй выбор, с помощью БАСТА падение теста, как описано ниже.
   1. Определите растения, которые выживают после распыляется 3 – 4 раза раствором BASTA. Растут растения еще 2-3 недель до 3-5 листьев развиваться сравнительно большой площадью поверхности.
   2. Выберите крупнейший зрелых листьев на завод, руб поверхности листа нежно с пальцем, чтобы удалить слой воска и место капля разбавленного раствора BASTA (от шага 6.3.1).
      Примечание: Марк расположение листьев, применяется с падение БАСТА, поместив бумажной ленты на оси ближайшего.
   3. Следить за листья, применяется с БАСТА падение признаков увядания до одной недели. Выберите растения с листьями, затронутые БАСТА капли.
      Примечание: Листья от наиболее ложно положительных растений начинают вянуть в течение двух дней, в то время как листья от true срабатываний нетронутыми, даже после того, как капля раствора БАСТА сушит вверх (рис. 3C).
5. Подтверждают положительные трансформантов с использованием геномной ПЦР.
   1. Собирают листья 2 – 3 от живых растений на шаге 6.4.5.
   2. Извлечь геномной ДНК из листьев с помощью метода CTAB²³ или любой другой соответствующий метод экстракции ДНК.
   3. Выполняйте PCR используя извлеченные геномной ДНК образцов из целевых установок, одичал тип растения (как негативный контроль) и плазмидные конструкции от шаг 3.1 (как позитивный элемент управления). Используйте соответствующие пары праймеров PCR, специфичные для селективного маркер гена, например, для БАСТА устойчивостью генов (бар), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (вперед) и GTCAACCACTACATCGAGACAA (реверс).
      1. Для примера праймеры PCR ориентации бар Джин, используйте следующие условия PCR: первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 30 сек; После 30 циклов денатурации на 98 ° C за 30 сек, отжиг на 59 ° C за 30 s и расширение в 72 ° C для 30 s; и окончательное расширение при 72 ° C за 5 мин.
         Примечание: Чтобы обеспечить включение всей T-ДНК, мы рекомендуем также геномной PCR используя PCR праймер от селективного маркер гена и другой PCR праймер для целевого объекта последовательности клонируются вектора трансформации растений на шаге
   4. Подтвердить наличие ожидаемого размера продукта PCR усиливается бар геля агарозы электрофорез¹⁷ для целевых выборок (рис. 4A), а также секвенирование изолированных ПЦР продукта¹⁹ с помощью та же процедура, как и шаг 2.1.

Результаты

Мы разработали протокол преобразования, позволяющий заготовки T₀ семян в течение 150 дней, с помощью метода цветочные цинкования изменения от того для A. thaliana. Рисунок 1 показывает резюме timeline и S. parvula растений, которые представляют собой оп...

Обсуждение

Физиологическое состояние растений значительно влияет на эффективность преобразования²⁵. Использование растений, здоровым и энергичным для трансформации является одним из ключевых требований для успешной трансформации в S. parvula. Воды или света подчеркнул растений бу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR International, Radnor, PA	90000-762	Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1019	Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant	W A Hammond Drierite, Xenia, OH	22005	Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation	TAIR	Vector:6531113857	pKGWFS7
Electroporation cuvette	USA Scientific	9104-5050	Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator	BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA	1652100	MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads	Osmocote Garden, Marysville, OH	N/A	Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit	iNtRON Biotechnology, Boston, MA	17289	MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1914-5G	Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)	Bayer environmental science, Montvale, NJ	N/A	FINALE herbicide
Kanamycin	VWR International, Radnor, PA	200004-444	Kanamycin monosulfate
MES	Bioworld, Dublin, OH	41320024-2	MES, Free Acid
MS salt	MP Biomedicals, Santa Anna, CA	092621822	Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B3274	6-Benzylaminopurine solution
NaCl	Sigma-Alrich	S7653	Sodium chloride
Non-ionic detergent	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	9005-64-5	TWEEN 20
Plasmid isolation kit	Zymo Research, Irvine, CA	D4036	Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit	Life Technology	11791-020	Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R3501-1G	Rifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC)
Shaking incubator	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	SHKE4450	MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix	Sun Gro	SUN239223328CFLP	Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin	VWR International, Radnor, PA	IC15206705
Sterile 50 mL conical tubes	USA Scientific, Ocala, FL	1500-1811	50 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose	VWR International, Radnor, PA	57-50-1	Sucrose, ACS
Surfactant solution	Lehle seeds, Round Rock, TX	VIS-02	Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit	Life Technologies, Carlsbad, CA	K240020	pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone	VWR International, Radnor, PA	90000-282	BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract	VWR International, Radnor, PA	90000-722	BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences