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Resumo

Transformação mediada por Agrobacterium, usando um método de imersão floral pode ser empregada com sucesso para criar linhas transgênicas estáveis do modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Apresentamos um protocolo modificado do que para a Arabidopsis thaliana, considerando o crescimento de diferentes hábitos e características fisiológicas do extremophyte.

Resumo

Schrenkiella parvula é uma extremophyte adaptada a vários estresses abióticos, incluindo várias tensões de toxicidade do íon. Apesar da alta qualidade genômicos recursos disponíveis estudar como as plantas se adaptam ao meio ambiente salienta, seu valor como um modelo de genômica funcional e ferramenta tem sido limitada pela falta de um sistema de transformação praticável. Neste protocolo, relatamos como gerar transgénicos estável S. parvula linhas usando um método de imersão floral mediada por Agrobacterium. Nós modificamos o protocolo de transformação utilizado para a. thaliana para contabilizar características únicas de S. parvula, como um hábito de florescimento indeterminado e um teor de ceras epicuticulares alta nas folhas. Brevemente, S. parvula sementes foram estratificadas em 4 ° C por cinco dias antes do plantio. As plantas foram cultivadas em um fotoperíodo de uma luz de 14 h e 10 h escuro e uma 130 µmol m-2s-1 intensidade luminosa, a 22 ° C a 24 ° C. Oito a nove semanas plantas com várias inflorescências foram selecionados para a transformação. Estas inflorescências foram mergulhadas em uma solução de infiltração de Agrobacterium tumefaciens GV3101 carregando o plasmídeo pMP90RK . Foram realizadas duas rodadas de flor mergulhando com um intervalo de três a quatro semanas para aumentar a eficiência de transformação. As sementes de T1 foram coletadas e secas por quatro semanas em um recipiente com dessecantes antes de germinação a tela para o candidato transformado linhas. Resistência à BASTA foi usada para plantas T1 de tela. Atingimos a solução BASTA três vezes com um intervalo de três dias, começando com duas semanas de plantas para reduzir falsos positivos. Um teste de gota BASTA foi realizado em sobreviver plantas individuais para identificar o verdadeiro transformants positivo. A eficiência de transformação foi 0.033%, rendendo 3 – 4 plantas transgénicas por 10.000 sementes de T1 propagadas.

Introdução

Neste protocolo, descrevemos o crescimento e a criação de linhas transgênicas estáveis para o modelo extremophyte Schrenkiella parvula. A disponibilidade de um sistema eficiente de transformação é uma marca registrada de qualquer modelo genético versátil. Plantas que prosperam em ambientes extremos, referido como extremophytes, fornecem um recurso crítico para compreender as adaptações de plantas a estresses ambientais. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula e Eutrema parvulum) é um tal modelo de extremophyte, com a expansão de recursos genômicos1,2,3,4,5. No entanto, os protocolos de transformação não ainda foram relatados para S. parvula em estudos publicados.

O genoma de S. parvula é o primeiro genoma de extremophyte publicado em Brassicaceae (repolho mostarda família) e mostra uma extensa synteny geral do genoma com o modelo de não-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Assim, estudos comparativos entre a. thaliana e S. parvula poderiam se beneficiar da riqueza dos estudos genéticos realizado na a. thaliana tornar informativos hipóteses sobre como o genoma de s. parvula evoluiu e regulamentada forma diferente para lidar com extrema ambiental salienta5,6,7. S. parvula é uma das espécies mais tolerante a sal (baseadas no solo NaCl LD50) entre parentes silvestres conhecidos da . thaliana8. Além da tolerância de NaCl, S. parvula sobrevive e completa seu ciclo de vida na presença de vários íons de sal em altas concentrações tóxicas para a maioria das plantas7. Em resposta às estresses abióticos prevalentes em seu habitat natural, evoluiu várias características, entre os quais vários têm sido estudados com a bioquímica ou fisiológica nível 8,9,10, 11.

Desde 2010, foram mais de 400 publicações peer-reveiwed que usou S. parvula como espécie-alvo ou usado em uma comparação com outras genomas de planta. No entanto, um gargalo claro poderia ser identificado com um olhar mais atento de que tipo de estudos têm sido realizados. A maioria destes relatórios discutir o potencial de uso dos S. parvula em estudos futuros, ou usá-lo em Genômica comparativa ou estudos filogenéticas. Devido à falta de um protocolo de transformação de prova de conceito estabelecido para S. parvula, ela não tem sido usada em estudos de genômicos funcionais, apesar de ter um dos genomas de planta mais alta qualidade disponíveis até à data (> 5 Mb contig N50) montado e anotados em pseudomolecules cromossomo-nível1.

O método de transformação mediada por Agrobacterium de floral-mergulho tornou-se o método mais amplamente utilizado para criar linhas de trasngenic na . thaliana, e o desenvolvimento de um sistema reprodutível da transformação foi um fator crítico de seu sucesso como um modelo genético12,13. No entanto, nem todas as espécies de Brassicaceae foram mostradas para ser com êxito transformada usando o método de imersão floral desenvolvido pela . thaliana. Especialmente, as espécies de Brassicaceae Lineage II que incluem S. parvula tem sido recalcitrantes a transformação com base floral-mergulho métodos14,15.

O hábito de crescimento indeterminado floração de S. parvula, combinada com sua morfologia de folhas estreitas tornou desafiador para adotar o método de transformação de floral-mergulho padrão mediada por Agrobacterium. Neste estudo, nós relatamos o protocolo modificado que desenvolvemos para transformação reprodutível de S. parvula.

Protocolo

1. crescimento da planta

  1. Esterilização de sementes (opcional)
    1. Prepare-se 50% de lixívia em água bidestilada (ddH2O) com 1 ou 2 gotas de um detergente não-iônico (ver Tabela de materiais) em um tubo de 50 mL. Inverta o tubo várias vezes para misturar a solução.
      Nota: É preferível realizar a esterilização de sementes em um fluxo laminar com uma superfície esterilizada UV durante 15 minutos.
    2. Adicionar a solução de lixívia a ~ 100-200 S. parvula sementes em um tubo de 1,5 mL. Misture bem e deixe o tubo descansar por 5 min.
    3. Remover o descorante do tubo e adicionar etanol a 70%. Lave as sementes pipetando várias vezes e em seguida, retire imediatamente a solução de etanol.
    4. Lave as sementes em água esterilizada para remover etanol e água sanitária em excesso e, em seguida, retire a água. Repita essa etapa 5 a 6 vezes.
  2. Estratificação de sementes
    1. Mergulhe as sementes em água esterilizada e armazenar durante 5 a 7 dias a 4 ° C. Alternativamente, semear sementes secas esterilizadas, diretamente no solo úmido e coloque a bandeja de solo por 5 a 7 dias a 4 ° C.
  3. Cultivo de plantas na preparação de transformação
    1. Preencher o solo misturar (ver Tabela de materiais) em potes de2 7 x 6 cm, mergulhe os potes de água e pulverizar a água da parte superior para assegurar um meio de crescimento uniformemente molhado. Adicione 5 – fertilizante grânulos (ver Tabela de materiais) na superfície do solo de cada pote.
      Nota: Tanto quanto vivemos, S. parvula cresce bem em qualquer mistura de solo onde a. thaliana pode crescer.
    2. Usando um palito de dente molhado, transferir 20 ~ 25 sementes por vaso na superfície do solo.
      Nota: Uma prática conveniente é colocar um lote de 4-5 sementes nos quatro cantos e o centro do pote (Figura 1, dia 15, painel esquerdo).
    3. Cubra a bandeja do pote com uma cúpula clara para manter as sementes sob alta umidade durante a germinação.
    4. Mantenha as bandejas de planta em uma câmara de crescimento com uma intensidade de luz em 130 µmol m− 2 s− 1 luz, temperatura de 22 a 24 ° C e 14 h por dia/10 h por ciclo de noite. Remova as cúpulas após 7-10 dias após a germinação. Adicione a água do fundo da bandeja para manter o solo umedecido uniformemente em um nível desejável.
    5. Eliminar mudas extras e deixar apenas 4-5 saudável mudas por vaso bem separado umas das outras (Figura 1, dia 15, painel direito).
    6. Delicadamente, regar as plantas a cada dois dias e fertilizar com 0.2 x de solução de Hoagland16 uma vez a cada duas semanas.
      Nota: Manter a umidade do solo em um nível uniforme é chave para crescimento S. parvula consistentemente e de forma saudável.
    7. Continuam a crescer as plantas durante 8-10 semanas até várias inflorescências produzem botões florais de 100 – 150 por planta (Figura 1, dia 60-80). No dia planejado para a transformação com base floral-mergulho (etapa 4.5), remova todos os siliques maduros e em desenvolvimento das plantas.

2. clonagem do Gene/genômica elemento de interesse em um vetor para transformação de planta

  1. Amplificar o fragmento de DNA alvo usando o polymerase reação em cadeia (PCR)17 e isolar o produto do PCR usando uma gel de extração kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com o protocolo do kit ou qualquer outro método adequado para purificar DNA utilizando gel de agarose eletroforese de17,18. Verifique se a sequência do produto do PCR isolada através de de sequenciamento Sanger19.
  2. Clone o produto desejado de PCR para o vetor clonagem e transformar a construção clonada para o competente Escherichia coli células usando uma clonagem baseada em topoisomerase kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante.
  3. Espalhe 50 µ l de produtos transformados em20 (LB) Luria-Bertani media ágar crescimento bacteriano (tabela 1) com antibióticos adequados, ex., 50 µ g / mL espectinomicina (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C durante a noite.
  4. No dia seguinte, selecionar colônias única de 5 – 10, inocular em meio líquido de LB com antibióticos apropriados e incubar com agitação suave a 37 ° C durante a noite.
  5. Plasmídeos isolados usando um isolamento de plasmídeo kit (veja a Tabela de materiais) e verificar através de de sequenciamento Sanger19 se a sequência do alvo amplificada em 2.1 é adequadamente clonada.
  6. Transferir o produto PCR clonado e verificado a um vetor de destino para a transformação da planta compatível com baseados na recombinação clonagem (ver Tabela de materiais), usando uma mistura de enzima recombinase kit seguinte (ver Tabela de materiais), instruções do fabricante kit. Repita da etapa 2.3 para etapa 2.5 para isolar e verificar clones abrigar construções de plasmídeo adequado.

3. transformando construir o vetor para transformação da planta em Agrobacterium tumefaciens

  1. Transforme o plasmídeo da construção de vetor de 2.6 para a cepa da . tumefaciens GV3101:pMP90RK21, que abriga um gene de resistência a rifampicina para seleção de fundo cromossômico. Usar antibióticos apropriados, por exemplo, gentamicina ou canamicina (ver Tabela de materiais), para a seleção de planta transformação construir (plasmídeo Ti). Um protocolo breve para transformação da . tumefaciens através de electroporation está incluído na seção 3.2.
  2. A. tumefaciens transformação por eletroporação
    1. Descongele a . tumefaciens células competentes22 no gelo. Mix de 0,1 – 1 µ g do plasmídeo preparado a partir de 2.6, dissolvido em 1-2 µ l de DDQ2O, com células competentes no gelo. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação (ver Tabela de materiais).
    2. Executar electroporation sobre a mistura de plasmídeos e células competentes de 3.2.1, usando um electroporator (ver Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante.
      Nota: Limpe a superfície da cubeta antes de iniciar a eletroporação.
    3. Transfira a mistura de reação da cubeta para um tubo de microcentrifugadora que contém 1,5 mL de LB líquido e misture bem com a pipetagem e incubar durante 1 h a 28 ° C, com agitação suave.
  3. Inocular o transformado a. tumefaciens da seção 3.2 LB placas contendo antibióticos seleção apropriada (por exemplo, canamicina 25 µ g / mL, espectinomicina 50 µ g / mL, gentamicina 25 µ g / mL e rifampicina 50 µ g / mL) e incubar a 28 ° C durante 3 dias.

4. mediada por Agrobacterium transformação de S. parvula

  1. Inocular o single transformado colônias de placas em 10 mL de LB mídia líquida contendo antibióticos (as mesmas 3.3) em uma estéril 50 mL cónica do tubo (ver Tabela de materiais). Incubar durante 24 h em uma tremendo incubadora (ver Tabela de materiais) em 250 r.p.m. a 28 ° C.
  2. Transferir a solução bacteriana de 3.4.1 num estéril 250 mL, adicionar 40 mL de meio líquido LB com antibióticos apropriados e incubar 12 h até a densidade óptica em 600 nm comprimento de onda (OD600) atinge cerca de 2.0.
  3. Centrifugue a . tumefaciens cultureat 3.100 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender a cultura bacteriana em 40 mL de solução de infiltração da . tumefaciens (tabela 1).
  4. Dilua a ressuspensão a. tumefaciens com solução de infiltração para um final OD600 de 0,8. Adicione 25 µ l da solução de surfactante (tabela 1) a 50 mL de diluídos a. tumefaciens solução e mistura várias vezes por inversão.
  5. Mergulhe a inflorescência das plantas na solução a. tumefaciens preparada na seção 4.4 para 20 s. uso uma solução bacteriana fresca após mergulhar a inflorescência de seis potes. Certifique-se de todas as flores estão em contacto com a solução. Soluções bacterianas Pipetar diretamente sobre flores, localizadas na parte inferior da inflorescência, se eles não podem ser mergulhados em solução.
    Nota: Para a transformação da primeira rodada, certifique-se de remover todos os siliques maduros e em desenvolvimento, usando um bisturi afiado ou tesouras pequenas. Não remova siliques se realizando a transformação pela segunda vez.

5. pós-transformação planta cuidados e a segunda transformação

  1. Coloque as plantas florais-mergulhado na horizontal em bandejas limpas com cúpulas para cobrir as plantas e colocar em um quarto escuro de crescimento por 1 – 2 dias.
    Nota: Mantendo as flores sob alta umidade é importante nesta fase (Figura 1, as plantas depois da transformação).
  2. Retorno as plantas para uma posição ereta e transferir as plantas para uma sala de crescimento com 14 h por dia/10 h por ciclo de noite, 130 µmol m-2 s-1 intensidade luminosa e temperatura de 22 a 24 ° C.
  3. Monitore as inflorescências mergulhadas na semana seguinte. Se um número significativo de flores abortar (Figura 2), repeti o mergulho floral (etapa 4) após cerca de 4 semanas ou depois de um grande número de flores recém desenvolvido.
    Nota: Ao contrário da etapa de preparação para a primeira transformação (etapa 1.3.7), não remova pre-existentes ou desenvolver siliques (Figura 2) antes da segunda rodada de transformação.
  4. Crescem as plantas até que as sementes maduras e colhem sementes em ~ 21 semanas.
  5. Sementes secas por 2 – 3 semanas à temperatura ambiente em um recipiente hermético com cheio de dessecantes (ver Tabela de materiais).

6. seleção de Transformants positivo

  1. Plante as sementes de T1, conforme descrito para as sementes de tipo selvagem em passos de 1.2 a 1.3.
  2. Crescem as plantas até desenvolvem as 2 primeiras folhas verdadeiras, cerca de 10 a 14 dias após a germinação.
  3. Realize a primeira seleção para resistência a herbicida (Figura 3A e 3B) como detalhado abaixo.
    1. Diluir o herbicida glufosinato-amônio (11,3%) (ou BASTA) (tabela 1) para 1:1,000 (v/v). Pulverizar a solução diluída BASTA sobre as mudas e cobrir as plantas com cúpulas durante a noite.
    2. Repita BASTA pulverizar a 2-3 vezes a cada 5 a 7 dias.
  4. Realize a segunda seleção usando um teste BASTA soltar conforme detalhado abaixo.
    1. Identifica as plantas que sobrevivem após ser aplicado 3 a 4 vezes com solução BASTA. Crescem as plantas por mais 2-3 semanas até 3-5 folhas desenvolvem uma área de superfície relativamente grande.
    2. Selecione a maior folha madura por planta, friccione a superfície da folha suavemente com um dedo para remover a camada de cera e coloque uma gota de solução diluída BASTA (da etapa 6.3.1).
      Nota: Marca a localização da folha aplicada com a gota BASTA colocando uma fita de papel no caule mais próximo.
    3. Monitore as folhas aplicadas com a gota BASTA para sinais de murcha por até uma semana. Selecione as plantas com folhas não afetadas pelas gotas BASTA.
      Nota: Folhas de falso-positivos mais plantas começam a murchar dentro de dois dias, enquanto folhas de verdadeiro-positivos estão intactas, mesmo depois que a gota de solução BASTA seca (Figura 3C).
  5. Confirme transformants positivo usando PCR genômico.
    1. 2 – 3 folhas coletadas as plantas sobreviventes em etapa 6.4.5.
    2. Extrai DNA genômico de folhas usando o método CTAB23 ou qualquer outro DNA extração método adequado.
    3. Realize PCR usando extraídas amostras de DNA genômicas de alvo plantas, plantas de tipo selvagem (como controles negativos) e a construção de plasmídeo da etapa 3.1 (como um controle positivo). Usar um adequado par de primers PCR específicos para o gene marcador seletivo, por exemplo,, para gene BASTA-resistente (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (em frente) e GTCAACCACTACATCGAGACAA (reverso).
      1. Para os primers PCR exemplo como alvo o gene bar , use as seguintes condições PCR: a etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s; seguido de 30 ciclos de desnaturação a 98 ° C por 30 s, recozendo a 59 ° C por 30 s e estendendo-se a 72 ° C por 30 s; e a extensão final a 72 ° C por 5 min.
        Nota: Para garantir a inserção do T-DNA inteiro, recomendamos também realizando genomic PCR usando uma primeira demão do PCR do gene marcador seletivo e outro primer PCR específico para a sequência do alvo clonado para o vetor de transformação de plantas no passo
    4. Confirmar a presença do tamanho esperado do produto da PCR amplificados bar por de eletroforese de gel de agarose17 para as amostras de alvo(Figura 4), bem como pelo sequenciamento do isolado do PCR produto19 usando o mesmo procedimento como no passo 2.1.

Resultados

Desenvolvemos um protocolo de transformação que permite a colheita de sementes de T0 no prazo de 150 dias, usando um método de imersão floral modificado do que para a. thaliana. A Figura 1 mostra um resumo do cronograma e S. parvula plantas que representam o palco ideal para executar a transformação através de imersão floral. Nós selecionamos S. parvula plantas com flores de 70 –80 em várias inflorescências e...

Discussão

O estado fisiológico da planta influencia significativamente a eficiência de transformação25. O uso de plantas saudáveis e vigorosas para transformação é um requisito-chave para a transformação bem sucedida em S. parvula. Água ou plantas estressadas luz terá menos flores em comparação com as ideal de transformação (Figura 1, painel central) de plantas saudáveis. S. parvula pode crescer em uma intensidade de luz menos de 130 µmol m

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um prêmio da National Science Foundation 1616827 MCB.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWR International, Radnor, PA90000-762Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitaminsSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1019Gamborg’s Vitamin Solution
DesiccantW A Hammond Drierite, Xenia, OH22005Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformationTAIRVector:6531113857pKGWFS7
Electroporation cuvetteUSA Scientific9104-5050Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
ElectroporatorBIO-RAD Laboratories, Hercules, CA1652100MicroPulser Electroporator
Fertilizer beadsOsmocote Garden, Marysville, OHN/AOsmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kitiNtRON Biotechnology, Boston, MA17289MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
GentamicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1914-5GGentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)Bayer environmental science, Montvale, NJN/AFINALE herbicide
KanamycinVWR International, Radnor, PA200004-444Kanamycin monosulfate
MESBioworld, Dublin, OH41320024-2MES, Free Acid
MS saltMP Biomedicals, Santa Anna, CA092621822Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MOB32746-Benzylaminopurine solution
NaClSigma-AlrichS7653Sodium chloride
Non-ionic detergentSigma-Aldrich, St. Louis, MO9005-64-5TWEEN 20 
Plasmid isolation kitZymo Research, Irvine, CAD4036Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kitLife Technology11791-020Gateway LR Clonase II Enzyme mix
RifampicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOR3501-1GRifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubatorThermoFisher Scientific, Waltham, MASHKE4450MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mixSun GroSUN239223328CFLPSun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
SpectinomycinVWR International, Radnor, PAIC15206705
Sterile 50ml conical tubesUSA Scientific, Ocala, FL1500-181150 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
SucroseVWR International, Radnor, PA57-50-1Sucrose, ACS
Surfactant solutionLehle seeds, Round Rock, TXVIS-02Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kitLife Technologies, Carlsbad, CAK240020pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
TryptoneVWR International, Radnor, PA90000-282BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast ExtractVWR International, Radnor, PA90000-722 BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

Referências

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Reimpressões e Permissões

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