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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Trasformazione mediata da Agrobacterium utilizzando un metodo floreale-dip può essere impiegato con successo per creare linee transgeniche stabile del modello extremophyte Schrenkiella parvula. Vi presentiamo un protocollo modificato da quello per Arabidopsis thaliana, considerando le abitudini differenti di sviluppo e caratteristiche fisiologiche della extremophyte.

Abstract

Schrenkiella parvula è un extremophyte adattato a diversi stress abiotici, tra cui molteplici sollecitazioni di tossicità dello ione. Nonostante alta qualità risorse genomiche disponibili per studiare come adattano le piante per ambientale sottolinea, suo valore come un modello di genomica funzionale e strumento è stata limitata dalla mancanza di un sistema di trasformazione fattibile. In questo protocollo, segnaliamo come generare transgenici stabile S. parvula linee utilizzando un metodo di floreale-dip mediata da Agrobacterium. Abbiamo modificato il protocollo di trasformazione usato per a. thaliana per rappresentare caratteristiche uniche di S. parvula, come un'abitudine di fioritura indeterminato e un contenuto di cere epicuticolari alta sulle foglie. In breve, S. parvula semi sono stati stratificati a 4 ° C per cinque giorni prima della piantatura. Piante sono state coltivate in un fotoperiodo di una luce 14h e 10 h scuro e un 130 µmol m-2s-1 intensità della luce, a 22 ° C a 24 ° C. Otto a nove settimane piante con infiorescenze multiple sono stati selezionati per la trasformazione. Queste infiorescenze sono stati immersi in una soluzione di infiltrazione di Agrobacterium tumefaciens GV3101 portando il plasmide pMP90RK . Abbiamo effettuato due giri del fiore di immersione con un intervallo di tre o quattro settimane per aumentare l'efficienza di trasformazione. I semi T1 sono stati raccolti e asciugati per quattro settimane in un contenitore con materiale essicante prima germinazione alla schermata per candidato trasformato le linee. Resistenza a BASTA era usata per selezionare piante T1. Abbiamo spruzzato la soluzione BASTA tre volte con un intervallo di tre giorni a partire da due settimana-vecchi impianti per ridurre i falsi positivi. È stata eseguita una prova di caduta BASTA sopravvivere singole piante per identificare il vero positivo trasformanti. L'efficienza di trasformazione era 0,033%, producendo piante transgeniche di 3 – 4 per 10.000 semi T1 propagate.

Introduzione

In questo protocollo, descriviamo la crescita e la creazione di linee transgeniche stabili per il modello extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilità di un sistema efficiente trasformazione è un marchio di garanzia di qualsiasi modello genetico versatile. Piante che prosperano in ambienti estremi, di cui come extremophytes, fornire una risorsa fondamentale per comprendere gli adattamenti della pianta agli stress ambientali. Schrenkiella parvula (precedentemente Thellungiella parvula ed Eutrema parvulum) è uno di questi modelli extremophyte, con espansione risorse genomiche1,2,3,4,5. Tuttavia, protocolli di trasformazione non sono ancora stati segnalati per S. parvula negli studi pubblicati.

Il genoma di S. parvula è il primo genoma di extremophyte pubblicato in Brassicaceae (famiglia senape-cavolo) e Mostra un'ampia sintenia genoma globale con il modello di non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Così, gli studi comparativi tra a. thaliana e S. parvula potrebbero beneficiare della ricchezza di studi genetici su a. thaliana formulare delle ipotesi ben informativi su come si è evoluto e regolato il genoma di s. parvula in modo diverso per affrontare estremi ambientali sottolinea5,6,7. S. parvula è una delle specie più sale-tolleranti (basati su terreno NaCl LD50) tra parenti selvatici noti di a. thaliana8. Oltre la tolleranza di NaCl, S. parvula sopravvive e completa il suo ciclo di vita in presenza di ioni più sale alle alte concentrazioni tossiche per la maggior parte delle piante7. In risposta agli stress abiotici prevalente nel suo habitat naturale, si sono evoluto varie caratteristiche, tra cui molti sono stati studiati i biochimici o fisiologico livello 8,9,10, 11.

Dal 2010, ci sono state oltre 400 pubblicazioni peer-reveiwed utilizzato S. parvula come specie bersaglio o in un confronto con altri genomi delle piante. Tuttavia, un collo di bottiglia chiaro potrebbe essere identificato con uno sguardo più attento di che tipo di studi sono stati condotti. La maggior parte di questi rapporti discuterà l'uso potenziale di S. parvula negli studi futuri o utilizzarlo in genomica comparativa o phylogenomic studi. A causa della mancanza di un protocollo di proof-of-concept trasformazione stabilito per S. parvula, non è stato utilizzato in studi di genomica funzionale, pur avendo uno dei genomi di pianta più alti di qualità ad oggi disponibili (> 5 Mb contig N50) assemblato e annotato in pseudomolecules livello del cromosoma1.

Il metodo di trasformazione mediata da Agrobacterium di floreale-dip è diventato il metodo più ampiamente usato per creare linee di trasngenic in a. thaliana, e lo sviluppo di un sistema riproducibile di trasformazione era un fattore critico di successo come un modello genetico12,13. Tuttavia, non tutte le specie di Brassicaceae hanno dimostrate di essere trasformata con successo utilizzando il metodo floreale-dip sviluppato per a. thaliana. Appositamente, la specie di Brassicaceae Lineage II che includono S. parvula è stato ricalcitrante a trasformazione base floreale-dip metodi14,15.

L'abitudine di crescita indeterminato fioritura di S. parvula, combinato con la sua morfologia foglia stretta ha reso impegnativo di adottare il metodo standard mediata da Agrobacterium floreale-tuffo trasformazione. In questo studio, segnaliamo il protocollo modificato che abbiamo sviluppato per riproducibile trasformazione di S. parvula.

Protocollo

1. pianta crescita

  1. Sterilizzazione di seme (opzionale)
    1. Preparare 50% candeggina in acqua bidistillata (ddH2O) con 1 o 2 gocce di un detergente non ionico (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 50 mL. Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare la soluzione.
      Nota: È preferibile effettuare la sterilizzazione di seme in un flusso laminare con una superficie di UV sterilizzata per 15 min.
    2. Aggiungere la soluzione di candeggina al ~ 100 – 200 S. parvula semi in una provetta da 1,5 mL. Mescolare accuratamente e lasciare riposare per 5 min.
    3. Rimuovere la candeggina dal tubo e aggiungere etanolo al 70%. Lavare i semi di pipettaggio più volte e quindi rimuovere la soluzione di etanolo immediatamente.
    4. Lavare i semi in acqua sterilizzata per rimuovere etanolo e candeggina in eccesso, quindi rimuovere l'acqua. Ripetere questo passaggio 5 o 6 volte.
  2. Stratificazione di seme
    1. Immergere i semi in acqua sterilizzata e memorizzare per 5-7 giorni a 4 ° C. In alternativa, seminare i semi secchi non sterilizzati direttamente sul terreno bagnato e mettere la vaschetta di terreno per 5-7 giorni a 4 ° C.
  3. Piante che crescono in preparazione della trasformazione
    1. Riempire il terreno mescolare (Vedi Tabella materiali) in vasi di 7 x 6 cm2 , immergere i vasi in acqua e spruzzare acqua dalla parte superiore per garantire una crescita uniformemente umido medio. Aggiungere 5 – fertilizzante Perline (Vedi Tabella materiali) sulla superficie del suolo di ogni piatto.
      Nota: Per quanto abbiamo sperimentato, S. parvula cresce bene su qualsiasi mix di terreno dove possono crescere a. thaliana .
    2. Utilizzando uno stuzzicadenti bagnato, trasferire 20 ~ 25 semi per vaso sulla superficie del suolo.
      Nota: Una pratica conveniente è quello di mettere una serie di 4 – 5 semi in quattro angoli e al centro del piatto (Figura 1, giorno 15, pannello di sinistra).
    3. Coprire il vassoio piatto con una cupola trasparente per tenere i semi sotto alta umidità durante la germinazione.
    4. Tenere i vassoi di pianta in una camera di crescita con un'intensità luminosa impostata alle 130 luce µmol m− 2 s− 1 , temperatura di 22 – 24 ° C e 14 ore al giorno/10 h per ciclo di notte. Rimuovere le cupole dopo 7-10 giorni dopo la germinazione. Aggiungere l'acqua dalla parte inferiore del vassoio per mantenere il terreno inumidito in modo uniforme a livello desiderabile.
    5. Estirpare le piantine supplementare e lasciare solo 4 – 5 sano piantine per vaso ben separato gli uni dagli altri (Figura 1, giorno 15, pannello di destra).
    6. Delicatamente le piante di acqua ogni due giorni e fertilizzare con 0,2 x soluzione16 di Hoagland una volta ogni due settimane.
      Nota: Mantenere l'umidità del terreno ad un livello uniforme è chiave alla crescente S. parvula costantemente e in modo sano.
    7. Continuano a crescere le piante per 8 – 10 settimane fino alla più infiorescenze producono 100 – 150 gemme floreali per pianta (Figura 1, giorno: 60 – 80). Il giorno previsto per la trasformazione di base floreale-dip (punto 4.5), è necessario rimuovere tutte le silique mature e in via di sviluppo dalle piante.

2. clonazione del Gene/genomica elemento di interesse in un vettore per la trasformazione della pianta

  1. Amplificare il frammento di DNA bersaglio usando polimerasi reazione a catena (PCR)17 e isolare il prodotto PCR utilizzando un'estrazione del gel kit (Vedi Tabella materiali) secondo il protocollo di kit o qualsiasi altro metodo appropriato per purificare il DNA utilizzando gel dell'agarosi l'elettroforesi17,18. Verificare la sequenza del prodotto della PCR isolato attraverso di sequenziamento Sanger19.
  2. Clone del prodotto di PCR desiderato nella clonazione vettoriale e trasformazione il costrutto clonato in competente Escherichia coli cellule utilizzando una clonazione di topoisomerasi-based kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le linee guida del produttore.
  3. 50 µ l di prodotti trasformati sul supporto della crescita batterica della agar del20 (LB) di Luria-Bertani (tabella 1) con gli antibiotici adatti, di diffondere ES., 50 µ g / mL spectinomicina (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C durante la notte.
  4. Il giorno seguente, selezionare 5 – 10 singole colonie, inoculare in terreno liquido LB con gli antibiotici adatti e incubare con agitazione delicata a 37 ° C durante la notte.
  5. Plasmidi isolare utilizzando un isolamento di plasmide kit (Vedi Tabella materiali) e verificare attraverso di sequenziamento Sanger19 se la sequenza di destinazione amplificata 2.1 viene duplicata correttamente.
  6. Trasferire il prodotto PCR clonato e verificato per un vettore di destinazione per la trasformazione di impianto compatibile con clonazione di ricombinazione-based (Vedi Tabella materiali), utilizzando un mix di enzima recombinase kit (Vedi Tabella materiali), seguente istruzioni del fabbricante kit. Ripetere dal passo 2.3 al passo 2,5 a isolare e verificare cloni che harboring costrutti di plasmide adeguato.

3. trasformare il vettore costruire per impianto trasformazione in Agrobacterium tumefaciens

  1. Trasformare il plasmide del costrutto vettoriale da 2,6 il ceppo di a. tumefaciens GV3101:pMP90RK21, che harbors un gene di resistenza di rifampicina per selezione sfondo cromosomiche. Utilizzare gli antibiotici adatti, ad esempio gentamicina o kanamicina (Vedi Tabella materiali), per la selezione dell'impianto di trasformazione costruire (plasmide Ti). Un protocollo breve per la trasformazione di a. tumefaciens tramite elettroporazione è incluso nella sezione 3.2.
  2. A. tumefaciens trasformazione mediante elettroporazione
    1. Scongelare i di cellule competenti di a. tumefaciens 22 sul ghiaccio. Mix: 0,1 – 1 µ g del plasmide preparato da 2,6, disciolto in 1-2 µ l di ddH2O, con cellule competenti sul ghiaccio. Trasferire il composto ottenuto in una cuvetta di elettroporazione (Vedi Tabella materiali).
    2. Eseguire l'elettroporazione sulla miscela di plasmidi e cellule competenti da 3.2.1, utilizzando un electroporator (Vedi Tabella materiali) seguendo le linee guida del produttore.
      Nota: Pulire la superficie della provetta prima di iniziare l'elettroporazione.
    3. Trasferire la miscela di reazione dalla cuvette ad un tubo del microcentrifuge contenente 1,5 mL di LB liquido e mescolare bene con il pipettaggio e incubare per 1 h a 28 ° C con agitazione delicata.
  3. Inoculare il trasformato a. tumefaciens dalla sezione 3.2 su piastre LB contenenti antibiotici selezione appropriata (ad esempio kanamicina 25 µ g / mL, spectinomicina 50 µ g / mL, la gentamicina 25 µ g / mL e rifampicina 50 µ g / mL) e incubare a 28 ° C per 3 giorni.

4. trasformazione mediata da Agrobacterium di S. parvula

  1. Inoculare il singolo trasformato colonie da piastre in 10 mL di LB media liquidi contenenti antibiotici (lo stesso come in 3.3) in una sterile 50 mL conica del tubo (Vedi Tabella materiali). Incubare per 24 h in un incubatore d'agitazione (Vedi Tabella materiali) a 250 giri/minuto a 28 ° C.
  2. Trasferire la soluzione batterica da 3.4.1 in una beuta sterile 250 mL, aggiungere 40 mL di liquido LB media con gli antibiotici adatti e incubare 12h fino a quando la densità ottica a 600 Nm (OD600) raggiunge circa 2.0.
  3. Centrifugare il a. tumefaciens cultureat 3.100 x g per 10 min. rimuovere il surnatante e risospendere la coltura batterica in 40 mL di soluzione di a. tumefaciens infiltrazione (tabella 1).
  4. Diluire il sedimento a. tumefaciens con soluzione di infiltrazione a un finale OD600 di 0,8. Aggiungere 25 µ l di soluzione di tensioattivo (tabella 1) in 50 mL di diluito a. tumefaciens soluzione e mescolare capovolgendo più volte.
  5. Immergere l'infiorescenza delle piante nella soluzione a. tumefaciens preparata nella sezione 4.4 per 20 s. uso una soluzione batterica fresca dopo la immersione infiorescenza da sei pentole. Assicurarsi che tutti i fiori sono a contatto con la soluzione. Soluzioni batteriche di dispensare direttamente sui fiori che si trova nella parte inferiore dell'infiorescenza, se essi non può essere immerso nella soluzione.
    Nota: Per la trasformazione del primo turno, assicurarsi di rimuovere tutte le silique mature e in via di sviluppo, utilizzando un bisturi affilato o piccole forbici. Non rimuovere silique se eseguendo la trasformazione per la seconda volta.

5. post-trasformazione impianto cura e la seconda trasformazione

  1. Posizionare le piante floreali-tuffato orizzontalmente in vaschette pulite con cupole per coprire le piante e posto in una stanza di crescita scuro per 1 – 2 giorni.
    Nota: Mantenere i fiori sotto alto-umidità è importante in questa fase (Figura 1, piante dopo la trasformazione).
  2. Restituire le piante in posizione verticale e trasferire le piante in una camera di crescita con un 14 h al giorno/10 h per ciclo di notte, 130 intensità luminosa di µmol m-2 s-1 e 22-24 ° C di temperatura.
  3. Monitorare le infiorescenze tuffate nella settimana successiva. Se un numero significativo di fiori abort (Figura 2), ripetere il tuffo floreale (passaggio 4) dopo circa 4 settimane o dopo un gran numero di fiori hanno recentemente sviluppato.
    Nota: A differenza di fase di preparazione per la prima trasformazione (punto 1.3.7), non rimuovere pre-esistenti o in via di sviluppo silique (Figura 2) prima del secondo turno di trasformazione.
  4. Crescere le piante fino a quando i semi maturano e raccolgono i semi a ~ 21 settimane.
  5. Semi secchi per 2 – 3 settimane a temperatura ambiente in un contenitore ermetico con riempito con materiale essicante (Vedi Tabella materiali).

6. selezione dei trasformanti positivo

  1. Piantare i semi T1 come descritto per i semi di tipo selvaggio nei passaggi da 1.2 a 1.3.
  2. Crescere le piante fino a sviluppano le prime 2 foglie vere, circa il 10 – 14 giorni dopo la germinazione.
  3. Eseguire la prima selezione per la resistenza agli erbicidi (Figura 3A e 3B) come dettagliato qui sotto.
    1. Diluire l'erbicida glufosinato-ammonio (11,3%) (o BASTA) (tabella 1) per 1:1,000 (v/v). Spruzzare la soluzione diluita BASTA sulle piantine e coprire le piante con cupole durante la notte.
    2. Ripetere BASTA spruzzare 2-3 volte ogni 5 – 7 giorni.
  4. Eseguire la seconda selezione utilizzando un test di caduta BASTA come dettagliato di seguito.
    1. Identificare le piante che sopravvivono dopo essere stato spruzzato 3 – 4 volte con soluzione BASTA. Coltivare le piante per un altro 2-3 settimane fino a 3 – 5 foglie sviluppano una superficie relativamente grande.
    2. Selezionare la più grande foglia adulta per pianta, strofinare la superficie della foglia delicatamente con le dita per rimuovere lo strato di cera e mettere una goccia di soluzione diluita BASTA (dal punto 6.3.1).
      Nota: Segnare la posizione della foglia applicata con la goccia BASTA inserendo un nastro di carta sul gambo più vicino.
    3. Monitorare le foglie applicate con la goccia BASTA per segni di avvizzimento fino ad una settimana. Selezionare le piante con foglie inalterati dalle gocce BASTA.
      Nota: Foglie da piante più falsi positivi cominciano ad appassire entro due giorni, mentre le foglie da true-positivi sono intatte anche dopo la goccia di soluzione BASTA si prosciuga (Figura 3C).
  5. Conferma positiva trasformanti mediante PCR genomic.
    1. Raccogliere 2 – 3 foglie dalle piante sopravvissute al punto 6.4.5.
    2. Estrarre il DNA di genomic dalle foglie utilizzando il metodo CTAB23 o qualsiasi altro appropriato metodo di estrazione del DNA.
    3. Eseguire PCR utilizzando campioni di DNA genomici estratti da piante bersaglio, piante di selvaggio-tipo (come controllo negativo) e il costrutto di plasmide dal passaggio 3.1 (come controllo positivo). Utilizzare una coppia appropriata degli iniettori di PCR specifici per il gene marcatore selettivo, ad esempio, per gene BASTA-resistenti (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (avanti) e GTCAACCACTACATCGAGACAA (inverso).
      1. Per gli iniettori PCR esempio mira il gene bar , utilizzare le seguenti condizioni PCR: il punto di denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s; seguiti da 30 cicli di denaturazione a 98 ° C per 30 s, ricottura a 59 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 30 s; e l'estensione finale a 72 ° C per 5 min.
        Nota: Per garantire l'inserimento del T-DNA intero, si consiglia di eseguire anche PCR genomic utilizzando un primer PCR da gene marcatore selettivo e clonato un altro primer PCR specifico nella sequenza di destinazione per il vettore di trasformazione della pianta al passo
    4. Confermare la presenza della dimensione prevista del prodotto della PCR amplificati bar da elettroforesi su gel di agarosio17 per i campioni di obiettivo (Figura 4A) nonché ordinando il prodotto PCR isolato,19 utilizzando la stessa procedura come descritto al punto 2.1.

Risultati

Abbiamo sviluppato un protocollo di trasformazione che consente la raccolta dei semi di T0 entro 150 giorni, utilizzando un metodo di floreale-dip modificato da quello di a. thaliana. La figura 1 Mostra un riepilogo della timeline e S. parvula piante che rappresentano la fase ottima per l'esecuzione della trasformazione attraverso floreale-dip. Abbiamo scelto S. parvula piante con fiori di 70 -80 in più infiorescenze a 6...

Discussione

Lo stato fisiologico della pianta influenza significativamente l'efficienza di trasformazione25. L'utilizzo di piante sane e vigorose per trasformazione è un requisito chiave per la trasformazione di successo in S. parvula. Acqua o luce piante stressati avrà meno fiori rispetto alle piante sane ideale per la trasformazione (Figura 1, pannello centrale). S. parvula può crescere con un'intensità di luce inferiore a 130 µmol m-2 s-1...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation 1616827 MCB.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWR International, Radnor, PA90000-762Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitaminsSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1019Gamborg’s Vitamin Solution
DesiccantW A Hammond Drierite, Xenia, OH22005Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformationTAIRVector:6531113857pKGWFS7
Electroporation cuvetteUSA Scientific9104-5050Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
ElectroporatorBIO-RAD Laboratories, Hercules, CA1652100MicroPulser Electroporator
Fertilizer beadsOsmocote Garden, Marysville, OHN/AOsmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kitiNtRON Biotechnology, Boston, MA17289MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
GentamicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1914-5GGentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)Bayer environmental science, Montvale, NJN/AFINALE herbicide
KanamycinVWR International, Radnor, PA200004-444Kanamycin monosulfate
MESBioworld, Dublin, OH41320024-2MES, Free Acid
MS saltMP Biomedicals, Santa Anna, CA092621822Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MOB32746-Benzylaminopurine solution
NaClSigma-AlrichS7653Sodium chloride
Non-ionic detergentSigma-Aldrich, St. Louis, MO9005-64-5TWEEN 20 
Plasmid isolation kitZymo Research, Irvine, CAD4036Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kitLife Technology11791-020Gateway LR Clonase II Enzyme mix
RifampicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOR3501-1GRifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC)
Shaking incubatorThermoFisher Scientific, Waltham, MASHKE4450MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mixSun GroSUN239223328CFLPSun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
SpectinomycinVWR International, Radnor, PAIC15206705
Sterile 50 mL conical tubesUSA Scientific, Ocala, FL1500-181150 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
SucroseVWR International, Radnor, PA57-50-1Sucrose, ACS
Surfactant solutionLehle seeds, Round Rock, TXVIS-02Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kitLife Technologies, Carlsbad, CAK240020pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
TryptoneVWR International, Radnor, PA90000-282BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast ExtractVWR International, Radnor, PA90000-722 BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

Riferimenti

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