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Resumen

Locus coeruleus es un pequeño grupo de neuronas implicadas en una variedad de procesos fisiológicos. Aquí, describimos un protocolo para preparar secciones de cerebro de ratón para estudios de proteínas y metales en este núcleo.

Resumen

El locus coeruleus (LC) es un importante centro de norepinefrina produciendo neuronas que modulan varias funciones fisiológicas. Anormalidades estructurales o funcionales de LC afectan varias regiones del cerebro incluyendo la corteza, hipocampo y cerebelo y pueden contribuir a la depresión, trastorno bipolar, ansiedad, así como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Estos trastornos a menudo se asocian a misbalance metal, pero el papel de los metales en LC se entiende solamente parcialmente. Estudios morfológicos y funcionales de LC son necesarios para comprender mejor las patologías humanas y la contribución de metales. Los ratones son un modelo experimental utilizado, pero el ratón LC es pequeño (~0.3 mm de diámetro) y difíciles de identificar para un no experto. Aquí, describimos un protocolo de inmunohistoquímica-base paso a paso para localizar la LC en el cerebro de ratón. Dopamina-β-hidroxilasa (DBH) y alternativamente, la tirosina hidroxilasa (TH), ambas enzimas altamente expresadas en la LC, se utilizan como marcadores inmunohistoquímicos en rebanadas de cerebro. Secciones adyacentes a las secciones que contiene la LC pueden utilizarse para su posterior análisis, incluyendo histología para estudios morfológicos, pruebas metabólicas, así como la proyección de imagen de metal por microscopía de fluorescencia de rayos x (XFM).

Introducción

El locus coeruleus (LC) es una región importante en el médula oblonga y un sitio importante de producción de norepinefrina (NE)1. La LC envía proyecciones a lo largo de los2 del cerebro a la corteza, el hipocampo y el cerebelo3 y regula procesos fisiológicos importantes, incluyendo el ritmo circadiano4,5, atención y memoria6, tensión de7,8de procesos cognitivos y emoción9,10. Disfunción de la LC ha sido implicada en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos11, incluyendo Parkinson enfermedad12,13,14, enfermedad de Alzheimer14, depresión15 ,16,17y18,de trastorno bipolar19ansiedad20,21,22,23, 24. teniendo en cuenta estas funciones, análisis de LC es fundamental para estudiar su función y disfunción.

Ratones son ampliamente utilizados para estudios de procesos fisiológicos y patofisiológicos. Debido a su pequeño tamaño, el ratón LC tiene un diámetro promedio de ~ 300 μm, conduciendo a la dificultad para ubicar la estructura. Durante secciones de la cerebral, la LC puede perderse fácilmente en secciones coronales o sagitales. Descripción identificación de LC en los animales los estudios disponibles no ofrecen un protocolo paso a paso que un no experto puede seguir1,25. Así, para ofrecer una orientación para la localización de la LC, se describe un protocolo que hemos desarrollado para localizar la región en el cerebro de ratón para aplicaciones varias (figura 1, figura 2, figura 3). El protocolo aplica a detección de seccionamiento e immunohistochemical cerebro cuidadosamente controladas de DAP26,27, o alternativamente TH24, ambas enzimas altamente enriquecidos en el LC28. Una vez que la LC se encuentra por immunohistochemistry, rebanadas del cerebro adyacente pueden utilizarse para otros estudios, los análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios imagenológicos metal por rayos x fluorescencia microscopía (XFM)29. Describimos XFM como ejemplo en este protocolo (figura 3).

Protocolo

Estudios de los animales fue aprobado por la Johns Hopkins University Animal cuidado y número de protocolo de uso (ACUC) M017M385.

1. cerebro de corte

  1. Para inmovilizar, anestesiar ratones por la aplicación del 3% de isoflurano.
    1. Remoje una bola de algodón con gotas de isoflurano y colocar en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Colocar la nariz del animal en el tubo y deje que se inhale el isoflurano. Compruebe que la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca del dedo del pie.
  2. Colocar el animal sobre su espalda e inmovilizar por fijar sus extremidades hacia abajo con un alfiler T teniendo acceso a su abdomen.
  3. Cortar los animales con tijeras quirúrgicas haciendo un recorte de la piel abdominal y cortar a través de la piel en la región del tórax. Precisar la piel usando las clavijas T. Entonces se rompe la membrana peritoneal hasta el tórax. Exponer el corazón se agrieta la cavidad torácica y el diafragma.
  4. Corte de la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera del animal. Inserte una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 25 en el ventrículo izquierdo y perfusión con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    Nota: Esto permite que la solución fluya a través de la circulación sistémica y la salida a través de la aurícula derecha.
  5. Retire la jeringa de 10 mL e inserte una aguja calibre 25 a la jeringa de 60 mL. Perfusión a través del ventrículo izquierdo con 50 mL de paraformaldehído al 4% hielo frío (PFA).
    1. Preparar hielo frío 4% PFA solución diluyendo 10% solución PFA en H2O y enfriar la solución final de PFA 4% a 4 ° C.
  6. Aislar la cabeza del ratón y extraer el cerebro del cráneo.
    1. Cortar la piel del cuello y luego corta hacia los ojos para exponer el cráneo. Romper el cráneo desde el cuello a la nariz y luego desde un globo a otro. Pelar el cráneo hacia fuera y suprimir todo el cerebro.
  7. Incubar el cerebro en el 4% PFA por 24 h a 4 ° C.
  8. Transferir el cerebro con pinzas en un tubo cónico de 50 mL con 25 mL de solución de sacarosa al 30%. Mantenerla a 4 ° C durante 48-72 h hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo.
  9. Cortar el cerebro con una máquina de cortar de cerebro de ratón adulto coronal de la matriz a través del mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Mantenga la sección del cerebro que contiene el médula oblonga.
    Nota: Esto dará lugar a dos secciones del cerebro – que contiene más de corteza (anterior del corte) y uno que contiene el tronco cerebral-cerebelo (parte posterior del corte). Utilice la sección del tronco encefálico para los siguientes pasos.
  10. Incorporar la sección del tronco encefálico con la superficie de corte colocada en la parte inferior de un molde de empotrar, rodeado por la temperatura de corte óptimo compuesto (octubre); mover el cerebro incrustado a un congelador de-80 ° C y congelación durante al menos 12 h – hasta su uso posterior.
  11. Corte en el criostato: lugar la fijación del molde que contiene el cerebro de OCT en el criostato; Incubar en el criostato durante varias horas ajustar la temperatura del bloque del cerebro al de criostato.
  12. Retire el molde de inclusión para exponer el bloque de OCT que contiene el cerebro.
  13. Utilice hojas de afeitar para quitar exceso de OCT de la superficie del bloque sin tocar el cerebro.
  14. Monte el bloque de OCT en el mandril del criostato, exponer la superficie de corte del cerebro hacia el frente.
  15. Ajustar la superficie de corte del cerebro de manera que se orienta en paralelo a las razorblades de criostato.
  16. Recorte del cerebro que comienza en la médula, corte 100 μm secciones rostral.
  17. Borde rostral hasta el cerebelo y el tronco encefálico cortan como un segmento continuo. Comenzar a colectar rebanadas a 50 μm de grosor.
    Nota: Como uno recorta rostral de la médula, el tronco encefálico y el cerebelo se cortan como dos secciones separadas. En secciones rostrales, el tronco encefálico y el cerebelo se fusionarán eventualmente a nivel del ventrículo 4th . Una vez que los bordes laterales del ventrículo 4th son bien formados, a continuación, el cerebelo y el tronco encefálico va a salir como un segmento continuo.
    1. Recoger la rebanada del cerebro rodeado de OCT con pinzas y colocar en un pozo de una placa de 24 pocillos con PBS (Figura 2a). La LC será más prominente cuando el cerebelo y el colículo inferior resuelven uno otro en ~-5.52 mm posterior de bregma (Figura 1b).
      Nota: La parte más anterior de la LC va a desaparecer una vez que el cerebelo ha sido seccionado totalmente y ya no rodea el colliculus inferior en ~-5.34 mm posterior de bregma (figura 1C).

2. inmunohistoquímica para dopamina β-hidroxilasa o la tirosina hidroxilasa (Figura 2)

  1. Día 1
    1. Lavar las rodajas de las tres veces durante 5 minutos en PBS.
    2. Permeabilizar por 24 h en 0.5% de tampón fosfato salino con detergente (PBSD) a 4 ° C.
      1. Diluir 125 μl de detergente en 25 mL de PBS.
  2. Día 2
    1. Lavar rebanadas tres veces durante 5 min en 0.5% PBSD.
    2. Añadir el anticuerpo primario, anti-DAP o anti-TH de 18 h a una dilución de 1: 500 en 0.5% PBSD a 4 ° C.
  3. Día 3
    1. Lavar rebanadas tres veces durante 10 min en 0.5% PBSD.
    2. Añadir el anticuerpo secundario deseado (488 burro anti-conejo para fluorescencia verde) a una dilución de 1: 1000 en 0.5% PBSD durante 16 horas.
    3. Envolver la placa bien 24 en aluminio y de 4 ° C.
    4. Lavar rebanadas tres veces durante 5 min en 0.5% PBSD.
    5. Lavar durante 5 minutos en PBS.
    6. Transferencia de rebanadas con un pincel de lápiz en un recipiente de agua.
    7. Coloque rodajas flotando en el agua en las diapositivas cargadas.
    8. Secciones de cubreobjetos con medios de montaje observó (sin DAPI).
    9. Secar las secciones de la cerebral montado durante 30 min a temperatura ambiente.
    10. Rebanadas de cerebro de imagen en un microscopio confocal o fluorescente con configuración para detectar la señal de longitud de onda de fluoróforo anticuerpo secundario apropiado.
    11. Ajuste del microscopio para el plano focal de la rebanada del cerebro y tomar una sola imagen con 10 aumentos.
    12. Para localizar una posible región de LC en la rebanada del cerebro, utilizar el ventrículoth 4 para la orientación; el cerebelo se encuentra por encima del ventrículo, puente de Varolio y tronco encefálico se encuentran por debajo de30.
    13. Para localizar la LC, se centran en los bordes laterales del ventrículo 4th ; la LC se origina de los bordes de los 4 puntos hacia el puente de Varolio y ventrículoth / región del tronco encefálico (figura 2b, 2C).
    14. Tras la proyección de imagen y la localización de la LC en ciertos sectores del cerebro, almacenar diapositivas que contiene rebanadas de cerebro a 4 ° C.

3. detección de la LC en rebanadas de cerebro

  1. Para localizar la sección del cerebro que contiene la LC, la rebanada del cerebro de ratón como se describe anteriormente y recoger las secciones en PBS llena 24 platos bien, como se muestra en la Figura 2a.
    1. Coloque una sección del cerebro por pozo para permitir la correcta localización de la LC.
  2. Recoger un total de 48 rebanadas de cerebro que immunostained por cerebro.
    Nota: Todos los pozos de los dos platos que se muestra en la Figura 2a contienen rebanadas de cerebro de un animal.
  3. Immunostain cada rebanada de tercera a quinta para DAP, o TH Preferiblemente, realizar inmunohistoquímica de las rebanadas de cerebro que son adyacentes a las que se analizan más (a través de microscopía de fluorescencia de rayos x, XFM).
    Nota: Este procedimiento permite la localización exacta de la LC en los cortes de ensayo final (Figura 2a; etiquetados con números entre los pozos).
  4. Ajustar el número de rebanadas de cerebro que immunostained dependiendo de la aplicación, por ejemplo, si requiere la ubicación exacta del centro y el borde de la LC, o solamente una aproximación áspera.
  5. Después de immunohistochemistry, detectar rebanadas de cerebro que contiene LC a través de un patrón característico de la expresión en ambos lados del 4 ventrículoth (figura 2b, 2C). Aumento de la señal de DAP en la LC de rebanadas cerebrales consecutivos se muestra en la Figura 2d, 2e; la imagen magnificada de la LC que se tiñe de TH se muestra en la figura 2f.
  6. Utilice las secciones adyacentes a los LC que contiene estudios adicionales - en este caso para XFM para cuantificar niveles de metal (figura 3).
  7. Para realizar el XFM, recoger rebanadas de cerebro coronales fino 10-30 μm (dependiendo de la configuración) en la fina película polimérica con la que pueden ser montados sobre portamuestras y reflejadas en el sincrotrón.
  8. Rebanadas de cerebro de tienda que se preparan en delgada película polimérica para XFM a temperatura ambiente y realizan XFM.

4. metal proyección de imagen en la LC a través de XFM

  1. Cortar el cerebro de ratón de ejemplo como se describe anteriormente, determinar LC y medir los niveles de metal a través de XFM de estas rebanadas de cerebro que contiene la LC.
  2. Distribuciones elementales de imagen en línea 2-ID-E en el origen del fotón avanzado (Laboratorio Nacional de Argonne, Argonne IL).
  3. Registrar datos 'sobre la marcha' como se describe anteriormente31.
  4. Determinar las concentraciones elementales en rebanadas de cerebro que contiene la LC con el programa mapas32,33.

Resultados

Cambios en la homeostasis de metales (tales como Cu, Fe, Zn y Mn) a menudo se observan en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en la LC34,35. Así, determinar los niveles de metales en el cerebro es necesario para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las secciones de la cerebral generadas utilizando el protocolo descrito pueden utilizarse para cuantificar los niveles de Cu y otros metales en la LC y comparar...

Discusión

Orientar adecuadamente la muestra es un paso crucial en el presente Protocolo. Porque estamos usando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC (límite entre cerebelo y colículo inferior), es importante alinear correctamente las secciones. Esto requiere cuidado en fijar adecuadamente el cerebro en la matriz de máquina de cortar de cerebro de ratón. Recomendamos cortar ~ 500 μm más tejido anterior y posterior al LC para evitar la falta del núcleo. El error más común es cort...

Divulgaciones

Ninguno.

Agradecimientos

Agradecemos a Abigael Muchenditsi para el mantenimiento de la colonia de ratón. Uso de la fuente de fotones avanzado en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, con el número de contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova y Dr. Stefan Vogt para soporte a usuarios y asistencia en la fuente avanzada de fotones. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud beca 2R01GM101502 a SL.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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