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Erratum Notice

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요약

로커 스 coeruleus는 다양 한 생리 적 과정에에서 관여 하는 신경의 작은 클러스터. 여기, 우리는 단백질이이 핵에 금속의 연구에 대 한 마우스 뇌 섹션을 준비 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

로커 스 coeruleus (LC)는 다양 한 생리 기능을 조절 하는 신경 세포를 생산 하는 노르의 주요 허브 이다. LC의 구조적 또는 기능적 이상 피 질, 해 마와 소 뇌를 포함 하 여 여러 가지 뇌 영역에 영향을 하 고 우울증, 양극성 장애, 불안로 파 킨 슨 질환과 Alzheimer 질병에 기여할 수 있습니다. 이 질환은 종종 금속 misbalance와 관련 된 하지만 lc에서의 역할은 부분적 으로만 이해. LC의 형태 론 적과 기능 연구는 더 나은 인간의 병 리와 금속의 기부를 이해 필요 합니다. 마우스는 널리 사용 되는 실험적인 모델 이지만 마우스 LC 작은 (~0.3 m m 직경)와 비-전문가 대 한 식별 하기 어렵다. 여기, 우리는 쥐의 뇌에 LC를 지역화 하는 단계별 immunohistochemistry 기반 프로토콜을 설명 합니다. 도파민-β-hydroxylase (DBH), 및 양자 택일로, 티로신 hydroxylase (TH), 액정, 높은 표현 두 효소 뇌 조각에서 immunohistochemical 표식으로 사용 됩니다. LC 포함 된 섹션에 인접 한 섹션 x 선 형광 현미경 검사 법 (XFM) 하 여 형태학 연구, 신진 대사 테스트로 금속 영상 조직학을 포함 하 여 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

서문

로커 스 coeruleus (LC) brainstem에 노르 (NE) 생산1의 주요 사이트는 중요 한 지역 이다. LC 피 질, 해 마와 소 뇌3 뇌2 에 걸쳐 예측을 전송 하 고 circadian 리듬4,5, 주 및 메모리6를 포함 하 여 주요 생리 적 프로세스 조절 7,8, 인지 과정 및 감정9,10스트레스. LC의 부전 신경 정신병 무질서11, 파 킨 슨 병12,13,14, Alzheimer 질병14, 우울증15 포함 하 여 연루 되어 ,,1617, 양극성 질환18,19및 불안20,,2122,23, 24. 이러한 역할을 감안할 때, LC의 분석은 그것의 기능과 역 기능을 공부 하 고 중요 한.

생쥐는 생리 및 pathophysiologic 프로세스의 연구에 널리 사용 됩니다. 그들의 작은 크기로 인해 마우스 액정 구조를 찾는데 어려움을 선도 하는 ~ 300 μ m의 평균 직경이 있다. 뇌 단면, 동안 LC 코로나 또는 화살 섹션에서 쉽게 놓칠 수 수 있습니다. 사용할 수 연구 동물에서 LC의 식별을 설명 하는 단계별 프로토콜을 제공 하지 않습니다 비-전문가1,25를 따를 수 있습니다. 따라서, LC의 지역화에 대 한 지침을 제공, 우리는 몇 가지 애플 리 케이 션 (그림 1, , 그림 2 그림 3)에 대 한 쥐의 뇌에서이 영역을 찾으려고 개발 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 DBH26,27, 또는 양자 택일로 회24, 신중 하 게 제어 뇌 단면 및 immunohistochemical 검출을 두 효소 LC28에서 높게 풍성 하 게 적용 됩니다. LC는 immunohistochemistry 여 일단, 인접 한 뇌 조각 추가 연구, 형태학 및 대사 분석 뿐만 아니라 x-선 형광 현미경 검사 법 (XFM)29통해 금속 이미징 연구를 포함 하 여 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜 (그림 3)에서 예를 들어 XFM를 설명합니다.

프로토콜

동물의 연구는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 (ACUC) 프로토콜 번호 M017M385에 의해 승인 되었다.

1. 두뇌 슬라이스

  1. 고정, 3 %isoflurane의 응용 프로그램에서 마우스를 anesthetize.
    1. 15 mL microcentrifuge 튜브에와 isoflurane 방울과 면봉을 담근 다. 튜브에 동물의 코를 놓고는 isoflurane 흡입을 합니다. 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이를 확인 합니다.
  2. 그것의 뒤에 동물을 놓고 그것의 복 부에 액세스 하는 동안 T 핀 그것의 사지를 고정 하 여 고정 합니다.
  3. 복 부 피부에서 캡처 하 여 동물 수술가 위로 잘라 고 가슴 지역에 피부를 통해 잘라. T 핀을 사용 하 여 피부를 고정 합니다. 다음에 가슴까지 복 막 휴식. 심장 격 막 흉 강을 크래킹 하 여 노출 합니다.
  4. 동물에서 흐르는 혈액을 있도록 오른쪽 아 트리 움 잘라. 좌 심 실에 25 게이지 바늘 10 mL 주사기를 삽입 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 perfuse.
    참고:이 솔루션 전신 순환 및 출구를 통해 흐름을 수 있습니다 통해 오른쪽 아 트리 움.
  5. 10 mL 주사기를 제거 하 고 60 mL 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입. 얼음 차가운 4 %paraformaldehyde (PFA)의 50 mL와 좌 심 실을 통해 perfuse.
    1. H2O 10 %PFA 솔루션을 희석 하 고 놀 아 요 4 ° c.에 마지막 4 %PFA 솔루션으로 얼음 찬 4 %PFA 솔루션을 준비
  6. 마우스의 머리를 분리 하 고 두개골에서 뇌를 제거.
    1. 목에서 피부를 잘라내어 다음 두개골 노출 눈 쪽으로 잘라. 코, 목에서 그리고 다른 한 안구에서 두개골 균열. 두개골 밖으로 껍질 그리고 전체 두뇌를 삭제할.
  7. 4%에서 뇌를 품 어 PFA 4 ° c.에 24 h에 대 한
  8. 가득한 30% 자당 해결책의 25 mL 50 mL 원뿔 튜브에 집게와 두뇌를 전송. 뇌 관의 바닥에 싱크 될 때까지 48-72 h 4 ° C에서 그것을 유지.
  9. 잘라 성인 마우스 뇌 슬라이서와 뇌 midbrain (bregma의 후부 ~ 3 m m)를 통해 매트릭스 화관. 포함 하는 brainstem 뇌 섹션을 유지 합니다.
    참고:이 두 개의 뇌 섹션-피 질 (컷의 앞쪽)의 brainstem/소 뇌 (컷의 후부) 포함 한 포함 대부분 발생 합니다. Brainstem 섹션을 사용 하 여 다음 단계에 대 한.
  10. (10 월); 최적의 절삭 온도 화합물에 의해 포위, 포함 금형의 하단에 배치 잘라 표면 brainstem 섹션 포함 -80 ° C 냉동 고에 포함 된 뇌를 이동 하 고 더 사용까지 적어도 12 h-동결.
  11. cryostat에서: 장소 cryostat;로 10 월에 뇌를 포함 된 금형 포함 cryostat는 cryostat의 두뇌 블록의 온도 조정 하는 몇 시간 동안에 그것을 품 어.
  12. 껍질 멀리 두뇌를 포함 하는 10 월 블록 노출 포함 형.
  13. 면도날을 사용 하 여 뇌를 건드리지 않고 10 월의 초과 블록의 표면에서 제거.
  14. 10 월 블록 앞쪽 뇌의 절단된 표면 노출 cryostat의 척에 탑재 합니다.
  15. 그것은 cryostat의 razorblades 동시에 지향은 뇌의 절단된 표면을 조정 합니다.
  16. 100 µ m 섹션 rostrally 절단 정도에서 시작 하는 뇌를 잘라 주세요.
  17. 소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 잘라 때까지 rostrally를 잘라 주세요. 50 µ m 두께에서 조각을 수집 시작 합니다.
    참고: 하나의 모 수에서 rostrally 트림로 brainstem 및 소 뇌 것입니다 잘라 두 개의 별도 섹션으로. Rostral 단원의 brainstem 및 소 뇌 결국 병합 됩니다 4번째 심 실 수준에서. 일단 4번째 심 실의 측면 가장자리 제대로 구성 된 다음 소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 나올 것 이다.
    1. 집게와 함께 10 월 포위 뇌 조각을 수집 하 고 PBS (그림 2a)으로 가득 24-잘 접시의 우물에. LC는 소 뇌와 열 등 한 colliculus ~-5.52 mm bregma (그림 1b)의 후부에 서로 만날 때 가장 눈에 띄는 될 것입니다.
      참고: LC의 가장 앞쪽 부분에는 소 뇌 완전히 구분 하 고 더 이상 열 등 colliculus ~-5.34 mm bregma (그림 1c)의 후부에 주변 사라질 것 이다.

2. Immunohistochemistry 도파민 β-Hydroxylase 또는 티로신 Hydroxylase (그림 2)에 대 한

  1. 주 1
    1. PBS에서 5 분에 대 한 세 번 선택 된 분할 영역을 씻어.
    2. 0.5% 버퍼링 인산 염 세제 (PBSD) 4 ° c.에 24 h permeabilize
      1. 125 µ L 세제 25 mL PBS의에서 희석.
  2. 주 2
    1. 0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.
    2. 0.5%에서 1: 500의 희석에서 1 차적인 항 체, 안티 DBH 또는 안티-일 18 h 조에 대 한 추가 4 ° c.에 PBSD
  3. 3 일
    1. 0.5%에서 3 시간 10 분 대 한 슬라이스를 씻어 PBSD.
    2. 0.5%에서 1:1000의 희석에 원하는 이차 항 체 (488 당나귀 방지를 위한 토끼 녹색 형광) 추가 16 h에 대 한 PBSD.
    3. 알루미늄에 4 ° c.에서 24 잘 접시 포장
    4. 0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.
    5. PBS에서 5 분 동안 세척.
    6. 물 컨테이너에 연필 브러시와 분할 영역을 전송 합니다.
    7. 탑재 된 슬라이드에 물에 떠 있는 조각.
    8. (없이 DAPI) hard-set 설치 미디어 Coverslip 섹션입니다.
    9. 건조 실 온에서 30 분 동안 탑재 뇌 섹션.
    10. 설정을 적절 한 이차 항 체 fluorophore 파장에서 신호를 검출 하는 confocal 또는 형광 현미경에서 이미지 뇌 조각.
    11. 뇌 조각의 초점면에 현미경을 조정 하 고 단일 이미지를 10 배 확대에 걸릴.
    12. 찾으려면 가능한 LC 지역 두뇌 조각에서 사용 하십시오 4번째 심 실 방향; 소 뇌는 심 실 위에 위치 하 고 있으며, 폰 스 및 brainstem는30아래 발견 된다.
    13. LC를 찾으려면 4번째 심 실;의 측면 가장자리에 초점 4번째 심 실과 폰으로 포인트의 가장자리에서 유래 하는 LC / brainstem 지역 (그림 2b, 2c).
    14. 다음 이미징 및 특정 뇌 조각에 LC의 지역화 뇌 조각 4 ° c.에 포함 된 슬라이드 저장

3. 뇌 조각에 LC의 탐지

  1. 그림 2a와 같이 LC를 포함 하는 뇌 섹션, 찾아서, 위에서 설명한 대로 쥐의 뇌를 슬라이스 PBS에 섹션을 수집 24 잘 요리를 가득.
    1. LC의 적절 한 지역화 있도록 잘 당 하나 뇌 섹션을 배치 합니다.
  2. 뇌 당 immunostained 것 48 뇌 조각의 총을 수집 합니다.
    참고: 그림 2a 에 표시 된 두 개의 요리의 모든 우물 한 동물에서 뇌 조각 포함 됩니다.
  3. Immunostain DBH, 또는 목에 대 한 모든 제 3 5 조각 가급적, 수행 분석은 그에 인접 한 그 뇌 조각의 immunohistochemistry (x 선 형광 현미경 검사 법, XFM)를 통해 추가.
    참고:이 절차는 최종 분석 결과 조각에 LC의 정확한 지 방화에 대 한 수 있습니다 (그림 2a; 우물 사이의 숫자와 함께 표시).
  4. LC, 또는 그냥 거친 근사치의 가장자리와 센터의 정확한 위치를 필요로 하는 그들이 든 예를 들어, 응용 프로그램에 따라 immunostained는 뇌 조각 수를 조정 합니다.
  5. Immunohistochemistry, 다음 4번째 심 실 (그림 2b, 2c)의 양쪽에 식의 독특한 패턴을 통해 LC를 포함 하는 뇌 조각 검색. 그림 2d, 2e; 연속 뇌 조각의 lc DBH 신호의 확대 표시 됩니다. 일에 표시 스테인드 LC의 확대 이미지 그림 2f.
  6. 사용 하 여 섹션 추가 연구-그 포함 LC에 인접 한이 경우에 XFM에 대 한 계량 금속 수준 (그림 3).
  7. XFM 수행, 고분자 박막은 샘플 보유자에 장착 하 여 수는 싱크 로트 론에서 몇 군데에 10-30 µ m (설치)에 따라 얇은 코로나 두뇌 분할 영역을 수집 합니다.
  8. 실 온에서 XFM에 대 한 고분자 박막에 준비는 하 고 XFM 수행 두뇌 분할 영역을 저장 합니다.

4. 금속 이미징 XFM 통해 lc

  1. 위에서 설명한 예제 마우스 뇌를 슬라이스 하 고 결정 LC, LC를 포함 하는 이러한 뇌 조각에서 XFM 통해 금속 수준을 측정.
  2. 이미지 beamline 2 ID-전자에는 고급 광자 소스 (아르곤 국립 연구소, 아르곤 IL)에서 원소 배포판.
  3. '비행'에 데이터 기록31위에서 설명한 대로.
  4. LC 프로그램 지도32,33를 사용 하 여 포함 된 뇌 조각에 원소 농도 결정 합니다.

결과

변경 (예: Cu, Fe, Zn, 그리고 미네소타) 금속 항상성에서 LC34,35에 변화를 포함 한 신경학 적 장애에서 자주 관찰 된다. 따라서, 뇌의 금속 수준 결정은 질병 메커니즘의 이해를 위해 필요 합니다. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 뇌 섹션 잘라내기 및 LC에서 다른 금속 수준의 계량 LC 외부 지역에서 수준에 그들을 비교 하 사...

토론

제대로 방향을 표본이이 프로토콜의 중요 한 단계입니다. 우리를 사용 하는 뇌의 등 쪽 표면에의 해 부 기능 LC (소 뇌와 열 등 한 colliculus 사이 경계)를 찾을 수 있기 때문에 섹션 제대로 정렬 될 중요 하다. 이 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스로 뇌를 제대로 설정에 주의 해야 합니다. 앞쪽 및 후부 LC 핵 누락을 피하기 위해 더 많은 조직 ~ 500 μ m을 절단 하는 것이 좋습니다. 가장 일반적인 실수는 LC를 ?...

공개

없음입니다.

감사의 말

우리는 마우스 식민지의 유지 보수에 대 한 Abigael Muchenditsi 감사합니다. 아르곤 국립 연구소에서 고급 광자 소스를 사용 하 여 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호 아래에 의해 지원 되었다: 드-AC02-06CH11357. 우리 감사 올가 Antipova와 박사 스테판 Vogt 사용자 지원 및 고급 광자 소스에서 지원. 이 작품은 SL에 건강의 국가 학회 교부 금 2R01GM101502에 의해 투자 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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