АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Локус пятно — небольшое скопление нейронов, участвующих в различных физиологических процессов. Здесь мы описываем протокол для подготовки разделов мозга мыши для исследования белков и металлов в этом ядре.

Аннотация

Локус пятно (LC) является основным центром норадреналина, производства нейронов, которые модулируют ряд физиологических функций. Структурные или функциональные нарушения LC воздействие нескольких регионов мозга, включая кору, гиппокамп и мозжечке и может способствовать депрессии, биполярного расстройства, тревога, а также болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Эти заболевания часто связаны с металлическими дисбаланса, но лишь частично понимают роль металлов в LC. Морфологические и функциональные исследования LC необходимо лучше понять человека патологий и вклад металлов. Мышей являются широко используется Экспериментальная модель, но мыши LC небольшие (диаметром ~0.3 мм) и трудно определить для не эксперт. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол на основе иммуногистохимия локализовать ЛК в мозг мыши. Допамин β-гидроксилазы (дуг) и в качестве альтернативы, тирозин гидроксилазы (TH), оба фермента, сильно выражена в ЛК, используются в качестве иммуногистохимических маркеров в срезах головного мозга. Участков, прилегающих к LC-содержащие разделы могут использоваться для дальнейшего анализа, включая гистологию для морфологических исследований, метаболических тестирования, а также металлических изображений рентгеновской микроскопии флуоресцирования (XFM).

Введение

Локус пятно (LC) является важным регионом в ствол головного мозга и основных сайт производства норадреналина (NE)1. LC отправляет прогнозы во всем мозг2 коры, гиппокамп и мозжечке3 и регулирует основные физиологические процессы, включая Циркадный ритм4,5, внимания и памяти6, стресс,7,8когнитивные процессы и эмоции9,10. Дисфункция LC был вовлечен в неврологической и нервно-психических расстройств11, включая Паркинсона болезнь12,13,14, Альцгеймера болезнь14, депрессии15 ,16,17, биполярное расстройство18,19и тревоги20,21,,2223, 24. Учитывая эти роли, анализ LC имеет решающее значение для изучения ее функции и дисфункции.

Мышей широко используются для исследования процессов физиологического и патофизиологические. Из-за их малого размера мышь LC имеет средний диаметр ~ 300 мкм, привело к затруднению обнаружения структуры. При резании мозга, LC легко могут быть пропущены в коронковой или сагиттального секций. Имеющиеся исследования, описывающие Идентификация ЛК в животных не дают пошаговые протокол что non эксперт может следовать за1,25. Таким образом предложить руководство по локализации LC, мы описать протокол, который мы разработали, чтобы найти этот регион в мозг мыши для нескольких приложений (рис. 1, Рисунок 2, рис. 3). Протокол применяется тщательно контролируемых мозга секционирование и Иммуногистохимическое определение DBH26,27, или альтернативно й24, оба фермента высокообогащенного в LC28. После LC расположен по иммуногистохимия, фрагментов прилегающих мозга может использоваться для дальнейших исследований, в том числе Морфологические и метаболический анализ, а также металлических изображений исследования через рентгеновской флуоресценции микроскопии (XFM)29. Мы описываем XFM в качестве примера в настоящем Протоколе (рис. 3).

протокол

Исследования животных был одобрен уход животных университета Джонса Хопкинса и использования (ACUC) номер протокола M017M385.

1. мозг нарезки

  1. Для иммобилизации, анестезировать мышей приложением 3% изофлюрановая.
    1. Смочите ватный шарик с капли изофлюрановая и поместите его в пробки microcentrifuge 15 мл. Место нос животного в трубку и позволить ему вдыхать изофлюрановая. Проверка глубины анестезии, отсутствие реакции на мыс пинча.
  2. Поместите животное на спине и иммобилизации, закрепляя его конечностей с T pin имея доступ к ее живота.
  3. Вырезать животное с Ножницы хирургические, сделав СНиП от брюшной кожи и прорваться через кожу в области грудной клетки. Придавить кожи с помощью T булавки. Затем разделите перитонеальной мембраной до грудной клетки. Разоблачить сердце растрескивание грудной полости и резки диафрагмы.
  4. Вырежьте правого предсердия позволяют крови течь из животного. Вставьте шприц 10 мл с иглой 25-го калибра в левый желудочек и perfuse с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    Примечание: Это позволяет решение течь через кровообращения и выход через правое предсердие.
  5. Извлеките шприц 10 мл и вставьте 25-иглы придает 60 мл шприц. Perfuse через левого желудочка с 50 мл лед холодной параформальдегида 4% (PFA).
    1. Подготовить лед холодной PFA 4% раствор путем разбавления 10% раствор ПФА в H2O и охлаждения окончательное решение PFA 4% при 4 ° C.
  6. Изолируйте глава мыши и удалите мозг от черепа.
    1. Вырезать кожу от шеи, а затем вырезать на глаза, чтобы разоблачить черепа. Трещины черепа от шеи к носу, а затем от одного глазного яблока в другой. Пил черепа и акцизных весь мозг.
  7. Инкубировать мозга в 4% PFA для 24 ч при 4 ° C.
  8. Перенесите мозга с щипцами в 50 мл Конические трубки заполнены с 25 мл 30% раствора сахарозы. Держите его на 4 ° C в течение 48-72 ч, до тех пор, пока мозг тонет в нижней части трубки.
  9. Вырежьте мозг с взрослой мыши срез мозга матрица корональный через мозга (~ 3 мм задняя bregma). Держите мозга раздел, содержащий ствола мозга.
    Примечание: Это приведет к две секции мозга – один содержащие большую часть коры (переднего среза) и содержащий ствола мозга/мозжечок (заднего среза). Используйте раздел ствола мозга для следующих шагов.
  10. Внедрить секции ствола мозга с поверхности среза на нижней части встраивание формы, окруженный оптимального раскроя температура смеси (OCT); переместить встраиваемых мозга в морозильник-80 ° C и заморозить для по крайней мере 12 h – до дальнейшего использования.
  11. Резка на криостата: место, встраивание формы, содержащие мозга в OCT в криостата; Инкубируйте в криостата на несколько часов для регулировки температуры блока мозга, криостата.
  12. Удаляйте встраивание формы подвергать OCT блок, содержащий мозга.
  13. Используйте лезвия для удаления избытка OCT с поверхности блока без касатьться мозга.
  14. Смонтируйте блок октября на Чак криостат, подвергая поверхности среза головного мозга к передней.
  15. Отрегулируйте поверхности среза головного мозга, таким образом, чтобы оно ориентировано параллельно razorblades криостата.
  16. Трим мозга, начало в Продолговатый мозг, резка 100 мкм разделы рострально.
  17. Трим рострально пока мозжечка и ствола мозга сократить как один непрерывный срез. Начните сбор ломтиками толщиной 50 мкм.
    Примечание: Как рострально одной планки из продолговатого мозга, ствола головного мозга и мозжечке сократит как две отдельные секции. В ростральной секций ствола мозга и мозжечке сольются в конечном итоге на уровне 4й желудочек. После того, как боковые края 4й желудочек правильного формата, то мозжечка и ствола мозга выйдет как один непрерывный срез.
    1. Собирать OCT-окружении мозга срез с щипцами и поместите его в хорошо заполнены с PBS (Рисунок 2a) 24-ну плиты. Аккредитив будет наиболее известных, когда мозжечка и уступает colliculus встретиться друг с другом в ~-5.52 мм задняя bregma (рис. 1b).
      Примечание: Наиболее передней частью LC исчезнет, как только мозжечка был полностью секционного и больше не окружает уступает colliculus на ~-5.34 мм задняя bregma (рис. 1С).

2. иммуногистохимия для β-гидроксилазы допамина или тирозин гидроксилазы (рис. 2)

  1. 1 день
    1. Вымойте выбранных фрагментов три раза за 5 мин в PBS.
    2. Разрушения на 24 ч в 0,5%-фосфатный буфер с моющим средством (PBSD) при 4 ° C.
      1. Разбавьте 125 мкл концентрированного моющего средства в 25 мл ФСБ.
  2. День 2
    1. Вымойте ломтики три раза за 5 минут в 0,5% PBSD.
    2. Добавьте основное антитело, анти дуг или анти й для 18 h при разбавлении 1: 500 в 0,5% PBSD при 4 ° C.
  3. День 3
    1. Вымойте ломтики три раза за 10 минут в 0,5% PBSD.
    2. Добавьте требуемый вторичное антитело (488 осла анти кролик для зеленой флуоресценцией) в разведении 1: 1000 в 0,5% PBSD для 16 h.
    3. Оберните 24 хорошо плиты из алюминия и место при 4 ° C.
    4. Вымойте ломтики три раза за 5 минут в 0,5% PBSD.
    5. Мыть за 5 мин в PBS.
    6. Перевод фрагментов с помощью кисти карандаш в контейнер воды.
    7. Смонтируйте ломтиками, плавающие в воде на заряженных слайды.
    8. Coverslip разделы с СМИ hard-set монтажа (без DAPI).
    9. Сухие навесные мозга разделы для 30 мин при комнатной температуре.
    10. Срезы мозга изображения на конфокальный или флуоресцентный микроскоп с параметрами для определения сигнала от соответствующих вторичных антител Флюорофор волны.
    11. Отрегулируйте микроскопа в фокальной плоскости среза головного мозга и принять единое изображение при 10-кратном.
    12. Чтобы найти возможные региона LC срез головного мозга, используйте 4й желудочек для ориентации; Мозжечок расположен выше желудочков, Понс и ствола мозга находятся ниже30.
    13. Чтобы найти LC, сосредоточиться на боковые поверхности 4й желудочек; LC происходит от края 4й желудочек и баллы Понс / региона ствола мозга (рис. 2b, 2 c).
    14. После обработки изображений и локализации LC в некоторых срезов мозга Храните слайды, содержащие срезы мозга при 4 ° C.

3. Обнаружение LC в срезах головного мозга

  1. Чтобы найти мозга раздел, содержащий LC, срез мозга мыши, как описано выше и собирать секций в PBS заполнены 24 хорошо блюда, как показано на рисунке 2А.
    1. Поместите один раздел мозга за хорошо для правильной локализации LC.
  2. Соберите в общей сложности 48 срезы мозга, которые будут immunostained на мозг.
    Примечание: Все колодцы из двух блюд, показано на рисунке 2А содержат срезы мозга от одного животного.
  3. Имунноконтраст каждый третий – пятый фрагмент для дуг или тыс. Предпочтительно, выполняют иммуногистохимия тех срезов мозга, которые примыкают к тем, которые являются assayed далее (через рентгеновской микроскопии флуоресцирования, XFM).
    Примечание: Эта процедура позволяет для точной локализации LC в окончательный анализ фрагментов (Рисунок 2a; помечены чисел между скважинами).
  4. Отрегулируйте количество срезов мозга, которые immunostained в зависимости от приложения, например, ли они требуют точное местоположение центра города и края LC, или просто грубое приближение.
  5. После иммуногистохимии обнаружить срезы мозга, содержащий LC через характерный образец выражения обеих сторон 4го желудочка (рис. 2b, 2 c). Увеличение DBH сигнала в LC кусочков подряд мозга показан в 2d фигура, 2e; увеличенное изображение LC, что витражи для TH отображается в Рисунок 2f.
  6. В этом случае используйте разделы, прилегающих к этим содержащего LC для дальнейших исследований - для XFM для количественного определения металла уровни (рис. 3).
  7. Чтобы выполнить XFM, соберите 10-30 мкм (в зависимости от установки) тонких корональных мозга срезы на тонкой полимерной пленки, с которой они можно монтировать на держатели образца и образы на синхротронную.
  8. Хранить фрагменты мозга, которые готовятся на тонкой полимерной пленки для XFM при комнатной температуре и выполнять XFM.

4. металлические изображений в LC через XFM

  1. Срез мозга мыши пример, как описано выше, определить LC и измерения металлических уровней через XFM из этих кусочков мозга, содержащие LC.
  2. Изображения Элементаль дистрибутивов на излучение 2-ID-E в источнике Advanced Фотон (Аргоннской национальной лаборатории, Аргоннская IL).
  3. Запись данных «на лету» как описано ранее31.
  4. Определите элементарного концентрации в срезах мозга, содержащие LC, используя программу карты32,33.

Результаты

Изменения в металлических гомеостаза (например, Cu, Fe, Zn и Mn) часто наблюдаются в неврологических расстройств, включая изменения в ЛК34,35. Таким образом определение металла уровни в мозге необходим для понимания механизмов болезни. Мозга р?...

Обсуждение

Правильной ориентации образца представляет собой решающий шаг в этом протоколе. Потому что мы используем анатомические особенности поверхности спинного мозга, чтобы найти LC (граница между мозжечка и уступает colliculus), важно, что в разделах быть выровнены правильно. Это требует ухода в пр...

Раскрытие информации

Нет.

Благодарности

Мы благодарим Абигаэль Muchenditsi для поддержания колонии мыши. Использование передовых Фотон источника в Аргоннской национальной лаборатории была поддержана в Министерство энергетики США, управление науки, управление основные энергии наук, по контракту №: де-AC02-06CH11357. Мы благодарим Антипова Ольга и д-р Стефан Vogt для пользователей поддержки и помощи на источнике Advanced Фотон. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант 2R01GM101502 в SL.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

Ссылки

  1. Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
  2. Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
  3. Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
  4. Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
  5. Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
  6. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
  7. Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
  8. Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
  9. Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
  10. File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
  11. Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
  12. Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
  13. Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
  14. Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
  15. Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
  16. Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
  17. Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
  18. Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
  19. Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
  20. Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. Neuroscience. 373, 7-19 (2018).
  21. Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
  22. McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
  23. Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
  24. Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
  25. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
  26. Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
  27. Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
  28. Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
  29. Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
  30. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  31. Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
  32. Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
  33. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
  34. Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
  35. Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
  36. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145THATP7AATP7B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены