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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Locus coeruleus è un piccolo gruppo di neuroni coinvolti in una varietà di processi fisiologici. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di sezioni di cervello di topo per lo studio di proteine e metalli in questo nucleo.

Abstract

Locus coeruleus (LC) è un importante hub di norepinefrina producendo neuroni che modulano un numero di funzioni fisiologiche. Le anomalie strutturali o funzionali di LC parecchie regioni del cervello, compreso la corteccia, ippocampo e nel cervelletto di impatto e possono contribuire alla depressione, disturbo bipolare, ansia, così come la malattia di Parkinson e Alzheimer. Questi disturbi sono spesso associati con metallo disparità, ma il ruolo dei metalli in LC è solo parzialmente capito. Studi morfologici e funzionali di LC sono necessari per comprendere meglio le patologie umane e contributo dei metalli. I topi sono un modello sperimentale ampiamente usato, ma il mouse LC è piccolo (~0.3 mm di diametro) e difficile da individuare per un non-esperto. Qui, descriviamo un protocollo basato su immunohistochemistry passo-passo per localizzare la LC nel cervello del topo. Dopamina-β-idrossilasi (DBH) e in alternativa, tirosina idrossilasi (TH), entrambi gli enzimi altamente espressi in LC, sono usati come indicatori immunohistochemical nelle fette del cervello. Sezioni adiacenti alle sezioni contenenti LC possono essere utilizzati per ulteriori analisi, tra cui l'istologia per studi morfologici, test metabolici, così come formazione immagine di metallo da microscopia di fluorescenza di raggi x (XFM).

Introduzione

Locus coeruleus (LC) è una regione importante nel tronco cerebrale e un importante sito di produzione di noradrenalina (NE)1. Il LC Invia proiezioni in tutto il cervello2 la corteccia, l'ippocampo e il cervelletto3 e regola i principali processi fisiologici, tra cui ritmo circadiano4,5, attenzione e memoria6, sforzo7, processi cognitivi8e commozione9,10. Disfunzione di LC è stata implicata in patologie neurologiche e neuropsichiatriche11, compreso Parkinson malattia12,13,14, Alzheimer malattia14, depressione15 ,16,17, disturbo bipolare18,19e l'ansia20,21,22,23, 24. tenuto conto di questi ruoli, analisi di LC sono fondamentale per studiare la sua funzione e disfunzione.

Topi sono ampiamente utilizzati per lo studio di processi fisiologici e patofisiologici. A causa del loro di piccola dimensione, il mouse LC ha un diametro medio di ~ 300 μm, che porta a difficoltà a individuare la struttura. Durante il sezionamento del cervello, la LC può facilmente essere perso in sezioni coronali o sagittale. Disponibili studi che descrivono identificazione di LC in animali non offrono un protocollo passo-passo che un non-esperti possono seguire1,25. Così, per offrire una guida per la localizzazione di LC, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per individuare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Il protocollo si applica attentamente controllato cervello rilevamento di sezionamento e immunohistochemical di DBH26,27, o in alternativa TH24, entrambi gli enzimi altamente arricchiti nell' LC28. LC è individuato da immunohistochemistry, fettine di cervello adiacente possono essere utilizzati per ulteriori studi, compreso analisi morfologiche e metaboliche, come pure gli studi di formazione immagine del metallo tramite fluorescenza a raggi x microscopia (XFM)29. Descriviamo XFM come esempio in questo protocollo (Figura 3).

Protocollo

Gli studi degli animali è stato approvato dalla Johns Hopkins University Animal Care e uso (ACUC) protocollo numero M017M385.

1. cervello affettare

  1. Per immobilizzare, anestetizzare topi mediante l'applicazione di 3% isoflurane.
    1. Immergere un batuffolo di cotone con le gocce di isoflurane e inserirlo in un tubo del microcentrifuge da 15 mL. Posizionare il naso dell'animale nel tubo e consentirle di inalare l'isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia la mancanza di risposta a punta-pizzico.
  2. Metti l'animale sul dorso e immobilizzare e da appuntare le estremità verso il basso con un pin di T pur avendo accesso al suo addome.
  3. Tagliate l'animale con forbici chirurgiche facendo un elemento di cattura dalla pelle addominale e attraverso la pelle nella regione del torace. Fissare la pelle utilizzando perni T. Quindi rompere la membrana peritoneale fino al torace. Esporre il cuore di cracking della cavità toracica e il diaframma di taglio.
  4. Tagliare l'atrio destro per consentire al sangue di fluire fuori l'animale. Inserire una siringa da 10 mL con un ago di calibro 25 nel ventricolo sinistro e irrorare con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS).
    Nota: In questo modo la soluzione di fluire attraverso la circolazione sistemica e uscita attraverso l'atrio di destra.
  5. Rimuovere la siringa da 10 mL e inserire un ago di calibro 25 fissato alla siringa di 60 mL. Irrorare attraverso il ventricolo sinistro con 50 mL di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide (PFA).
    1. Preparare soluzione di ghiaccio fredda 4% PFA diluendo la soluzione PFA 10% in H2O e agghiacciante la soluzione finale di PFA 4% a 4 ° C.
  6. La testa del mouse di isolare e rimuovere il cervello dal cranio.
    1. Tagliare la pelle dal collo e poi tagliare verso gli occhi per esporre il cranio. Rompere il cranio dal collo al naso e poi da un bulbo a altro. Sbucciare il cranio fuori e asportare l'intero cervello.
  7. Incubare il cervello nel 4% PFA per 24 h a 4 ° C.
  8. Trasferire il cervello con il forcipe in una provetta conica 50 mL riempita con 25 mL di soluzione di saccarosio al 30%. Tiene a 4 ° C per 48-72 ore fino a quando il cervello scende fino al fondo del tubo.
  9. Tagliare il cervello con un'affettatrice di cervello di topo adulto coronale di matrice attraverso il mesencefalo (~ 3 mm posteriore di bregma). Mantenere la sezione del cervello che contiene il tronco cerebrale.
    Nota: Questo si tradurrà in due sezioni del cervello – uno contenente la maggior parte della corteccia (anteriore del taglio) e uno contenente il tronco cerebrale/cervelletto (posteriore del taglio). Utilizzare la sezione del tronco cerebrale per le fasi successive.
  10. Incorporare la sezione del tronco cerebrale con la superficie di taglio posizionata sul fondo di uno stampo di incorporamento, circondato da temperatura di taglio ottimale composto (ottobre); spostare il cervello incorporato in un congelatore a-80 ° C e congelare per almeno 12 h – fino al successivo utilizzo.
  11. Taglio al criostato: posto l'incorporamento di stampo contenente il cervello in OCT nel criostato; viene quindi incubato nel criostato per diverse ore regolare la temperatura del blocco del cervello a quello del criostato.
  12. Togliere lo stampo incorporamento per esporre il blocco di OCT contenente il cervello.
  13. Utilizzare lame di rasoio per rimuovere eccesso di OCT dalla superficie del blocco senza toccare il cervello.
  14. Montare il blocco di OCT il mandrino del criostato, esponendo la superficie di taglio del cervello verso la parte anteriore.
  15. Regolare la superficie di taglio del cervello in modo che è orientata in parallelo con le lamette del criostato.
  16. Tagliare il cervello partendo dal midollo, taglio 100 µm sezioni rostralmente.
  17. Tagliare rostralmente fino a quando il cervelletto e tronco cerebrale tagliato come una fetta di continua. Iniziare la raccolta di fette di spessore di 50 µm.
    Nota: Come uno Trim rostralmente dal midollo, il tronco cerebrale e del cervelletto taglierà come due sezioni separate. Nelle sezioni rostrale, tronco cerebrale e del cervelletto si fonderanno alla fine a livello del ventricoloth 4. Una volta i bordi laterali del ventricoloth 4 sono ben formati, allora il cervelletto e tronco cerebrale uscirà come una fetta di continua.
    1. Raccogliere la fetta di cervello OCT-circondato con una pinza e posizionarlo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempito con PBS (Figura 2a). Il LC sarà più prominente quando il cervelletto e il collicolo inferiore si incontra tra loro ~-5.52 mm posteriore di bregma (Figura 1b).
      Nota: La parte più anteriore della LC scomparirà una volta che il cervelletto è stato completamente sezionato e non circonda il colliculus inferiore alle ~-5.34 mm posteriore di bregma (Figura 1C).

2. esame immuno-istochimico per dopamina β-idrossilasi o tirosina idrossilasi (Figura 2)

  1. 1 ° giorno
    1. Lavare le fette selezionate tre volte per 5 min in PBS.
    2. Permeabilize per 24 h in soluzione salina tamponata con fosfato 0,5% con detersivo (Socialdemokrati) a 4 ° C.
      1. Diluire 125 µ l di detergente in 25 mL di PBS.
  2. 2 ° giorno
    1. Lavare le fette tre volte per 5 min in 0,5% Socialdemokrati.
    2. Aggiungere l'anticorpo primario, anti-DBH o anti-TH per 18 h a una diluizione di 1: 500 a 0,5% Socialdemokrati a 4 ° C.
  3. 3 ° giorno
    1. Lavare le fette tre volte per 10 min in 0,5% Socialdemokrati.
    2. Aggiungere l'anticorpo secondario desiderato (488 asino anti-coniglio per fluorescenza verde) ad una diluizione di 1: 1000 in 0,5% Socialdemokrati per 16 h.
    3. Avvolgere la piastra ben 24 in alluminio e posto a 4 ° C.
    4. Lavare le fette tre volte per 5 min in 0,5% Socialdemokrati.
    5. Lavare per 5 min in PBS.
    6. Trasferimento fette con un pennello in un contenitore di acqua.
    7. Montare fette che galleggia in acqua su vetrini caricati.
    8. Vetrino coprioggetti sezioni con mezzi di montaggio torvo (senza DAPI).
    9. Asciugare le sezioni di cervello montato per 30 min a temperatura ambiente.
    10. Fettine di cervello di immagine al microscopio confocale o fluorescente con impostazioni per rilevare il segnale dalla lunghezza d'onda fluoroforo anticorpo secondario appropriato.
    11. Regolare il microscopio per il piano focale della fetta del cervello e prendere una singola immagine a 10 ingrandimenti.
    12. Per individuare una possibile area di LC la fetta di cervello, usi il ventricoloth 4 per l'orientamento; il cervelletto è situato sopra il ventricolo, pons e tronco cerebrale si trovano sotto i30.
    13. Per individuare il LC, concentrarsi sui bordi laterali del ventricoloth 4; il LC proviene dai bordi del 4th ventricolo e punti verso il pons / regione del tronco cerebrale (fig. 2b, 2C).
    14. A seguito di imaging e localizzazione della LC in alcune fette di cervello, memorizzare diapositive contenenti fette di cervello a 4 ° C.

3. rilevazione della LC nelle fette del cervello

  1. Per individuare la sezione del cervello che contiene il LC, affettare il cervello di topo, come descritto in precedenza e raccogliere le sezioni in PBS riempito 24 piatti ben, come mostrato nella Figura 2a.
    1. Inserire una sezione del cervello per pozzetto per consentire la corretta localizzazione del LC.
  2. Raccogliere un totale di 48 fette di cervello che sarà immunostained al cervello.
    Nota: Tutti i pozzetti dei due piatti mostrati nella Figura 2a contengono fettine di cervello da un animale.
  3. Immunostain ogni fetta di terzo e il quinto per DBH, o th Preferibilmente, eseguire esame immuno-istochimico di quelli fette di cervello che sono adiacenti a quelle che sono dosati ulteriore (tramite microscopia di fluorescenza di raggi x, XFM).
    Nota: Questa procedura consente per la localizzazione esatta della LC nelle fette finale del dosaggio (Figura 2a; etichettati con numeri tra i pozzetti).
  4. Regolare il numero di fette del cervello che sono immunostained a seconda dell'applicazione, ad esempio, se richiedono la posizione esatta del centro e del bordo di LC, o solo un'approssimazione.
  5. A seguito di esame immuno-istochimico, rilevare fettine di cervello contenente LC tramite un caratteristico pattern di espressione su entrambi i lati del ventricoloth 4 (Figura 2b, 2C). Ingrandimento del segnale DBH a cristalli liquidi di fettine di cervello consecutivi è mostrato in figura 2d, 2e; l'immagine ingrandita della LC che è macchiata per TH è indicata nella Figura 2f.
  6. Utilizzare le sezioni adiacenti a quelli contenenti LC per ulteriori studi - in questo caso per XFM per quantificare i livelli del metallo (Figura 3).
  7. Per eseguire XFM, raccogliere fette sottili del cervello coronale di 10-30 µm (a seconda della configurazione) il film polimerico sottile con cui possono essere montati su supporti del campione e imaging presso il sincrotrone.
  8. Fettine di cervello di negozio che sono preparati in thin film polimerico per XFM a temperatura ambiente ed eseguire XFM.

4. metallo Imaging a cristalli liquidi via XFM

  1. Fetta di cervello di topo di esempio come descritto sopra, determinare LC e misurare i livelli di metallo tramite XFM da queste fette di cervello contenente la LC.
  2. Distribuzioni elementali, immagine su beamline 2-ID-E alla fonte di fotone avanzate (Argonne National Laboratory, IL Argonne).
  3. Registrare dati 'on the fly' come descritto in precedenza31.
  4. Determinare concentrazioni elementari nelle fette del cervello contenente la LC utilizzando il programma mappe32,33.

Risultati

Cambiamenti nell'omeostasi del metallo (ad esempio Cu, Fe, Zn e Mn) sono spesso osservati in disordini neurologici, compreso i cambiamenti nel LC34,35. Così, determinazione dei livelli del metallo nel cervello è necessario per la comprensione dei meccanismi di malattia. Le sezioni di cervello generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di Cu e altri metalli a cristalli liquid...

Discussione

Corretto orientamento del campione è un passo cruciale in questo protocollo. Perché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per individuare LC (confine tra cervelletto e collicolo inferiore), è importante che le sezioni vengano allineati correttamente. Questo richiede cura nella corretta impostazione del cervello nella matrice affettatrice del cervello del mouse. Si consiglia di tagliare ~ 500 μm più tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo. L'errore...

Divulgazioni

Nessuno.

Riconoscimenti

Ringraziamo Abigael Muchenditsi per la manutenzione della Colonia del mouse. Impiego della fonte del fotone avanzate all'Argonne National Laboratory è stata sostenuta da US Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto il numero di contratto: DE-AC02-06CH11357. Ringraziamo Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt per supporto utente e assistenza presso la fonte del fotone avanzate. Questo lavoro è stato finanziato dalla 2R01GM101502 di grant del National Institute of Health a SL.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

Riferimenti

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