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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Locus Coeruleus ist eine kleine Ansammlung von Nervenzellen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Maus Gehirn Abschnitte auf das Studium der Proteine und Metalle in diesem Kern vorzubereiten.

Zusammenfassung

Der Locus Coeruleus (LC) ist ein bedeutender Knotenpunkt von Noradrenalin produzierenden Neuronen, die eine Reihe von physiologischen Funktionen zu modulieren. Strukturelle oder funktionelle Anomalien der LC Einfluss auf verschiedene Gehirnregionen einschließlich Kortex, Hippocampus und Kleinhirn und können dazu beitragen, Depressionen, bipolare Störungen, Angst, sowie Morbus Parkinson und Alzheimer-Krankheit. Diese Erkrankungen sind häufig mit Metall Ungleichgewichtigkeit verbunden, aber die Rolle der Metalle in LC ist nur teilweise verstanden. Morphologische und funktionelle Studien von LC sind erforderlich, um besser zu verstehen, die menschliche Pathologien und den Beitrag von Metallen. Mäuse sind ein weit verbreitetes experimentelles Modell, aber die Maus LC ist klein (~0.3 mm Durchmesser) und schwer zu erkennen, für nicht-Experten. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt Immunohistochemistry-basiertes Protokoll um die LC im Gehirn Maus zu lokalisieren. Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), und Alternativ Tyrosin Hydroxylase (TH), beide Enzyme, die hoch in den LC ausgedrückt werden als immunhistochemischen Marker in Hirnschnitten verwendet. Abschnitte neben LC-haltigen Abschnitte können zur weiteren Analyse, einschließlich Histologie für morphologische Studien, Ergospirometrie, sowie Metall-Bildgebung von Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM) verwendet werden.

Einleitung

Der Locus Coeruleus (LC) ist eine wichtige Region im Hirnstamm und ein wichtiger Standort von Noradrenalin (NE) Produktion1. Die LC sendet Projektionen im gesamten Gehirn2 an den Kortex, Hippocampus und dem Kleinhirn3 und regelt wichtige physiologische Prozesse, einschließlich zirkadianen Rhythmus4,5, Aufmerksamkeit und Gedächtnis6, betonen Sie7, kognitive Prozesse8und Emotion9,10. Dysfunktion des LC hat in neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen11, darunter Parkinson Krankheit12,13,14, Alzheimer-Krankheit14, Depression15 verwickelt ,16,17, bipolare Störung18,19und Angst20,21,22,23, 24. Angesichts dieser Rollen, Analyse der LC ist entscheidend für seine Funktion und Dysfunktion zu studieren.

Mäuse sind für Untersuchungen physiologische und pathophysiologische Prozesse verbreitet. Aufgrund ihrer geringen Größe hat die Maus LC einen Durchmesser von ~ 300 μm, was zu Schwierigkeiten Auffinden der Struktur. Im Gehirn zu schneiden, kann LC im koronalen oder sagittale Abschnitte leicht übersehen werden. Verfügbare Studien beschreiben, Identifizierung von LC bei Tieren bieten kein Schritt für Schritt-Protokoll, dass ein nicht-Experte,1,25folgen kann. Also, um Leitlinien für die Lokalisierung von LC anbieten zu können, beschreiben wir eine Protokoll, die wir entwickelt, um diese Region im Gehirn Maus für mehrere Anwendungen (Abbildung 1, Abbildung 2, , Abbildung 3) zu finden. Das Protokoll gilt sorgfältig kontrollierten Gehirn-Schnitt und immunhistochemische Nachweis von DBH26,27, alternativ TH24, beide Enzyme hochangereichertes in der LC-28. Sobald LC von Immunohistochemistry befindet, können benachbarte Gehirnscheiben für weitere Studien, einschließlich der morphologischen und metabolische Analysen sowie Metall bildgebenden Studien über Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM)29verwendet werden. Wir beschreiben XFM als Vorbild in diesem Protokoll (Abbildung 3).

Protokoll

Studien von Tieren von Johns Hopkins Universität Animal Care und Nutzung (ACUC) Protokollnummer M017M385 gebilligt wurde.

1. Gehirn aufschneiden

  1. Um zu immobilisieren, Mäuse durch die Anwendung von 3 % Isofluran zu betäuben.
    1. Genießen Sie einen Wattebausch mit Tropfen Isoflurane und legen Sie sie in einem 15 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie das Tier Nase in das Rohr und lassen sie die Isofluran zu inhalieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Narkose durch den Mangel an Reaktion auf Zehe-Prise.
  2. Legen Sie das Tier auf dem Rücken und durch Festhalten der Extremitäten nach unten mit einem T-Pin beim Zugriff auf seinen Bauch zu immobilisieren.
  3. Das Tier mit einer chirurgischen Schere durch Herstellung eines Ausschnitts aus der Bauchhaut und schneiden durch die Haut in der Thorax-Region. Fassen Sie die Haut mit Hilfe der T-Pins aus. Dann brechen Sie die peritoneale Membrane bis zu den Brustkorb. Setzen Sie das Herz durch knacken der Brusthöhle und schneiden das Zwerchfell.
  4. Schneiden Sie den rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Tier heraus fließen. Legen Sie eine 10 mL Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel in die linke Herzkammer und durchspülen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    Hinweis: Dies kann die Lösung durch systemische Zirkulation und Ausgang fließen durch den rechten Vorhof.
  5. Entfernen Sie 10 mL Spritze, und fügen Sie eine 25-Gauge-Nadel an die 60 mL Spritze befestigt. Durch die linke Herzkammer mit 50 mL Eis kalt 4 % Paraformaldehyd (PFA) durchspülen.
    1. Bereiten Sie Eis kalt 4 % PFA Lösung durch H2O 10 % PFA Lösung verdünnen und kühlen die endgültige 4 % PFA Lösung bei 4 ° c
  6. Isolieren Sie den Kopf der Maus zu und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.
    1. Schneiden Sie die Haut vom Hals, und schneiden Sie dann auf die Augen des Schädels aussetzen. Knacken Sie den Schädel vom Hals, die Nase, und dann von einem Auge zum anderen. Schälen Sie den Schädel heraus und Verbrauchsteuern Sie das ganze Gehirn.
  7. Inkubieren Sie das Gehirn bei 4 % PFA für 24 h bei 4 ° C.
  8. Übertragen Sie das Gehirn mit der Pinzette in ein 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit 25 mL 30 % Saccharoselösung. Halten Sie es bei 4 ° C für 48-72 h, bis das Gehirn an das Ende der Röhre sinkt.
  9. Schneiden Sie das Gehirn mit einer erwachsenen Maus Gehirn Hobel Matrix koronalen durch das Mittelhirn (~ 3 mm Posterior des Bregma). Halten Sie die Gehirn-Abschnitt mit dem Hirnstamm.
    Hinweis: Dies führt im Gehirn zweiteilig – mit am meisten des Kortex (anterior des Schnittes) und eine mit dem Hirnstamm/Kleinhirn (Posterior des Schnittes). Verwenden Sie den Hirnstamm-Abschnitt für die folgenden Schritte.
  10. Einbetten des Hirnstamm-Abschnitts mit der Schnittfläche platziert auf der Unterseite ein Einbetten von Schimmel, umgeben durch optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzten (Okt); bewegen Sie das eingebettete Gehirn bis-80 ° C Gefrierschrank und Einfrieren für mindestens 12 h – bis zur weiteren Verwendung.
  11. Bei der Kryostat schneiden: Ort der Einbettung Schimmel mit dem Gehirn im Oktober in der Kryostat; inkubieren Sie es in den Kryostaten für mehrere Stunden, um die Temperatur des Gehirns Block mit derjenigen des Kryostaten anzupassen.
  12. Ziehen Sie die einbettende Form um den OCT-Block mit dem Gehirn verfügbar zu machen.
  13. Verwenden Sie Rasierklingen, um Überschuss an OCT von der Oberfläche des Blocks zu entfernen, ohne das Gehirn zu berühren.
  14. Montieren Sie die OCT-Block auf das Futter von den Kryostaten, Freilegung der Schnittfläche des Gehirns nach vorne.
  15. Einstellen Sie die Schnittfläche des Gehirns so, dass sie parallel zu den Rasierklingen Kryostaten ausgerichtet ist.
  16. Schneiden Sie das Gehirn, beginnend bei der Medulla, Rostral 100 µm Abschnitte schneiden.
  17. Schneiden Sie Rostral, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine kontinuierliche Scheibe geschnitten. Beginnen Sie bei 50 µm dicke Scheiben zu sammeln.
    Hinweis: Da eine Rostral aus der Medulla trimmt, Hirnstamm und Kleinhirn als zwei separate Abschnitte schneidet. Rostral abschnittsweise werden der Hirnstamm und Kleinhirn schließlich auf der Ebene der 4th Ventrikel verschmelzen. Sobald die seitlichen Ränder des 4th Ventrikels wohlgeformt sind, werden dann das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine kontinuierliche Scheibe kommen.
    1. Sammeln Sie OCT-umgeben Gehirn-Scheibe mit der Pinzette zu und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit PBS (Abbildung 2a) gefüllt. Die LC wird prominentesten das Kleinhirn und der minderwertigen Colliculus einander am ~-5.52 mm posterior des Bregma (Abbildung 1 b treffen).
      Hinweis: Der am vordere Teil des LC wird verschwinden, sobald das Kleinhirn vollständig geschnitten wurde und nicht mehr die minderwertigen Colliculus bei ~-5.34 mm posterior des Bregma (Abbildung 1 c umgibt).

(2) Immunohistochemistry für Dopamin-β-Hydroxylase oder Tyrosin-Hydroxylase (Abbildung 2)

  1. Tag1
    1. Waschen Sie die ausgewählten Scheiben drei Mal für 5 min in PBS.
    2. Permeabilize für 24 h in 0,5 % Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Reinigungsmittel (PBSD) bei 4 ° C.
      1. Verdünnen Sie 125 µL des Waschmittels in 25 mL PBS.
  2. Tag2
    1. Waschen Scheiben drei Mal für 5 min in 0,5 % PBSD.
    2. Fügen Sie die primären Antikörper, Anti-DBH oder Anti-TH 18 h bei einer Verdünnung von 1: 500 in 0,5 % PBSD bei 4 ° C.
  3. Tag3
    1. Waschen Scheiben drei Mal für 10 min bei 0,5 % PBSD.
    2. Fügen Sie die gewünschten Sekundärantikörper (488 Esel Anti-Kaninchen für grüne Fluoreszenz) bei einer Verdünnung von 1: 1000 in 0,5 % PBSD für 16 h.
    3. Wickeln Sie die 24-well-Platte in Aluminium und Platz bei 4 ° C.
    4. Waschen Scheiben drei Mal für 5 min in 0,5 % PBSD.
    5. Für 5 min in PBS waschen.
    6. Scheiben mit einem Bleistift Pinsel in einen Wasserbehälter zu übertragen.
    7. Montieren Sie Scheiben im Wasser auf aufgeladene Folien.
    8. Deckglas Abschnitte mit hart eingestellt Montage Medien (ohne DAPI).
    9. Trocknen Sie die montierten Gehirn Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.
    10. Bild Gehirnscheiben am konfokalen oder fluoreszierende Mikroskop mit Einstellungen Signal von entsprechenden Sekundärantikörper Fluorophor Wellenlänge erkennen.
    11. Passen Sie das Mikroskop auf der Brennebene des Gehirns Slice und nehmen Sie ein einzelnes Bild bei 10-facher Vergrößerung.
    12. Um eine mögliche LC-Region im Gehirn-Scheibe zu finden, verwenden Sie die 4th Ventrikel zur Orientierung; Das Kleinhirn befindet sich oberhalb der Ventrikel, Pons und Hirnstamm unter30gefunden werden.
    13. Um die LC zu finden, konzentrieren Sie sich auf die seitlichen Ränder des Ventrikels 4th ; die LC stammt von den Rändern der 4th Ventrikel und zeigt in Richtung der Pons / Hirnstamm Region (Abb. 2 b, 2 c).
    14. Folgenden Bildgebung und Lokalisierung der LC in bestimmten Gehirnscheiben speichern Folien mit Gehirnscheiben bei 4 ° C.

3. Erkennung der LC in Hirnschnitten

  1. Suchen den Gehirn-Abschnitt enthält die LC, das Gehirn der Maus in Scheiben schneiden, wie oben beschrieben und sammeln Abschnitte mit PBS-Puffer gefüllt 24 gut Speisen, wie in Abbildung 2agezeigt.
    1. Platzieren Sie ein Gehirn Abschnitt pro Bohrloch, um die korrekte Lokalisierung der LC zu ermöglichen.
  2. Insgesamt 48 Gehirnscheiben, die Immunostained pro Gehirn werden zu sammeln.
    Hinweis: Die Brunnen von den beiden Gerichte, dargestellt in Abbildung 2a enthalten Hirnschnitten von einem Tier.
  3. Immunostain jede dritte bis fünfte Scheibe für DBH oder th Führen Sie vorzugsweise Immunohistochemistry diese Gehirn-Scheiben, die an diejenigen, die untersucht werden (per Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie, XFM) weiter.
    Hinweis: Dieses Verfahren kann für die genaue Lokalisierung der LC in die endgültige Assay-Scheiben (Abbildung 2a; mit Zahlen zwischen den Wells beschriftet).
  4. Passen Sie die Anzahl der Gehirnscheiben, die Immunostained je nach Anwendung, z. B., ob sie genaue Position der Mitte und Rand des LC oder nur eine grobe Annäherung erfordern.
  5. Erkennen Sie nach Immunohistochemistry Gehirnscheiben mit LC über ein charakteristisches Muster des Ausdrucks auf beiden Seiten der 4th Herzkammer (Abb. 2 b, 2 c). Vergrößerung des DBH-Signals im LC von aufeinander folgenden Gehirnscheiben zeigt Abb. 2d, 2e; das vergrößerte Bild des LC, die befleckt ist TH in dargestellt ist Abbildung 2f.
  6. Mithilfe der Abschnitte neben diesen mit LC für weitere Studien - in diesem Fall für XFM, um Metall Niveaus (Abbildung 3) zu quantifizieren.
  7. Um XFM durchzuführen, sammeln Sie 10-30 µm (je nach Konfiguration) dünne koronalen Gehirnscheiben auf Polymeren Dünnschicht mit dem können sie auf Probenhalter montiert und abgebildet am Synchrotron.
  8. Speichern Sie Gehirnscheiben die sind vorbereitet auf Polymeren Dünnschicht XFM bei Raumtemperatur und XFM.

(4) Metall Bildgebung in der LC über XFM

  1. Schneiden Sie Gehirn der Maus Beispiel in Scheiben, wie oben beschrieben, bestimmen Sie LC zu und Messen Sie Metall über XFM aus diesen Gehirnscheiben mit der LC.
  2. Bild elementare Ausschüttungen auf Strahlrohr 2-ID-E auf der Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, Argonne IL).
  3. Aufzeichnen von Daten "on the Fly" bereits31beschrieben.
  4. Elementare Konzentrationen in Hirnschnitten, enthält die LC mit dem Programm Karten32,33zu bestimmen.

Ergebnisse

Änderungen in Metall Homöostase (z. B. Cu, Fe, Zn und Mn) werden oft in neurologische Störungen, einschließlich Änderungen in der LC-34,-35beobachtet. So ist die Bestimmung von Metall-Spiegel im Gehirn notwendig für das Verständnis der Krankheitsmechanismen. Die Gehirn-Abschnitte mit den beschriebenen Protokoll generiert können zur Quantifizierung der Ebenen von Cu und anderen Metallen in der LC und im Vergleich zu den Ebe...

Diskussion

Richtig ausrichten der Probekörpers ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwendest, um LC (Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigen Colliculus) zu finden, ist es wichtig, dass die Teile richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei richtig einstellen das Gehirn in die Maus Gehirn Schneidemaschine Matrix. Es wird empfohlen, ~ 500 μm mehr Gewebe schneiden, Front- und Seitenzahnbereich, LC zu vermeiden, den Zellkern fehlt. Der ...

Offenlegungen

nichts.

Danksagungen

Wir danken Abigael Muchenditsi für die Wartung der Maus Kolonie. Verwendung von Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory wurde unterstützt von der US-Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften, unter Vertragsnummer: DE-AC02-06CH11357. Wir danken Olga Antipova und Dr. Stefan Vogt für User-Support und Unterstützung bei der Advanced Photon Source. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant 2R01GM101502 SL finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

Referenzen

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