Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

Resumen

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EVs), incluyendo exosomas, son especializadas membranosas vesículas de tamaño nanométrico encontradas fluidos corporales que son constitutivamente liberados de muchos tipos de células y desempeñan un papel fundamental en la regulación de la comunicación de la célula y una amplia gama de procesos biológicos. Se han descrito muchos métodos diferentes para la caracterización de los vehículos eléctricos. Sin embargo, la mayoría de estos métodos tienen la desventaja que la preparación y caracterización de las muestras son muy desperdiciador de tiempo, o es muy difícil analizar los marcadores específicos de interés debido a su tamaño pequeño y debido a la falta de discreta poblaciones. Mientras que los métodos para el análisis de los vehículos eléctricos se han mejorado considerablemente durante la última década, todavía no hay ningún método estandarizado para la caracterización de EV solos. Aquí, demostramos un método semiautomático para la caracterización de los vehículos eléctricos solo por el análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. El protocolo que se presenta aborda el problema común de muchos investigadores en este campo y proporciona el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de EVs y caracterización con PKH67, un enlazador de membrana celular general, así como con marcadores superficiales específicos tales como CD63, CD9, vimentina y proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (lámpara-1). Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad, confirmado por otros métodos, como el Western blot. En los experimentos realizados, utilizamos exclusivamente EVs aisladas de muestras de suero humano, pero este método también es conveniente para plasma u otros fluidos corporales y puede ajustarse para la caracterización de los vehículos eléctricos de sobrenadantes de cultivo celular. Independientemente de los progresos futuros de la investigación en biología EV, el protocolo que aquí se presenta ofrece un método rápido y confiable para la caracterización rápida de vehículos eléctricos solo con marcadores específicos.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EVs), incluyendo exosomas, son especializadas membranosas nano-clasificadas vesículas (20-150 nm) que contenga ciertas combinaciones de lípidos, adhesión y moléculas de señalización intercelulares, así como otros componentes citosólicas funcionales como microRNA (miRNA) y mRNA y juegan un papel fundamental en la regulación de la célula comunicación^1,2. EVs se liberan en su entorno de muchos diferentes tipos de células, por ejemplo, las células endoteliales, células inmunitarias y las células del tumor y puede detectarse en los fluidos corporales como semen de suero, orina, leche materna, saliva o líquido cefalorraquídeo^{3, 4}. creciente número de estudios destaca la contribución diversa de vehículos eléctricos como posibles biomarcadores para el diagnóstico precoz de varias enfermedades o predicción de progresión de la enfermedad^5,6. Exosomas son descritos a menudo por la presencia de moléculas que se asocian específicamente, independientemente del tipo de células que derivan de⁷. Por ejemplo, exosomas contienen diferentes tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), importante clase complejo de histocompatibilidad I (MHC I) moléculas, diversas proteínas transmembranales, típico proteínas citosólicas (tubulina y actina), moléculas implicadas en cuerpo multivesicular ( Biogénesis MVB) TSG101 y alix, calentar las proteínas de choque (HSP 70 y HSP 90), y proteínas que participan en la señal de transducción de señales (proteínas quinasas)⁸.

Se han descrito muchos métodos diferentes para la caracterización de EVs⁹. Los métodos más comunes y frecuentes para el análisis de EV son flujo cytometry¹⁰, análisis de microscopia electrónica (SEM) y transmisión de microscopía electrónica (TEM)¹¹. El método mejor y comúnmente utilizado para la caracterización bioquímica de los contenidos de EV es Western Blot^12,13. Mientras que SEM y TEM permiten la detección de los vehículos eléctricos en todo el espectro de todo tamaño, la escasa identificación de proteínas específicas de la superficie es una desventaja particular de estos métodos. En cambio, citometría de flujo es una herramienta poderosa para la identificación de marcadores de superficie específicos EV, pero el umbral de este método limita el análisis a EVs con un tamaño mayor a 500 nm. Por lo tanto, análisis de los vehículos eléctricos aislados con la detección de marcadores de superficie específicos actualmente no es accesible a través de cualquiera de estos tres métodos bien establecidos. Describimos previamente otro método muy sensible para la visualización y análisis de los vehículos eléctricos, análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)¹⁴. Brevemente, este método combina dos principios físicos diferentes. En primer lugar, las partículas dispersan la luz cuando son irradiadas con un rayo láser, y el segundo principio, conocido como movimiento browniano, implica que la difusión de diversas partículas en una suspensión líquida es inversamente proporcional a su tamaño. El instrumento de análisis semiautomático nanopartículas escritorio para muestras líquidas consiste en el rastreo analizador con un análisis basado en el software, donde se registran imágenes digitales de luz dispersada de las partículas individuales de partículas. Las partículas y el movimiento de las partículas se detectan por un microscopio de dispersión láser con una cámara de vídeo. El rayo láser está orientado verticalmente, mientras que el eje óptico es horizontal y centrada en el canal de célula llenado con la muestra. Los datos proporcionados por parcelas de dispersos puntos de luz y su velocidad de movimiento permiten la determinación de la distribución de tamaño y conteo de partículas total. Después de la irradiación con el láser, las partículas dispersan la luz, que es grabada por una cámara de vídeo digital mediante el microscopio¹⁴. El avance a nuestro método anterior es la inserción de un filtro de corte de paso de onda larga (LWP) 500 nm entre el láser (longitud de onda de 488 nm) y el canal de la célula, que permite el análisis directo de las partículas marcados con fluorescencia (figura 1). Nuestro protocolo dirige la demanda común de muchos investigadores en este campo para una caracterización rápida de vehículos eléctricos individuales, por ejemplo, según su origen parental. En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de los vehículos eléctricos de la sangre entera humana y rápida caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basadas en fluorescencia. EVs puede detectarse mediante tinción con PKH67, un enlazador de membrana celular general, así como con marcadores exosomal específicos, por ejemplo, CD63, CD9 y vimentin. Nuestro protocolo es también conveniente para EDTA y plasma citratado, así como otros fluidos corporales y sobrenadantes de cultivo celular.

Protocolo

Comité ética institucional de la Universidad de Dusseldorf ha aprobado los experimentos presentados en este trabajo (número de referencia: 3381).

1. EV aislamiento de sangre humana

1. Aislar EVs con la solución de precipitación de exosomas.
   1. Recolectar 2 mL de sangre entera humana en suero separa tubos (SST) a través de venopunción e incubar los tubos durante 15 min a temperatura ambiente (RT) hasta que termine la coagulación.
   2. Centrifugue el SST a 1.700 x g por 10 min a temperatura ambiente para separar las células del suero y transferir 1 mL del suero a un tubo de reacción de 1,5 mL. Centrifugar el plasma rico en plaquetas (PRP) a 3.000 x g durante 15 min a 4 ° C para quitar las plaquetas y transferir 100 μL del plasma pobre en plaquetas (PPP) a un nuevo tubo de reacción de 1,5 mL.
   3. Añadir 25 μl de solución de precipitación de exosomas (PPP de 4 partes, 1 parte exosomas precipitación solución) y agitar bien. Incubar la muestra durante 30 minutos en hielo. Mantener el tubo en posición vertical y gire ni mezclar el tubo durante el período de incubación.
   4. Centrifugar la muestra a 1.500 x g durante 30 min a 4 ° C para que sedimenten lo EVs. Después de la centrifugación, el servicio voluntario europeo aparece como una pelotilla blanca o beige en la parte inferior de la embarcación. Aspirar el sobrenadante y Centrifugue la muestra a 1.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
   5. Eliminar los restos de fluido y vuelva a suspender el sedimento en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) transfiriendo con frecuencia hacia arriba y hacia abajo. Guarde la suspensión EV a-80 ° C cuando el análisis no se realizaron inmediatamente.
      Nota: Al aislar EVs de plasma, el fibrinógeno y la fibrina pueden impedir la recuperación eficiente y resuspensión es más pesado y requiere más tiempo.
2. Aislar EVs con ultracentrifugación.
   1. Tomar el rotor previamente enfriado (TLA-55 fijo ángulo) de la nevera y enfríe la ultracentrífuga antes de su uso.
   2. Transferir 1.25 mL de PPP (preparado en el paso 1.1) a un tubo de ultracentrifugación adecuado de 1,5 mL con tapa y centrifugar la muestra a 110.000 x g durante 90 minutos a 4 ° C. Asegúrese de que la carga de rotor es equilibrada antes de comenzar.
   3. Decantar el sobrenadante y lugar tubo boca abajo sobre una toalla de papel de 2 minutos volver a suspender el sedimento en 500 μL de PBS y Centrifugue la muestra a 110.000 x g durante 90 minutos a 4 ° C.
   4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 μL de PBS.
      Nota: Use solamente los rotores y accesorios diseñados para la ultracentrífuga que está en uso. Pretest los tubos en el rotor mediante el uso de agua porque la fuerza de los tubos puede variar entre lotes.

2. tinción de las muestras

1. Mancha de las muestras con PKH67.
   1. Prepare la solución de tinción mediante la adición de 1 μL de la solución de colorante etanol PKH67 a 50 μL de diluyente C (incluido en el kit) en un tubo de reacción de 1,5 mL y mezcle bien.
   2. Transferir 10 μL de la solución de tinción a 20 μL de la suspensión de la EV (preparada en el paso 1.1) en el tubo de reacción, mezcle bien e incube durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   3. Diluir 50 μL de la suspensión de EV manchada con 2,5 mL de agua destilada en un tubo de ensayo de 15 mL, mezclar bien y utilizar esta suspensión final para la medición de partículas.
      Nota: Es fundamental utilizar el agua como diluyente para la suspensión de EV, porque otros diluyentes (e.g., PBS) pueden afectar la medición. Cuando usar almacenado EV-suspensión, descongelar las muestras en hielo y mezclar bien antes de la tinción.
2. Mancha de las muestras con anticuerpos específicos.
   1. Diluir 10-20 μL de la suspensión de EV (preparada en el paso 1.1) con 50 μL de agua destilada en un tubo de reacción de 1,5 mL y mezcle bien.
   2. Agregar 2.5-5 μL del anticuerpo específico (tabla 1) para el tubo de reacción, homogeneizar e incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   3. Transferir 50 μL de la suspensión de EV manchada al 2.5-10 mL de agua destilada (cuadro 1) en un tubo de ensayo de 15 mL, mezclar bien y utilizar esta suspensión final para la medición de partículas.
      Nota: En algunas circunstancias, la concentración del anticuerpo usado debe estar ajustado (cuadro 1).

3. procesamiento de las muestras

Nota: Los fundamentos de este método extensamente fueron descritos previamente y por debajo de los focos de protocolo en los pasos específicos necesarios para el análisis de fluorescencia marca EVs¹⁴.

1. Realizar el procedimiento de inicio.
   1. Empuje el filtro de la fluorescencia en la trayectoria óptica del microscopio y cámara. Inicie el programa y siga las instrucciones en la pantalla de ejecución automática.
   2. Seleccione el número correcto de la célula (Z158_C1149_Fluor) en la pestaña "Comprueba la célula" (definición de la célula) para medición de fluorescencia. Seleccione la posición de referencia para la óptica para asegurarse de que el láser y microscopio están en un foco común (láser y microscopio hacia esta posición automáticamente).
   3. Lavar el canal de células con una jeringa llenada con 10 mL de agua destilada. Asegúrese de que la célula de medición está libre de burbujas de aire y no inyectar burbujas de aire en el sistema.
   4. Preparar una suspensión de calibración que contiene 200 nm Tamaño marcado con fluorescencia poliestireno partículas uniformes que tienen grupos carboxilato en su superficie. Diluir 10 μL de las partículas con 990 μL de agua destilada. Luego diluir 10 μL de esta solución de partículas en un tubo de 15 mL con 10 mL de agua destilada para obtener la concentración requerida.
   5. Inyectar 2,5 mL de la solución diluida de partículas en el canal de la celda y haga clic en "Optimizar el enfoque" para ajustar la cámara.
2. Medir la muestra.
   1. Canales a ras de la celda varias veces con una jeringa llenada con 10 mL de agua destilada antes de cada medición de la muestra. Inyectar la suspensión teñida de EV (preparada en el paso 2) en el canal de la célula.
   2. Ajustar los siguientes parámetros de la cámara principal en la pestaña "Célula Check" en el software necesario (tabla 2). Use la posición de referencia o posición 0.41193 para ajustar los parámetros.
      1. Sensibilidad, encontrar el rango de sensibilidad óptimo haciendo clic en el botón "Número de partículas vs sensibilidad" para mostrar una curva de partículas medidas por pantalla para niveles de sensibilidad diferentes.
         Nota:
      2. Para el obturador, ajuste el período de tiempo que la cámara permite que la luz de un intervalo determinado.
      3. Después de la adquisición de parámetros, elija un brillo mínimo de 20, un tamaño mínimo de 20 nm y un tamaño máximo de 500 nm para la medida.
   3. Tenga en cuenta el número de partículas detectadas en el campo de visión de la pantalla. La barra de dispersión debe estar en el verde a naranja gama (partículas de 50-300). Si la barra de dispersión es de color roja, la dispersión fusionan las partículas individuales y se cuentan como una sola partícula, lo que conduce a resultados falsos. En tal caso, además de diluir la muestra para evitar la superposición de las partículas o bajar la sensibilidad.
   4. Haga clic en "Check partícula deriva en 0 V" en la pestaña de "Célula Check" antes de comenzar la medición. Si la deriva es mayor que 5 μm/s, espere hasta que la muestra deje de fluir para continuar la medida.
      Nota: Si la deriva es demasiado alta al principio de la medición, las mediciones repetidas pueden diferir y sophisticate los resultados. Debido a los principios subyacentes de NTA, una deriva pertinente puede tener un impacto en el tamaño de partícula determinado, calculado por el software.
   5. Haga clic en "Ejecutar adquisición de vídeo" en la ficha de "Medición" Seleccione el número de experimentos (3-5) y el tiempo de retardo entre ellos (0 min).
   6. Definir el número de posiciones (cada Subvolumen-) (11) y el número de ciclos (medida) (10) en cada posición de medida, donde las partículas deben ser analizadas
   7. Seleccionar una carpeta, crear un nuevo nombre de archivo y haga clic en "Aceptar" para iniciar la medición.

4. interpretación de los resultados

1. Ver los resultados y parámetros en la pestaña "Análisis" después de la medición. Compruebe los siguientes parámetros tras el análisis antes de limpiar el canal celular: número promedio de partículas por posición, el número total de partículas trazadas y concentración de partículas, la anchura de la distribución de las partículas (valores x10, x50 y x90), valor de media y desviación estándar. Repita la medición de la muestra si es necesario.
   Nota: Los resultados también se guardan como un archivo .pdf o .txt.
2. Haga clic en la pestaña "Análisis" para ver el gráfico calculado después de la medida, que muestra la distribución de las partículas detectadas por tamaño. Haga clic en "Pantalla" en la pestaña "Análisis" y utilice los iconos para ajustar y cambiar la configuración de gráfico para requisitos particulares.

5. validación vía EV detección por Western Blotting

1. Disolver el precipitado de EV (preparado en el paso 1) en buffer de lisis y extracción RIPA, Pipetear cuidadosamente e incubar en hielo durante 30 minutos, centrifugar la muestra a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C para aclarar el lisado y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
2. Medir la proteína total por un kit de análisis de la proteína de Lowry. Diluir 1 μL de la suspensión de EV aislada con 49 μL de tampón RIPA y uso 5 μL en triplicado para el análisis. Diluir la suspensión de la EV con 2 buffer de carga x Laemmli a una concentración final de 2 μg/μL y el calor durante 10 minutos a 95 ° C.
3. Carga 20 μg de proteína por pozo. Separe y transferencia de las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida y tanque borrar según protocolos estándar.
4. Bloquear la membrana (difluoruro de polivinilideno de 0,2 μm) con bovina leche en polvo (5%) por 1 h a RT e incubar la membrana con anticuerpos primarios específicos (CD9, CD63 y vimentin) durante la noche a 4 ° C.
   Nota: Los anticuerpos primarios se utilizan a una dilución de 1:1,000.
5. Lavar la membrana con TBST 3 x 5 min y se incuba la membrana con peroxidasa de rábano (HRP)-anticuerpo secundario conjugado (1:20, 000 en TBST) durante 60 min a TA.
6. Lavar la membrana con TBST 3 x 5 min y detectar las proteínas por quimioluminiscencia con una solución de sustrato de alta sensibilidad en un sistema de proyección de imagen.
   Nota: Porque CD63 antígeno es ampliamente variable glucosilada, el peso molecular pueden variar y pueden aparecer bandas entre 40-65 kDa.

Resultados

EVs fueron aislado de sangre y se caracteriza por nanopartículas seguimiento análisis con reactivos fluorescentes. La sensibilidad óptima para la medición de partículas sin manchas fue identificada a gama al 70% en nuestros experimentos. Los granos fluorescentes utilizados para ajuste y calibración de la medición mostraron un ajuste óptimo con una sensibilidad de 85% (figura 2A). Entre una sensibilidad de 70% y 90%, el número de partículas detectadas aumentó rápidamente, mientras que aumentando la sensibilidad puede conducir a un deterioro de la distribución de tamaño de partícula donde el número de partículas es volver a caer. La configuración de la cámara muestra un cuadro agudo (figura 2B) y repite las mediciones demostradas la baja desviación estándar (figura 2). En la medida, el protocolo para el procesamiento de las muestras de los vehículos eléctricos se ajustó para que todas las medidas podrían llevarse a cabo con la misma configuración (tabla 2). La anchura de la distribución está definida por tres valores en el eje x, el x10, x50 y x90. El x50, o tamaño de partícula media es el diámetro en el que la mitad de la población se encuentra por debajo de este valor. Del mismo modo, el x10 y x90 indican el diámetro en el que 10% y el 90% de las partículas detectadas están bajo el tamaño reportado. La coloración con kit de vinculador de células PKH67, incluyendo a un enlazador de célula fluorescente que incorpora un pigmento fluorescente verde con cola larga alifático en las regiones de lípidos de la membrana celular, demostró una fuerte correlación entre la sensibilidad y el número de partículas de medición (Figura 3A). PKH67 es de uso frecuente para el control de la proliferación, pero también ha demostrado ser útil para el control de absorción exosomas o liposomas, así como para en vivo de la célula trata. Debido a la no específica de etiquetado de PKH67, una amplia variedad de EVs puede etiquetada y detectada. La distribución de las partículas estaba en un rango entre 266 nm (x10) y 1946 nm (x90) con un pico máximo en 857 nm (x50) y con una baja desviación estándar entre las mediciones (28.1 nm). LÁMPARA-1, también conocida como glicoproteína de la membrana lisosoma-asociada 1 y CD107a residen principalmente a través de las membranas lisosomales. Después de la coloración con una Alexa Fluor 488 etiquetados anticuerpo específico contra lámpara-1, la distribución de las partículas oscila entre 220 nm nm (x10) a 1145 (x90) con un pico máximo a 541 nm (x50) y una desviación estándar de 11,7 nm (figura 3B). Para la caracterización de los vehículos eléctricos, se utilizó Alexa Fluor 488 etiquetado anticuerpos contra marcadores de exosomal común y confirmaron los resultados por Western blot. Después de la tinción con CD9-anticuerpo marcado con Alexa Fluor 488, la distribución de las partículas oscila entre 251 nm nm (x10) a 1139 (x90) con un pico máximo a 548 nm y un segundo pico menor en aproximadamente 25 nm (Figura 4A). Tinción con Alexa Fluor 488 etiquetado CD63 (Figura 4B) y vimentina (figura 4) rindió resultados similares. Western Blot análisis comprobar nuestro resultado positivo para anticuerpos utilizados aquí. Medidas repetidas mostraron resultados reproducibles para todos los anticuerpos utilizados en este informe. Como controles, mancharon agua libre de vesícula con los anticuerpos respectivos (figura 5A), donde los anticuerpos PKH67 y LAMP1 no detectados prácticamente ningún EV hasta una sensibilidad cercana al 100%. Utilizando el ejemplo del vimentin, alta sensibilidad aumentó el número de objetos emergentes, aun cuando la muestra es esencialmente libre de partículas. Si medición se inicia cuando la deriva todavía es demasiado alta (> 5 μm/s), las repeticiones individuales se desvían claramente entre sí (figura 5B). Representado con tres diversos anticuerpos, es crucial que la deriva es tan mínima como sea posible antes de iniciar la medición. Según nuestra experiencia, con isotiocianato de fluoresceína (FITC) como fluorocromo resultados en las mediciones que no son precisos y reproducibles porque FITC es propenso a la rápida foto de blanqueo (figura 5). Por lo tanto, se recomienda utilizar exclusivamente Alexa Fluor 488 etiquetado anticuerpos para caracterización de EV. En este protocolo, EVs fueron aislado mediante una solución de precipitación de exosomas basados en polímeros que contienen glicol de polietileno. Para asegurar que nuestros resultados no se falsifican por el método de aislamiento aplicado, nos caracteriza EVs después aislamiento con ultracentrifugación. Representada con dos anticuerpos diferentes (CD63 y lámpara-1) y PKH67, los resultados de nuestro aislamiento aplicado con solución de precipitación de exosomas (figura 6A) son comparables con EVs aislado mediante ultracentrifugación (Figura 6B ). Desafortunadamente, debido a la pobre producción de EVs después de la ultracentrifugación, el conjunto inicial de suero para el aislamiento debe ser claramente superior comparado con aislamiento con la solución de precipitación de exosomas.

Figura 1: configuración esquemática de la nanopartícula seguimiento análisis. La viga de eje y láser de microscopio y vídeo están orientados ortogonalmente uno al otro, cruzando en la célula sección transversal del canal. Un filtro de la fluorescencia se coloca entre el canal de la célula y el microscopio. Luz dispersada por las partículas se muestra en la ventana de "vista en vivo" del software. Después de la adquisición, los resultados se muestran como un sistema de coordenadas de la curva de distribución de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: calibración con fluorescencia etiquetada cuentas. (A) el número de partículas vs sensibilidad la curva muestra las partículas en una posición en un momento en el tiempo durante un análisis de sensibilidad automática. (B) visualización de partículas en la pantalla de vista en vivo. (C) partícula tamaño de distribución después de mediciones repetidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Representante resultados después de la tinción con PKH67 y lámpara-1. Número de partículas vs curva de sensibilidad (1), visualización de partículas en la vista en vivo pantalla (2) y partículas distribución de tamaño (3) después de la tinción con PKH67 (A) y lámpara-1 (B). Se observa una distribución similar de tamaño de partículas, mientras que cambios en el plomo de la sensibilidad a un cambio similar pero aún no totalmente idéntico de partículas detectadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representante resultados después de tinción con Alexa Fluor 488 como CD9, CD63 y vimentin. Número de partículas vs curva de sensibilidad (1), visualización de partículas en la pantalla de visualización en vivo (2), distribución de tamaño de partícula (3) y manchas blancas /negras occidentales representativas de dos diferentes suspensiones de EV (4) para CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B) y el vimentin (54 kDa y C). Última ocurrencia de partícula señales a lo largo de la mayor sensibilidad (eje x) se correlaciona con menor intensidad de señal en el Western blot análisis, confirmando la cantidad más baja del marcador superficial de la partícula correspondiente (p. ej., vimentin vs CD63). Tenga en cuenta las curvas casi idénticas de mediciones representativas de todos los marcadores analizados indicando la alta reproducibilidad (3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Representante resultados de controles usados y fuentes posibles de error de. (A) libre de vesícula agua manchada con PKH67 (1), lámpara-1 (2) y el vimentin (3) como controles. (B) distribución de tamaño de partícula representante después de la tinción con lámpara-1 (1), CD63 (2) y CD9 (3), y las mediciones realizadas cuando deriva de la suspensión es demasiado alto. (C) número de partículas vs curva de sensibilidad (1) y distribución de tamaño de partícula (2) después de la tinción con un anticuerpo marcado con FITC CD63. Se observa un claro efecto de decoloración después de cada medición, resultando en números de partículas progresivamente más bajos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: comparación de métodos de aislamiento diferentes de EVs. Distribución de tamaño de partícula de los vehículos eléctricos aislados con exosomas solución de precipitación (A) y ultracentrifugación (B) después de la tinción con PKH67 (1), lámpara-1 (2) y CD63 (3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	LÁMPARA-1	CD9	CD63	Vimentina
Anticuerpo (μL)	5	2.5-5	2.5-5	5
Suspensión de EV (μL)	10	20	10	10
H2O (μL) para la tinción de	50	50	50	50
Volumen final (mL)	5-10	2.5-5	5	10

Tabla 1: Lista de los anticuerpos usados y rango de dilución de las muestras.

Parámetros de adquisición
Sensibilidad (%)	85
Obturador	70
Brillo mínimo	20
Max. Tamaño (nm)	500
Tamaño mínimo (nm)	20
Polaridad	Negativo
Tensión	De
Deriva de la partícula en 0 V (μm/s)	< 5
Posiciones	11
Ciclos de	10
Adquisiciones varias	3-5
Tiempo de retardo (min)	0

Tabla 2: Parámetros de adquisición para nanopartículas seguimiento análisis.

Discusión

Demostramos un protocolo detallado para el aislamiento de EVs de sangre total y rápida caracterización de marcadores de superficie específicos con nanopartículas basadas en fluorescencia análisis de seguimiento. En los experimentos realizados, utilizamos exclusivamente EVs aisladas de muestras de suero, pero este método también es conveniente para el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y plasma citratado y también puede ser ampliado a otros líquidos corporales como orina, leche materna, saliva, líquido cerebroespinal y el semen. Por otra parte, este protocolo puede ajustarse para la caracterización de los vehículos eléctricos de sobrenadantes de cultivo celular. En este protocolo, se generó la suspensión de la EV de 100 μL de suero utilizando un reactivo de precipitación de exosomas, que contiene un polímero patentado que precipita suavemente exosomas y EVs según un tamaño corpuscular desde 30 nm a 200 nm, por el que 10-20 μL de los vehículos eléctricos fueron designados para la caracterización de cada marcador superficial. Por desgracia, el paso de aislamiento es inevitable, porque la alta cantidad de proteína en muestras de suero (p. ej., albúmina y globulina) interfiere con el anticuerpo procedimiento de tinción y resultados de alto nivel del fondo y los resultados sofisticados. Además, basado en la disponibilidad biológica de los exosomas en las muestras, la cantidad de la suspensión de EV empleada así como la dilución antes de la transformación se debe ajustar para otros materiales. Para comparar las muestras múltiples, es necesario un enfoque estandarizado para la dilución de las muestras así como parámetros de adquisición consistente (sensibilidad, obturación, etc.). Otro punto importante es que las mediciones no se inician hasta que la deriva es baja (en nuestras manos, < 5 μm/s). Si la deriva era demasiado alta, medidas repetidas de la muestra rindieron alta desviación estándar entre sí, pero con una dispersión baja, los datos resultantes fueron muy constantes y confirmaron un alto nivel de reproducibilidad. Es importante que los anticuerpos seleccionados tengan un fluorocromo adecuado. Anticuerpos deben ser conjugados con Alexa Fluor 488, porque FITC tiene una alta tasa de foto-blanqueo. Posiblemente fluophores más estable sin duda conducirá a ensayo mayor estabilidad en el futuro. Normalmente, muchos investigadores utilizan PBS como un diluyente para EVs. De este protocolo, es esencial usar agua destilada como diluyente para las suspensiones de EV. Cuando EVs están marcado con colorantes fluorescentes, la alta osmolaridad y concentración de iones de otros diluyentes, como PBS, puede interferir con la medición y plomo para altera resultados.

Mientras que los métodos para el análisis de los vehículos eléctricos se han mejorado considerablemente durante la última década, todavía no hay ningún método estandarizado para aislamiento y caracterización de EVs. La desventaja principal de citometría de flujo, donde EVs están limitado a menudo a granos para proporcionar una superficie más grande, es que muchos EVs muelle sobre la superficie para proporcionar una señal fuerte y perceptible¹⁰. SEM y TEM tienen la desventaja que la preparación de muestras es desperdiciador de tiempo y EVs puede distinguirse solamente por su tamaño y morfología¹¹. Hasta fecha, el método mejor y comúnmente usado para cualitativa (es decir, bioquímicos) caracterización de EV es Western Blot, donde pueden analizarse las proteínas con anticuerpos específicos^12,13. Sin embargo, las desventajas de estos métodos radica en la imposibilidad de analizar solo EVs para marcadores de superficie específicos. Además, los largos tiempos de procesamiento y procedimientos de lavado largo, aislamiento utilizados por muchos de los protocolos actuales implican medidas intensivas, lo que no es adecuado para alto rendimiento y caracterización de EV solos. Nuestro protocolo proporciona un flujo de trabajo completo para rápido aislamiento y caracterización de EVs solo con marcadores de superficie específicos tales como CD63, CD9, vimentin y CD107a y puede ser expandida para un amplio espectro de otros marcadores de superficie para determinar el origen de lanzado EVs. Debido a un adelanto técnico permanente del dispositivo NTA, confirmamos nuestros resultados en cooperación con el fabricante con el analizador más reciente. Independientemente de los progresos futuros de la investigación en biología EV, particularmente acerca de exosomas, el protocolo que se presenta aquí proporcionará un método rápido y confiable para la caracterización de los vehículos eléctricos solo marcadores específicos. Porque hasta ahora es inevitable la agregación de los vehículos eléctricos durante el aislamiento y el procedimiento de tinción, la investigación futura debe centrarse en el desarrollo de métodos para prevenir la agregación de EV y permiten una determinación del tamaño exacto de marcado fluorescente EVs.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serum-separation tube	BD	366882	BD Vacutainer
Ampuwa water	Fresenius Kabi	10060
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Sigma	56064C
Falcon tube, 15 mL	Greiner Bio One	188271
Falcon tube, 50 mL	Greiner Bio One	227270
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Speciality tubes for ultra centrifugation
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL	Beckman Coulter	357448
Polybeads Microspheres 0.2 µm	Polysciences, Inc.	7304	Alignment Solution
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm	Polysciences, Inc.	09834-10	Alignment Solution
Syringe, 2 mL	Braun	4606027V
Syringe, 10 mL	Braun	4606728V
Exoquick	SBI	EXOQ20A-1	EV precipitation solution
Laemmli Sample Buffer (2x)	BioRad	1610737
DC Protein Assay Kit II	BioRad	5000112	Lowry prtein assay
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH67GL-1KT	For general membrane labelling
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody	BioLegend	328609	Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1)
Human CD9-Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB1880G
Anti-CD9 Antibody	SBI	EXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	MA5-18149
FITC anti-human CD63 Antibody	BioLegend	353005
CD63. Antibody, polyclonal	SantaCruz	Sc-15363
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody	BioLegend	677809
Anti-Vimentin Antibody	SBI	EXOAB-VMTN-1
Goat anti mouse IgG + IgM	Jackson Immuno	315-035-048
Goat anti rabbit IgG	Dianova	111-035-003
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher	34094
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
Chemiluminescence Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600