İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Özet

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

Özet

Hücre dışı veziküller (EVs), exosomes, dahil olmak üzere özel membranöz nano ölçekli veziküller yapısal birçok hücre türlerinden serbest bırakılır ve hücre-hücre iletişim ve çeşitli bir yelpazede düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır vücut sıvıları bulundu vardır biyolojik süreçleri. EVs karakterizasyonu için birçok farklı yöntem tarif edilmiştir. Ancak, bu yöntemlerin çoğu hazırlanması ve karakterizasyonu örnekleri çok zaman alan, ya da ilgi ve ayrık eksikliği nedeniyle kendi küçük boyutu nedeniyle belirli işaretleri analiz son derece zordur bu dezavantajı var nüfus. Önemli ölçüde son on yıl içinde gelişmiş yöntemlerle EVs çözümlenmesi için orada iken hala tek EVs. karakterizasyonu için standart bir yöntemi yoktur Burada, floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile tek EVs karakterizasyonu için yarı otomatik bir yöntem gösterilmektedir. Sunulan protokolü bu alanda pek çok araştırmacı ortak sorunu giderir ve hızlı yalıtım EVs ve PKH67, bir genel hücre zarı bağlayıcı yanı sıra belirli yüzey işaretleyicileri böyle karakterizasyonu için eksiksiz iş akışı sağlar CD63, CD9, vimentin ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (lamba-1). Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik, yüksek düzeyde Western Blot gibi diğer yöntemler tarafından onaylandı olarak gösterir. Yapılan deneylerde, sadece insan serum örnekleri izole EVs kullanılan, ancak bu yöntem aynı zamanda plazma veya diğer vücut sıvıları için uygundur ve EVs karakterizasyonu hücre kültür supernatants üzerinden için ayarlanabilir. Ne olursa olsun gelecek ilerleme EV Biyoloji araştırma burada sunulan Protokolü belirli işaretleri ile hızlı tek EVs karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EVs), exosomes, dahil olmak üzere belirli birleşimleri lipidler, yapışma ve hücreler arası sinyal molekülleri yanı sıra gibi diğer fonksiyonel sitozolik bileşenleri içeren özel membranöz nano ölçekli veziküller (20-150 nm) vardır mikroRNA (miRNA) ve mRNA ve hücre-hücre iletişim^1,2düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. EVs onların ortamında birçok farklı hücre tipleri, Örneğin, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve tümör hücreleri serbest bırakılır ve vücut sıvıları serum meni, idrar, anne sütü, tükürük veya beyin omurilik sıvısı^3, gibi algılandı ⁴. artan sayıda çalışmalar vurgulayın EVs çeşitli katkı çeşitli hastalıkların erken tanı ve/veya hastalık ilerlemesi^5,6tahmin için potansiyel biyolojik olarak. Exosomes kez onlar⁷türetmek hücre türü ne olursa olsun ile özellikle ilişkili olan moleküller varlığı ile açıklanmıştır. Örneğin, exosomes farklı tetraspanins (CD9, CD63, CD81) içeren, Binbaşı MHC kompleksi sınıf ben (MHC ı) molekülleri, çeşitli transmembran proteinler, tipik sitozolik protein (tübülin ve aktin), moleküller multivesicular vücut (dahil MVB) Dipnotlar (TSG101 ve alix), Isı şok proteinleri (HSP 70 ve HSP 90) ve katılmak proteinler sinyal iletim (protein kinaz)⁸.

Birçok farklı yöntem EVs⁹karakterizasyonu için tarif edilmistir. Akış Sitometresi¹⁰scanning elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM)¹¹, EV çözümlemesi için kullanılan en yaygın ve yaygın olarak karşılaşılan bazı yöntemler vardır. Best-established ve yaygın olarak kullanılan EV içeriğinin biyokimyasal karakterizasyonu için Western blot^12,13yöntemidir. Tüm boyutu yelpazesinde EVs tespiti için SEM ve TEM izin verirken, belirli yüzey proteinleri çok sınırlı tanımlaması bu yöntemlerin belirli bir dezavantajdır. Buna ek olarak, akış sitometresi belirli EV yüzey işaretleyicileri tanımlanması için güçlü bir araçtır, ancak bu yöntem eşiğinde EVs analiz 500'büyük boyutta sınırlar nm. Bu nedenle, izole EVs analizi belirli yüzey işaretleyicileri tespiti ile Şu anda herhangi bir bu üç köklü Yöntem erişilebilir değil. Görselleştirme ve EVs, nanopartikül izleme analizi (NTA)¹⁴analizi için başka bir son derece hassas yöntemi daha önce açıkladığımız. Kısaca, bu yöntem iki farklı fiziksel prensipleri birleştirir. İlk olarak, parçacıklar ışık lazer ışını ile ışınlanmış ve Albert hareket bilinen ikinci ilke difüzyon sıvı süspansiyon farklı parçacıkların büyüklükleri için ters orantılı olduğunu ima dağılım. Sıvı örnekleri için yarı otomatik masaüstü nanopartikül çözümleme araç nerede dağınık ışık saçılan tek dijital görüntü kaydedilir analyzer bir yazılım tabanlı analiz ile izleme parçacık oluşur. Parçacıklar ve parçacıkların hareketi tarafından lazer saçılma mikroskop bir video kamera ile tespit edilir. Optik eksen yatay ve örnek ile dolu hücre kanal içine odaklanmış iken lazer ışını dikey aydınlatmaktadır. Dağınık ışık noktalar ve araziler ve onların hareket hızını tarafından sağlanan veri toplam parçacık sayısı ve büyüklüğü dağılımı tayini etkinleştirin. Lazer ışınlama sonra parçacıkları olan ışık, dağılım bir dijital video kamera ile tarafından mikroskop¹⁴kaydedildi. İlerleme bizim eski yöntem lazer arasında 500 nm uzun dalga-pas (HS) kesme filtre ekleme olduğunu (dalga boyu 488 nm) ve floresan etiketli parçacıkların (Şekil 1) doğrudan çözümleme sağlar hücre kanal. Bizim Protokolü tek EVs, Örneğin, ebeveyn kökenlerine göre hızlı bir karakterizasyonu için birçok Araştırmacılar bu alandaki talep ortak adresleri. Bu protokol için floresans tabanlı nano tanecikleri izleme analizi ile EVs insan tam kan üzerinden hızlı yalıtım ve belirli işaretleri hızlı karakterizasyonu için tam iş akışı açıklanmaktadır. EVs PKH67, genel hücre zarı bağlayıcı yanı sıra belirli exosomal işaretleri, Örneğin, CD63, CD9, ve vimentin boyama tarafından tespit edilebilir. Bizim iletişim kuralı EDTA ve citrated plazma, aynı zamanda diğer vücut sıvıları ve hücre kültür supernatants için uygundur.

Protokol

Düsseldorf Üniversitesi Kurumsal Etik Kurulu Bu çalışmada sunulan deneyler onayladı (referans numarası: 3381).

1. EV izolasyon insan tam kan

1. EVs eksozom yağış çözüm ile izole et.
   1. 2 mL tüpler (SST) iz yolu ile serum ayıran insan bütün kan toplamak ve koagülasyon tamamlanana kadar 15 dakika oda sıcaklığında (RT) tüp kuluçkaya.
   2. SST 1.700 x g RT serum ayrı hücreler ve 1 mL serum 1,5 mL tepki tüp aktarmak için 10 min için de santrifüj kapasitesi. Trombosit açısından zengin plazma (PRP) santrifüj kapasitesi 3000 x g 15dk 4 ° C'de trombosit kaldırmak ve yeni bir 1,5 mL tepki tüp 100 μL trombosit-yoksul plazma (PPP) aktarmak için de.
   3. Ya yağış çözüm (4 parça PPP, 1 ölçü eksozom yağış çözüm) ve girdap 25 µL iyice ekleyin. Buz üzerinde 30 dk için örnek kuluçkaya. Tüp dik tutmak ve döndürmek veya tüp kuluçka döneminde karıştırın.
   4. 1500 x g 4 ° C'de EVs cips için 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra EVs bej veya beyaz Pelet geminin alt kısmında görünür. Süpernatant Aspire edin ve 1.500 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi
   5. Çıkarmak tüm izini sürmek-sıvı ve Pelet fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 100 µL içinde sık sık yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma. Ne zaman Analizi hemen gerçekleştirilmez EV süspansiyon-80 ° C'de depolayın.
      Not: EVs plazma izole zaman, fibrinojen ve fibrin verimli kurtarma engelleyebilir ve resuspension daha ağır ve daha fazla zaman alır.
2. EVs ultrasantrifüj ile izole et.
   1. (TLA-55 sabit-açılı) önceden soğutulmuş rotor buzdolabı ve ultracentrifuge kullanmadan önce soğumasını al.
   2. PPP (1.1 adımda hazırlanan) 1,25 mL kap ile uygun 1,5 mL ultrasantrifüj tüp transfer ve 110.000 x g 4 ° C'de 90 dk da örneğine santrifüj kapasitesi Rotor yükleme başlamadan önce dengelenir emin olun.
   3. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve yer tüp başaşağı 2 dakika süreyle bir kağıt havlu üzerinde Pelet PBS 500 μL içinde yeniden askıya alma ve 110.000 x g 4 ° C'de 90 dk da örneğine santrifüj kapasitesi
   4. Süpernatant Aspire edin ve Pelet PBS 50 μL içinde yeniden askıya alma.
      Not: sadece rotor ve kullanılmakta olan ultracentrifuge için tasarlanmış aksesuarları kullanın. Rotor tüplerde tüpler gücü arasında birçok düzeyinde değişiklik yapabileceğiniz için su kullanarak gerçekleştirilmediğinin.

2. boyama örnekleri

1. Örnekleri ile PKH67 leke.
   1. Boyama çözüm 50 μL Dilüent c (kit ile birlikte) PKH67 ethanolic boya çözüm 1 μL ekleyerek bir 1,5 mL tepki tüp ve karışımı iyice hazır olun.
   2. İyice karıştırın ve karanlıkta RT, 5 min için kuluçkaya boyama çözüm 10 μL (1.1 adımda hazırlanan) EV süspansiyon tepki tüp için 20 μL transfer.
   3. 15 mL tepki tüp içinde 2.5 mL distile su ile lekeli EV süspansiyon 50 μL sulandırmak, iyice karıştırın ve bu son süspansiyon partikül ölçüm için kullanın.
      Not: diğer seyrelticiler (Örneğin, PBS) ölçüm zarar olabilir çünkü bu su için EV süspansiyon, eritici kullanmak önemlidir. Kullanarak EV-süspansiyon depolandıklarında, buz üzerinde örnekleri çözülme ve boyama önce iyice karıştırın.
2. Örnekleri belirli antikorlar ile leke.
   1. (1.1 adımda hazırlanan) EV süspansiyon 10-20 μL 50 μL bir 1,5 mL tepki tüp ve karıştırmak içinde distile su ile iyice oranında seyreltin.
   2. İyice karıştırın ve RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya spesifik antikor (Tablo 1) 2.5-5 μL tepki tüp ekleyin.
   3. Lekeli EV süspansiyon 50 μL 2.5-10 mL distile su (Tablo 1) 15 mL tepki tüp içinde transfer, iyice karıştırın ve bu son süspansiyon partikül ölçüm için kullanın.
      Not: bazı durumlarda kullanılan antikor konsantrasyon olması gerekir (Tablo 1) ayarlanır.

3. işleme örnekleri

Not: Bu yöntem temelleri kapsamlı daha önce ve protokol odaklanır aşağıda floresans etiketli EVs¹⁴analizi için belirli adımları üzerinde tarif edildi.

1. Başlatma yordamı gerçekleştirin.
   1. Floresan filtre mikroskop ve kamera optik yol itin. Programı başlatın ve otomatik uygulama için ekrandaki yönergeleri izleyin.
   2. Doğru telefon numarası (Z158_C1149_Fluor) Floresan ölçüm için "Hücre kontrol" sekmesinde (hücre tanımı) seçin. Lazer ve mikroskop ortak odak (lazer ve otomatik olarak bu konuma taşımak mikroskop) olduğundan emin olmak Optik için başvuru konumu seçin.
   3. 10 mL distile su ile dolu bir şırınga ile hücre Kanal Temizleme. Ölçüm hücre hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun ve hava kabarcıkları sisteme enjekte değil.
   4. Karboksilat grupları kendi yüzeyinde olan Tekdüzen 200 nm boyutlu floresans etiketli polistren parçacıkları içeren bir kalibrasyon süspansiyon hazırlamak. 990 μL distile su ile parçacıkların 10 μL sulandırmak. O zaman bu parçacık çözümü 15 mL tüp içinde 10 μL 10 mL gerekli konsantrasyonu elde etmek için distile su ile oranında seyreltin.
   5. 2.5 mL hücre kanaldaki seyreltilmiş parçacık çözeltisi enjekte edip "odak en iyi duruma getirme" tıklatın kamerayı ayarlamak için.
2. Örnek ölçmek.
   1. Hücre Kanal 10 mL her örnek ölçü önce distile su ile dolu bir şırınga ile birden çok kez yıkayın. (2. adımda hazırlanan) lekeli EV süspansiyon hücre kanal enjekte.
   2. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "Hücre kontrol" sekmesinde aşağıdaki ana kamera parametrelerini gerekli (Tablo 2) ayarlayın. Başvuru konumu kullanın veya 0.41193 parametreleri ayarlamak için konum.
      1. "Sayısı parçacıklar vs duyarlılık" butonuna basarak için duyarlılık, en iyi ışık hassasiyet değerleri bulmak farklı duyarlılık düzeyi için ekran başına ölçülen parçacıkların bir eğri görüntülemek için.
         Not:
      2. Çekim için kamera ışık için kararlı bir aralığı geçmek sağlar süreyi ayarlayın.
      3. Sonrası satın alma parametrelerini için 20, 20 en az boyutu en az bir parlaklık seçin nm ve bir en büyük boyutu 500 nm ölçüm için.
   3. Algılanan parçacıkların görüntü görme alanı içinde sayılan sayısını not edin. Saçılma bar yeşil turuncu aralığına (50-300 parçacıklar) olması gerekir. Saçılma bar kırmızı ise, dağılım bireysel parçacıkların sigorta ve böylece yanlış sonuçlar için önde gelen bir tek parçacık olarak sayılır. Böyle bir durumda, daha fazla parçacıkların örtüşen önlemek için örnek seyreltik veya duyarlılığı azaltmak.
   4. Ölçüm başlamadan önce "Onay parçacık drift at 0 V" "Hücre kontrol" sekmesinde tıklayın. Drift 5 mikron/s yüksekse, ölçüm devam etmek için akan örnek duruncaya kadar bekleyin.
      Not: drift ölçüm başında çok yüksek ise, tekrarlanan ölçüler ve farklı sonuçlar sophisticate. NTA temel ilkeleri nedeniyle, ilgili bir drift yazılım tarafından hesaplanan olarak kararlı partikül büyüklüğü bir etkiye sahip.
   5. Tıkırtı üstünde "Koşmak Video edinme" içinde "Ölçü" sekmesini seçin deneyler (3-5) sayısı ve onları (0 dak) arasındaki gecikme süresi.
   6. (Bireysel subvolume-) konum (11) sayısı ve nerede parçacıklar analiz edilmelidir her ölçüm konumundaki (ölçüm) döngüsü (10) sayısını tanımlamak
   7. Bir klasör seçin, yeni bir dosya adı oluşturun ve tıkırtı "OK" ölçüm başlatmak için.

4. sonuçları yorumlanması

1. Parametreleri ve sonuçları "Analiz" sonra ölçüm görüntüleyin. Hücre kanal temizlemeden önce analiz sonra aşağıdaki parametreleri denetleyin: parçacıklar pozisyon, izlenen parçacıklar ve parçacık konsantrasyonu, parçacıklar (x10, x50 ve x90 değerleri), dağıtım genişliğini toplam sayısı başına ortalama sayısı değeri Ortalama ve standart sapma. Ölçüm örnek gerekirse yineleyin.
   Not: Sonuçları bir .pdf veya .txt dosyası olarak da kaydedilir.
2. "Analiz" sekmesinin boyutuna göre tespit edilen parçacıklar dağıtımını gösteren ölçü sonra hesaplanan grafiği görüntülemek için tıklatın. "Ekran" "Analiz" sekmesini tıklatın ve simgeleri ayarlamak ve belirli gereksinimleri grafik ayarlarını değiştirmek için kullanın.

5. doğrulama yolu ile EV algılama Western blot tarafından

1. (1. adımda hazırlanan) EV Pelet RIPA lizis ve ayıklama arabelleği dağıtılması, iyice pipet ve lysate açıklamak ve süpernatant için yeni bir tüp aktarmak için 30 dakika santrifüj örneği 8.000 x g ' 4 ° C'de 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya.
2. Toplam protein Lowry protein tahlil paketi tarafından ölçmek. İzole EV süspansiyon 1 μL 49 μL RIPA arabelleği ile sulandırmak ve 5 μL triplicates içinde çözümleme için kullanın. 2 x Laemmli yükleme arabelleğe 2 µg/μL ve ısı 95 ° C'de 10 dakika için son bir konsantrasyon ile EV süspansiyon sulandırmak
3. Protein iyi başına 20 μg yükleyin. Ayrı ve proteinler polyacrylamide Jel Elektroforez ve tank kurutma göre standart iletişim kuralları tarafından aktarım.
4. Membran (0,2 mikron polivinilidin difluoride) ile sığır süt tozu (% 5) RT, 1 h blok ve membran ile belirli birincil antikorlar (CD9, CD63 ve vimentin) gecede 4 ° C'de kuluçkaya
   Not: 1:1,000 seyreltme birincil antikorlar kullanılır.
5. Membran TBST ile yıkayın 3 x 5 min ve membran horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor (1:20, 000 içinde TBST) 60 dk RT. az için
6. Membran TBST ile yıkayın 3 x 5 min ve proteinler yüksek hassasiyet substrat çözeltisi bir görüntüleme sistemi ile Kemiluminesan saptamak.
   Not: CD63 antijen kapsamlı ve degisken glikozile, molekül ağırlığı değişebilir çünkü, ve gruplar arasında 40-65 kDa görünebilir.

Sonuçlar

EVs tam kan izole ve nanopartikül izleme çözümlemesi Floresanda reaktifleri ile karakterize edildi. Günahı parçacıklar ölçümü için en uygun hassasiyet aralığı %70 için bizim deneyler sırasında tespit edilmiştir. Ayarlama ve kalibrasyon ölçüm için kullanılan floresan boncuk bir optimum ayarı %85 (Şekil 2A) bir duyarlılık gösterdi. Daha fazla duyarlılık artan partikül boyutu dağılımın bozulmasına parçacıkları sayısı yeniden düşüyor nerede neden olabilir bir duyarlılık % 70 ve % 90 arasında tespit edilen parçacıkları sayısı hızla artarken. Kamera ayarlarını keskin resim (Şekil 2B) görüntülenen ve düşük standart sapma (Şekil 2C) gösterdi ölçümleri tekrarladı. Tüm ölçüleri aynı ayarları (Tablo 2) ile yürütülen böylece kadarıyla, EVs örnekleri işleme için protokol ayarlandı. Dağıtım genişlik x ekseni, x10, x50 ve x90 üç değeri tarafından tanımlanır. X50 veya Ortalama partikül boyutu nüfusun yarısının bu değerin altında yatıyor çapı olduğunu. Benzer şekilde, x10 ve x90 % 10 ve algılanan parçacıkların % 90'ı bildirilen boyutu altında olan çapı gösterir. Hücre zarının lipid bölgelere uzun alifatik kuyruklu bir yeşil flüoresan boya içerir bir floresan hücre bağlayıcı gibi PKH67 hücre bağlayıcı kit ile boyama duyarlılığı ve sayısı arasında güçlü bir korelasyon gösterdi parçacıklar (Şekil 3A) ölçülür. PKH67 kez nükleer silahların yayılmasına karşı izlemek için kullanılır ama aynı zamanda içinde vivo hücre kaçakçılığı gelince eksozom veya lipozom alımını de izlemek için yararlı kanıtlamıştır. Non-spesifik PKH67 etiketleme nedeniyle, çok çeşitli EVs etiketli tespit ve. 266 nm (x10) ve 1946 nm (x90) bir tepe 857 maksimum ile arasında bir aralıktaki parçacıklar dağılımı yapıldı nm (x50) ve ölçümler arasında düşük bir standart sapma ile (28,1 nm). LAMBA-1, öncelikle lizozomal membran arasında da lysosome ilişkili membran glikoprotein 1 ve CD107a yer alır. LAMBA-1 karşı spesifik antikor etiketli bir Alexa Fluor 488 ile boyama sonra 220 nm (x10)-1145 nm (x90) 541 en yüksek bir tepe ile gelen parçacıkların dağıtım aralıkları nm (x50) ve 11,7 standart sapması nm (Şekil 3B). EVs karakterizasyonu için Alexa Fluor ortak exosomal işaretleri karşı antikor etiketli 488 kullanılan ve Western blot tarafından bizim bulgular doğruladı. Alexa Fluor 488 etiketli CD9-antikor ile boyama sonra parçacıkların dağıtım aralıkları 251 nm (x10)-1139 nm (x90) 548 en yüksek bir tepe ile gelen nm ve ikinci bir küçük tepe yaklaşık 25 nm (Şekil 4A). CD63 etiketli Alexa Fluor 488 ile boyama (Şekil 4B) ve vimentin (Şekil 4 c) benzer sonuçlar vermiştir. Western blot analizi bizim olumlu sonuç burada kullanılan antikor için kanıtlanmış. Tekrarlanan ölçümleri bu raporda kullanılan tüm karşı antikorlar tekrarlanabilir sonuçlar ortaya koydu. Denetimleri, biz nerede PKH67 ve LAMP1 antikorları hemen hemen % 100'e yakın bir duyarlılık kadar hiçbir EV tespit vezikül ücretsiz su ile ilgili antikorları (Şekil 5A), lekeli. Örnek parçacıkların aslında özgür olduğunda bile vimentin örneği kullanarak, yüksek hassasiyet ortaya çıkan eserlerin sayısı arttı. Drift henüz çok yüksek olduğunda ölçüm başlatılıp başlatılmadığını (> 5 µm/s), bireysel tekrarlama belirgin sapma kendi aralarında (Şekil 5B). Üç farklı antikorlar ile temsil edilen drift ölçüm başlamadan önce mümkün olduğu kadar az önemlidir. Fluorochrome sonuçları FITC beyazlatma Hızlı Foto eğilimli olduğundan, doğru ve tekrarlanabilir olmayan ölçümlerde olarak floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak bizim deneyim göre (Şekil 5C). Bu nedenle, sadece Alexa Fluor 488 antikorlar EV karakterizasyonu için etiketli kullanmanızı öneririz. Bu protokol için EVs Polietilen glikol içeren bir polimer esaslı eksozom yağış çözüm tarafından izole. Sonuçlarımız uygulamalı yalıtım yöntemi tarafından sahte değil emin olmak için biz EVs sonra yalıtım ultrasantrifüj ile karakterize. PKH67 ve iki farklı antikorlar (CD63 ve lamba-1) ile temsil edilen, bizim uygulamalı yalıtım eksozom yağış çözüm (Şekil 6A) ile sonuçlarını EVs izole üzerinden ultrasantrifüj ile (Şekil 6B karşılaştırılabilir ). Ne yazık ki, sonra ultrasantrifüj EVs zavallı verim nedeniyle, serum yalıtım için başlangıç kümesi belirgin daha eksozom yağış çözüm ile yalıtım için göre gerekir.

Şekil 1: şematik kurulumu izleme çözümlemesi nanopartikül. Mikroskop/video eksen ve lazer ışını her diğer, hücre, geçiş için uygun odaklı kanal kesiti. Bir floresan filtre hücre kanal ile mikroskop arasına yerleştirilir. Moleküller tarafından dağınık ışık yazılım "live-view" penceresinde görüntülenir. Satın alma sonra sonuçları bir boyutu dağıtım eğri koordinat sistemi görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: kalibrasyon floresan ile etiketlenmiş boncuk. (A) parçacıklar vs duyarlılık eğri sayısını görüntüler bir noktada bir pozisyonda parçacıklar otomatik hassasiyet taraması sırasında zamanında. Canlı ön izleme ekranında parçacıkların (B) görselleştirme. (C) partikül dağıtım sonra tekrarlanan Ölçüler boyutu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: temsilcisi sonuçları PKH67 ve lamba-1 ile boyama sonra. Parçacıklar vs duyarlılık eğrisi (1), (3) sonra PKH67 ile boyama canlı görüntü ekran (2) ve parçacık boyutu dağılımı üzerinde parçacıkların görselleştirme sayısı(a)ve lamba-1 (B). Kurşun algılanan parçacıklar benzer ancak henüz tamamen aynı değişikliği için ayarlama duyarlılık değişiklikleri sırasında parçacıklar benzer bir boyutu dağılımı görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: temsilcisi sonuçları Alexa Fluor 488 ile boyama CD9, CD63 ve vimentin etiketli sonra. Parçacıklar vs duyarlılık eğrisi (1), (4) için CD9 canlı görüntü ekran (2), parçacık boyutu dağılımı (3) ve iki farklı EV süspansiyonlar temsilcisi Batı lekesi parçacıkların görselleştirme sayısı (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B) ve vimentin (54 kDa, C). Batı daha düşük sinyal yoğunluğu ile ilişkilendirir analizi, anılan sıraya göre parçacık yüzey işaretçiyi (Örneğin, vimentin vs daha düşük miktarda teyit leke artan duyarlılık (x ekseni) geç parçacık oluşumu sinyalleri CD63). Hemen hemen aynı eğriler yüksek tekrarlanabilirlik (3) gösteren tüm analiz işaretleri için temsilcisi ölçümlerin unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: temsilcisi sonuçlar kullanılan denetimleri ve olası hata kaynaklarını için. (A)vezikül içermeyen su lekeli PKH67 ile (1), lamba-1 (2) ve (3) denetimleri olarak vimentin. (B) temsilcisi parçacık boyutu dağıtımları lamba-1 (1), CD63 boyama sonra (2) ve CD9 (3), ve ölçümler gerçekleştirilen süspansiyon drift henüz çok yüksek olduğunda. Parçacıklar vs duyarlılık eğri (1) ve (2) sonra FITC etiketli CD63 antikor ile boyama parçacık boyutu dağılımı (C) sayısı. Açık açma efekti aşamalı olarak daha düşük parçacık sayılarda sonuçlanan her ölçüm sonra görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: EVs için farklı yalıtım yöntemlerinin karşılaştırılması. PKH67 ile boyama sonra eksozom yağış çözüm(a)ve (B) ultrasantrifüj ile izole EVs parçacık boyutu dağılımı (1), lamba-1 (2) ve CD63 (3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

	LAMBA-1	CD9	CD63	Vimentin
Antikor (µL)	5	2.5-5	2.5-5	5
EV süspansiyon (µL)	10	20	10	10
Boyama için H2O (µL)	50	50	50	50
Son hacmi (mL)	5-10	2.5-5	5	10

Tablo 1: Kullanılan antikor ve örnekleri seyreltme aralığı listesi.

Edinme parametreleri
Duyarlılık (%)	85
Çekim	70
Min. parlaklık	20
Max. Boyutu (nm)	500
Min. boyutu (nm)	20
Polarite	Negatif
Gerilim	Kapalı
Parçacık drift (µm/s) 0 V	< 5
Pozisyonlar	11
Döngüleri	10
Çoklu alımlara	3-5
Gecikme süresi (dk)	0

Tablo 2: Edinme parametreleri için izleme çözümlemesi nanopartikül.

Tartışmalar

Biz göstermek EVs yalıtım için detaylı bir protokol tam kan ve belirli yüzey işaretleyicileri hızlı karakterizasyonu floresans tabanlı izleme çözümlemesi nano tanecikleri ile. Yapılan deneylerde, biz sadece serum örnekleri izole EVs kullanılan, ama bu yöntem aynı zamanda ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve citrated plazma için uygun olan ve aynı zamanda idrar, anne sütü, tükürük gibi diğer vücut sıvıları için Genişletilebilir, beyin omurilik sıvısı ve meni. Ayrıca, bu iletişim kuralı için EVs karakterizasyonu hücre kültür supernatants üzerinden ayarlanabilir. Bu protokol için EV süspansiyon hafifçe exosomes ve EVs 30 arasında bir corpuscular büyüklüğüne göre precipitates özel bir polimer içeren bir eksozom yağış reaktif kullanarak serum 100 μL üzerinden oluşturulan nm 200 nm, mademki 10-20 μL EVs her yüzey işaretçisine karakterizasyonu için atandılar. Çünkü serum numuneleri (Örneğin, albümin ve globulin) protein yüksek miktarda antikor boyama prosedürü ile karışan ve arka plan ve sofistike bulguları yüksek düzeyde sonuçlar ne yazık ki, yalıtım adım, kaçınılmazdır. Ayrıca, exosomes örneklerde biyolojik kullanılabilirliğini temel, istihdam EV süspansiyon yanı sıra seyreltme işlemeden önce miktarı diğer kaynak malzemeleri için ayarlanması gerekir. Birden çok örnekleri karşılaştırmak için seyreltme örnekleri hem de tutarlı Alım parametreleri (duyarlılık, çekim, vb) için standart bir yaklaşım gereklidir. Başka bir önemli nokta drift (bizim ellerimizde < 5 mikron/s) düşük olana ölçümlere başlatılmamış olduğunu. Drift çok yüksek olsaydı, kendi aralarında yüksek standart sapma tekrarlanan ölçüler örnek vermiştir ama düşük bir drift, sonuçta elde edilen veriler son derece tutarlı ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde doğruladı. Seçili antikorlar uygun bir fluorochrome olması önemlidir. Çünkü FITC fotoğraf ağartma yüksek orandaki antikorlar ile Alexa Fluor 488, Birleşik gerekir. Muhtemelen daha istikrarlı fluophores artan tahlil istikrar için kesinlikle gelecekte götürecek. Normalde, pek çok araştırmacı için EVs. bir eritici PBS kullanma Bu iletişim kuralı için distile su bir eritici EV kullanılamaz hale için kullanmak çok önemlidir. Ne zaman EVs Floresanda boyalar, yüksek osmolalite ve PBS gibi diğer seyrelticiler iyon konsantrasyonu ile etiketlenir ile ölçüm engelleyebilir ve müşteri adayına sonuçlar değişmiş.

Önemli ölçüde son on yıl içinde gelişmiş yöntemlerle EVs çözümlenmesi için orada iken hala yalıtım ve EVs. karakterizasyonu için standart bir yöntemi yoktur Akış Sitometresi, nerede EVs kez boncuk için daha büyük bir yüzey sağlar bağlanmıştır, büyük dezavantajı birçok EVs güçlü ve algılanabilir sinyal¹⁰sağlamak için yüzeye dock olmasıdır. SEM ve TEM örnekleri hazırlık zaman alıcı ve EVs sadece onların boyut ve morfoloji¹¹tarafından ayırt edilebilir dezavantajı var. Bugüne kadar nitel (Yani, biyokimyasal) için best-established ve yaygın olarak kullanılan yöntem EV karakterizasyonu Western blot, nerede protein-ebilmek var olmak çözümlemek belirli antikor^12,13ile doldu. Ancak, bu yöntemlerin dezavantajları yetersizlik belirli yüzey işaretleri tek EVs çözümlemek için yalan. Ayrıca, emek yoğun adımlar değil yüksek örnek işlem hacmi ve tek EVs. karakterizasyonu için uygundur, uzun işlem süreleri ve birçok geçerli protokol tarafından kullanılan uzun çamaşır/yalıtım yordamlar içerir Bizim iletişim kuralı CD63, CD9, vimentin ve CD107a gibi belirli yüzey işaretleyicileri hızlı yalıtım ve tek EVs karakterizasyonu için tam bir iş akışı sağlar ve diğer yüzey işaretleyicileri kökenini belirlemek için geniş bir yelpazede için genişletilmiş Yayınlanan EVs. Nedeniyle kalıcı bir teknik ilerleme NTA cihazın en yeni analyzer ile üretici ile işbirliği içinde bizim bulgular doğruladık. EV biyoloji, özellikle exosomes, ilgili araştırmanın gelecek ilerleme ne olursa olsun burada sunulan Protokolü belirli işaretçileri olan tek EVs karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlayacaktır. EVs toplama yalıtım ve boyama işlemi sırasında defa kaçınılmaz olduğu için gelecekteki araştırma EV toplama önlemek ve floresan etiketli EVs. doğru boyutu belirlenmesi etkinleştirmek için yöntemler geliştirilmesi üzerinde odaklanmalıdır

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serum-separation tube	BD	366882	BD Vacutainer
Ampuwa water	Fresenius Kabi	10060
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Sigma	56064C
Falcon tube, 15 mL	Greiner Bio One	188271
Falcon tube, 50 mL	Greiner Bio One	227270
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Speciality tubes for ultra centrifugation
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL	Beckman Coulter	357448
Polybeads Microspheres 0.2 µm	Polysciences, Inc.	7304	Alignment Solution
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm	Polysciences, Inc.	09834-10	Alignment Solution
Syringe, 2 mL	Braun	4606027V
Syringe, 10 mL	Braun	4606728V
Exoquick	SBI	EXOQ20A-1	EV precipitation solution
Laemmli Sample Buffer (2x)	BioRad	1610737
DC Protein Assay Kit II	BioRad	5000112	Lowry prtein assay
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH67GL-1KT	For general membrane labelling
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody	BioLegend	328609	Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1)
Human CD9-Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB1880G
Anti-CD9 Antibody	SBI	EXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	MA5-18149
FITC anti-human CD63 Antibody	BioLegend	353005
CD63. Antibody, polyclonal	SantaCruz	Sc-15363
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody	BioLegend	677809
Anti-Vimentin Antibody	SBI	EXOAB-VMTN-1
Goat anti mouse IgG + IgM	Jackson Immuno	315-035-048
Goat anti rabbit IgG	Dianova	111-035-003
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher	34094
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
Chemiluminescence Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600