Espectroscopia de resonancia magnética funcional en 7 T en la corteza del cañón de rata durante la activación de la barba

Resumen

Después de comprobar por sangre oxígeno-nivel-dependiente funcional resonancia magnética (fMRI en negrilla) que el correspondiente barril somatosensorial corteza área (llamado S1BF) está correctamente activado, el principal objetivo de este estudio es cuantificar el contenido de lactato fluctuaciones en los cerebros de rata activado por espectroscopia de resonancia magnética localizada del protón (¹H-MRS) en el T. 7

Resumen

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) ofrece la oportunidad de medir el contenido de metabolitos cerebrales en vivo y no invasor. Gracias a avances tecnológicos durante la última década y el aumento de fuerza del campo magnético, ahora es posible obtener buena resolución espectros en vivo en el cerebro de la rata. Neuroenergetics (es decir, el estudio del metabolismo cerebral) y, especialmente, interacciones metabólicas entre los diferentes tipos de células han atraído cada vez más interés en los últimos años. Entre estas interacciones metabólicas, todavía se discute la existencia de un servicio de transporte de lactato entre neuronas y astrocitos. Por lo tanto, resulta de gran interés para realizar espectroscopia de resonancia magnética funcional del protón (¹H-MRS) en un modelo de rata de cerebro activación y monitor de lactato. Sin embargo, el pico de lactato de metilo superpone picos de resonancia de lípidos y es difícil de cuantificar. El protocolo que se describe a continuación permite metabólico y lactato fluctuaciones monitorizada en un área cerebral activada. Activación cerebral se obtiene por la estimulación de la barba y ¹H-MRS se realiza en la corteza activada cañón correspondiente, cuya área se detecta usando sangre oxígeno-nivel-dependiente de resonancia magnética funcional (fMRI en negrilla). Describen detalladamente todos los pasos: la elección de los anestésicos, bobinas y secuencias, alcanzar barba eficiente estimulación directamente en el imán y procesamiento de datos.

Introducción

El cerebro posee mecanismos intrínsecos que permiten la regulación de su sustrato principal (por ejemplo, glucosa), tanto por su contribución y su utilización, dependiendo de las variaciones en la actividad cerebral local. Aunque la glucosa es el sustrato principal de energía para el cerebro, experimentos llevados a cabo en los últimos años han demostrado que lactato, que es producido por los astrocitos, podría ser un sustrato eficiente de la energía para las neuronas. Esto plantea la hipótesis de una lanzadera de lactato entre astrocitos y neuronas¹. ANLS, astrositos neurona lactato transporte², la teoría es todavía muy debatida pero ha llevado a la propuesta de la glucosa, en lugar de ir directamente a las neuronas, pueden entrar en los astrocitos, donde es metabolizado a lactato, un metabolito que es , entonces, transferido a las neuronas, que utilizan como sustrato energético eficiente. Existir un servicio de transporte en vivo, tendría varias consecuencias importantes tanto para descifrar las alteraciones metabólicas observadas para la comprensión de las técnicas básicas de proyección de imagen cerebral funcional (tomografía por emisión de positrones [PET]) en patologías del cerebro.

Para estudiar el metabolismo del cerebro y, particularmente, las interacciones metabólicas entre neuronas y astrocitos, cuatro técnicas principales están disponibles (no incluye micro-/ nanosensores): autorradiografía, animal doméstico, dos fotones fluorescente microscopia confocal y a la señora. Autorradiografía fue uno de los primeros métodos propuestos y proporciona imágenes de la acumulación regional de radioactivo ¹⁴C-2-deoxyglucose en rebanadas de cerebro, mientras PET rendimientos en vivo imágenes de la captación regional de radiactivo ¹⁸ F-desoxiglucosa. Ambos tienen la desventaja de la utilización de moléculas de irradiative mientras que la producción de imágenes de resolución espacial baja. Microscopía de dos fotones proporciona resolución celular de sondas fluorescentes, sino dispersión de la luz por tejido limita la profundidad de la proyección de imagen. Estas tres técnicas se han utilizado previamente para estudiar neuroenergetics en roedores durante barba estimulación^3,4,5,6. En vivo MRS tiene la doble ventaja de ser no invasivo y no radiactivo, y se puede explorar cualquier estructura cerebral. Por otra parte, MRS puede ser realizado durante la activación neuronal, una técnica llamada a MRS funcional (fMRS), que se ha desarrollado muy recientemente en roedores⁷. Por lo tanto, se propone un protocolo para monitorizar el metabolismo cerebral durante la actividad cerebral por ¹H-MRS en vivo y no invasor. El procedimiento se describe en ratas adultas saludables con la activación del cerebro obtenida por una soplo de aire barba estimulación realizada directamente en un reproductor de imágenes de resonancia magnética (de Sr.) T 7 pero se puede adaptar en animales genéticamente modificados, así como en cualquier condición patológica .

Protocolo

Animales todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de Experimentación Animal de la Directiva Europea del Consejo de las comunidades de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). El protocolo se reunieron las directrices éticas del Ministerio francés de agricultura y bosques y fue aprobado por los comités de ética locales (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Burdeos n ° 50112090-A).

Nota: Durante las mediciones de Señor, un nivel adecuado de anestesia y monitoreo fisiológico (temperatura corporal, frecuencia respiratoria) son requisitos imprescindibles.

1. los animales

1. Utilizar ratas Wistar macho pesa entre 350 y 450 g.
2. Mantenerlos en una 12:12 h luz: oscuridad ciclo y proporcionar alimento y agua ad libitum.

2. anestesia

1. Preparar el equipo necesario para la anestesia (figura 1A, B, véase Tabla de materiales): una jeringa de 5 mL con medetomidina en solución salina fisiológica (240 μg/kg/h, con una tasa de perfusión de 20 μl/min), una jeringa de 0.5 mL que contiene atipamezole (20 μL, en 0,5 mL de solución salina) y ungüento oftálmico.
   Nota: Guarde todo el equipo bajo la campana, excepto la jeringa de 5 mL que contiene medetomidina, que se coloca en la bomba de jeringa cerca del imán para la anestesia durante la adquisición del Señor.
2. Colocar la rata en la cámara de inducción, empezar la anestesia mediante la entrega de 4% de isoflurano y ajustar el flujo de oxígeno a 1,5 L/min.
3. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la evaluación de la retirada de los reflejos de la pata.
4. Cuando la rata no responde a la estimulación, saque de la caja de la anestesia, colocar en el Banco con su nariz en la máscara del isoflurano y mantener anestesia mediante la entrega de 2,5% en oxígeno a 1,5 L/min.
5. Suavemente masaje la cola y colocar el torniquete (figura 1).
   Nota: El masaje puede realizarse con agua tibia, con una temperatura entre 38 y 42 ° C, para obtener mejor vasodilatación de las venas.
6. Inserte el catéter intravenoso periférico (22 G), previamente heparinizado, en la vena de la cola izquierda o derecha. Tenga en cuenta que se observa un retorno venoso (es visible en la parte distal de la aguja una gota de sangre) cuando el catéter está correctamente insertado (figura 1).
7. Sople burbujas de aire presentes en el volumen de espacio muerto del catéter usando la jeringa de 2 mL que contiene solución salina y heparina.
8. Aplicar el ungüento oftálmico y prepare la jeringa que contiene atipamezole (17 μg/mL) para despertar la rata al final del experimento.

3. rata colocación en imán para la estimulación de la barba

1. Coloque un sensor de respiración en la cama de imán y luego transferir la rata del Banco a la cama de imán. Coloque en la posición propensa con su nariz en la máscara del isoflurano, con el sensor de respiración situado entre la caja torácica y el imán.
   Nota: Todo el equipo que entra en la habitación de MRI debe ser seguro para MRI.
2. Disminuir el isoflurano (del 4% al 1.5%-2%) durante la colocación del rata y cambie la anestesia a la medetomidina en el final de este procedimiento. Que sean los bigotes derecha libres, después de haber cortado el borde derecho en la parte delantera de la cama de MRI antes para permitir el movimiento de los bigotes de rata.
3. Sostener la rata en su posición con cinta adhesiva y controlar su respiración, que debe estar entre 60 y 80 respiraciones por minuto.
4. Hacer una vela que atrapa bien bigotes en la cinta de papel (figura 2). Alinee el tubo de salida flexible del sistema de soplo de aire a lo largo de la rata cama de MRI de modo que la parte que sale del tubo quede perpendicular y alrededor de 1,5 cm de la vela. Fijar con cinta de papel.

4. barba estimulación

1. Conectar el tubo flexible de entrada de una fuente de aire comprimido (1 bar) a una solenoide control válvula de entrada y el tubo de salida a la salida de la válvula de control solenoide (figura 3). Asegúrese que la válvula de control solenoide se queda fuera de la sala del imán.
2. Conecte el dispositivo de pulsación en la válvula de solenoide y el imán con la lógica del transistor-transistor (TTL)-Puerto. Configurarlo para que la frecuencia de la pulsación = 8 Hz, el tiempo de pulsación = 20 s y el tiempo de descanso = 10 s.
   Nota: Estos parámetros, visualizados en el pequeño cristal líquido (LCD) pantalla de visualización, son ajustables mediante los potenciómetros analógicos dedicados tres. El dispositivo electrónico de pulso, que controla el paradigma, debe estar compuesto de componentes electrónicos de alta calidad para evitar cualquier deriva en parámetros de tiempo (para postproceso correcto).

5. negrita fMRI adquisición

1. Colocar el cerebro de la rata está en una posición vertical y utilice las barras de oído para mantenerlo. Coloque la bobina de serie de volumen por encima de la cabeza de la rata (Figura 4A) y fijarlo con cinta. Compruebe que la vela mueva correctamente (movimiento anteroposterior, sin rotación y sin fricción de la vela) cuando el sistema de soplo de aire es convertido en; a continuación, apáguelo.
2. Inserte la cama y la bobina en el centro del imán. Compruebe que la vela está todavía avanzando correctamente una vez que la cama está dentro del imán cuando el sistema de aire-puff está en; a continuación, apáguelo. Cambiar totalmente de isoflurano a medetomidina (tasa de perfusión: 20 μl/min).
3. Compruebe que la rata está bien situado con una secuencia de localización (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; promedio = 1; repetición = 1; rodaja = 1 mm; tamaño de imagen = 256 x 256; campo de visión (FOV) = 50 x 50 mm; tiempo de exploración = 12 s 800 ms). Arrastre la ficha secuencia de localizador en el nombre de la instrucción y haga clic en continuar.
4. Arrastre la ficha secuencia de T2_Star_FID_EPI en el nombre de instrucción, centro del campo visual en el centro del cerebro y haga clic en la ficha de la plataforma de ajuste para abrir la instrucción exploración editado. Registrar un mapa de₀ B y proceder a una cuña de exploración.
   Nota: Para ver un mapa de₀ B, utilice los siguientes parámetros: primera vez de echo = 1,65 ms; TR = 20 ms, promedio = 1; tapa ángulo = 30°; espaciamiento del eco = 3,805 ms; rodaja = 58 mm; tamaño de imagen = 64 x 64 x 64; Campo de visión = 58 x 58 x 58 mm; tiempo de exploración = 1 m 24 s 920 Sra. para calce de exploración, utilice los siguientes parámetros: excitación selectiva de voxel = pulso gaussiano de vapor; TE = 5 ms; tiempo de mezcla = 10 ms; duración de adquisición = 204,8 ms; ancho de banda = 10.000 Hz; tiempo de permanencia = 50 μs).
5. Iniciar la secuencia de Star_FID_EPI T2 (TE = 16,096 ms; TR = 500 ms; promedio = 1; repetición = 600; rodaja = 1 mm; cuatro sectores consecutivos; tamaño de imagen = 128 x 128; Campo de visión = 20 x 20 mm; ancho de banda = 333.333,3 Hz; tiempo de exploración = 5 min 00 s).
   Nota: Por el puerto TTL, una señal de disparo externa comenzará el sistema de soplo de aire al mismo tiempo. El paradigma = [activación s 20 + 10 resto s] x 10, de la duración total de los 600 escaneos, 500 ms por escaneo. Las láminas están centradas en el centro de la zona de campo de barril.
6. Adquirir otra secuencia de localización (igual que el paso descrito en 5.3) para comparar con la primera de ellas y comprobar si la rata ha trasladado durante la secuencia de T2_Star_FID_EPI.
7. Llevar la cama a su posición inicial, retirar la bobina de la gama de volumen y conectar la bobina de superficie.

6. procesamiento en negrilla

1. Abra el archivo Star_FID_EPI T2 y leer la imagen T2 Star_FID_EPI en Pantalla de imagen. Abra la ventana de arranque del regulador funcional, llamado FunController.
2. En esta ficha proceso , seleccione la ventana de proyección de imagen funcional y definir el protocolo de estimulación (duración y alternancia de On/Off períodos, correspondientes al paradigma utilizan).
3. Seleccione la ventana de protocolo (conjunto de datos con 600 Marcos), introduzca el valor de 40 en la pestaña De período y 20 en el período la ficha haga clic en la ficha Reconocimiento de invertir y arrastre el regulador de Estados de estimulación a la izquierda para seleccionar el valor de 1.
4. En la ventana de preprocesamiento, haga clic en el filtro de la mediana en plano para el proceso previo y en el filtro de la mediana (2D, 3D) para postproceso.
5. Haga clic en la pestaña Execute y arrastre los cursores para ajustar la tabla de búsqueda de recubrimiento. Visualizar el área cerebral activada (Figura 4B).

7. protón señora adquisiciones

1. Para colocar correctamente la bobina de superficie, modificar la posición de la cabeza de la rata. Gire la cabeza (aproximadamente 30° en sentido horario) para que la bobina de superficie (figura 5A) se puede colocar justo por encima de la corteza del cañón izquierdo estando horizontal y situado en el centro del imán dentro del imán.
2. Coloque la bobina de superficie, fijar en el cerebro de la rata usando cinta adhesiva (figura 5B) y compruebe que la vela mueva correctamente (movimiento anteroposterior, sin rotación y sin fricción de la vela) cuando el sistema de soplo de aire es convertido en; luego, apagar el interruptor general.
3. Compruebe que la vela se mueva correctamente una vez que la cama está dentro del imán cuando el sistema de soplo de aire. A continuación, apáguelo.
4. Compruebe la rata se coloca correctamente utilizando una secuencia de localización. Definir los parámetros como sigue: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; promedio = 1; repetición = 1; rodaja = 1 mm; tamaño de imagen = 256 x 256; Campo de visión = 50 x 50 mm; tiempo de exploración = 12 s ms 800.
   1. Arrastre la ficha secuencia de localizador en la ventana nombre de instrucciones y haz clic en la ficha continuar para ejecutar el programa de exploración.
5. Cuando la localización cerebral es correcta, arrastre la ficha secuencia de T2_TurboRARE en la ventana nombre de instrucciones y haga clic en continuar para ejecutar el programa de exploración. Estas imágenes anatómicas, junto con la anterior adquisición de fMRI audaz, permitirá la correcta localización de lo voxel en el S1BF MRS.
   Nota: Los parámetros de la T2_TurboRARE son 14 rebanadas, 2 mm por rebanada, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5.000 ms, matriz = 128 x 128, tiempo de secuencia = 2 min 40 s.
6. Arrastre la ficha secuencia de láser en la ventana nombre de instrucción , lugar de voxel (alto 2 mm, 2,5 mm de largo, 3 mm de profundidad) en el centro de la zona de S1BF.
   1. Utilizar un atlas del cerebro de rata y la mejora del BOLD fMRI para localizar la zona en las imágenes T2 (figura 6). Haga clic en la ficha de la plataforma de ajuste para abrir la instrucción exploración editado. Haga clic en la ficha de tambalearse y cambiar la impedancia (carga electrónica) de la bobina de recepción un poco a sintonizarla. Haga clic en la ficha aplicar terminado la puesta a punto para cerrar el editor de instrucciones y aplicar los cambios en la instrucción editado.
7. Registrar un mapa de₀ B y proceder a escanear calza y, luego, realizar una cuña de local.
   Nota: Para ver el mapa de₀ B, utilice los siguientes parámetros: primera vez de echo = 1,65 ms; TR = 20 ms, promedio = 1; tapa ángulo = 30°; espaciamiento del eco = 3,805 ms; rodaja = 58 mm; tamaño de imagen = 64 x 64 x 64; Campo de visión = 58 x 58 x 58 mm; tiempo de exploración = 1 m 24 s 920 Sra. para el calce de la exploración, utilice los siguientes parámetros: pulso gaussiano del vapor de la excitación selectiva de voxel; TE = 5 ms; tiempo de mezcla = 10 ms; duración de adquisición = 204,8 ms; ancho de banda = 10.000 Hz; tiempo de permanencia = 50 μs. Para el calce local, utilice los siguientes parámetros: supresión del agua, duración de la adquisición del VAPOR = 1.363,15 ms; puntos = 4.096; ancho de banda en Hz = 3.004,81 Hz; ancho de banda en ppm = 10 ppm; tiempo de permanencia = 166,40 μs; resolución espectral = 0,37 puntos Hz. Los parámetros del láser son: Eco tiempo = ms 19,26; TR = 2.500 ms; promedio = 128 o 32; tiempo de exploración = 5 min 20 s o 1 min 20 s; puntos de adquisición = 4.096.
8. Realizar a ¹H-MRS.
   1. Empezar a la ¹H-MRS adquisición primero durante un período de descanso (exploraciones LASER de 4 x 32 + 128 láser escanea; 2.500 ms por scan).
   2. Adquirir otra secuencia de localización (igual que el paso descrito en 5.3) para comparar con el primero de ellos grabado y asegurar que la rata no se ha movido durante la adquisición de láser.
   3. Realizar ¹H-MRS durante la activación de barba utilizando la secuencia de láser (exploraciones LASER de 4 x 32 + 128 láser escanea; 2.500 ms por scan) con el sistema de aire-puff (paradigma = 20 s de activación y 10 s de descanso).
   4. Una vez más, realizar una secuencia de localización para verificar si la rata se ha movido.
      Nota: El número de exploraciones y periodos de reposo/activación puede ser adaptado y modificado, pero siempre asegúrese de que la rata no está moviendo realizando periódicamente una secuencia de localización.
9. Llevar la cama a su posición inicial, quitar la bobina de superficie y retroceder a la rata a la banca. Inyectar el atipamezole en un pliegue de piel en la parte posterior de la rata para revertir la anestesia y despertarlo.

8. procesamiento de la señora del protón

1. Abra el software de LCModel y haga clic en la pestaña correspondiente para seleccionar el tipo de datos adecuado ( Decadencia de inducción libre archivo) y elegir el archivo correcto. Haga clic en la ficha OK cuando se hace.
2. Optimizar los parámetros de control de cuantificación paso a paso.
   1. En la sección título , manualmente Introduzca un título y definir una gama adecuada de ppm (p. ej., 0,2 a 4,0 ppm) escribiendo manualmente en el valor necesario en los campos correspondientes.
   2. En la sección de archivo de base , seleccione y descargue el archivo para colocar correctamente la base de la macromolécula (puede ser proporcionado por el proveedor del software).
   3. Definir y cargar los parámetros de control de entrada. Preparar la operación de guardar proceso de todo tipo de archivos útiles previamente (tabla = mesas compactas; PS = salida de PostScript necesario; CSV = formato para hojas de cálculo; COORD = coordenadas de parcelas). Haga clic en la ficha de RunLCModel para iniciar la cuantificación de LCModel.
3. Definir metabolitos seleccionadas para generar estadísticas.
   Nota: LCModel ofrece cuantificación de metabolitos y estimaciones de errores por un valor que se llama cota inferior de Cramér-Rao (CRLB). Un valor con un CRLB < 15 se considera como una cuantificación óptima. Un CRLB > 25 indica un valor poco fiable.

Resultados

Este protocolo permite la cuantificación de las fluctuaciones de metabolitos durante la activación cerebral, que se obtiene por la estimulación de la barba derecha directamente en el imán.

En este estudio, el objetivo general del fMRI audaz era comprobar que la estimulación de la barba era eficiente, visualizar la zona de S1BF activada y para ubicar correctamente el voxel ¹H-fMRS. El dispositivo incorporado para ...

Discusión

La corteza del cañón, también llamada S1BF de la corteza somatosensorial o campo de barril, es una región dentro de la capa cortical IV que se puede observar mediante citocromo c oxidasa tinción⁹, y su organización es conocida ya que ha sido descrito en gran parte ^10,11. Uno vibrisas está conectado a un barril, en que unos 19.000 neuronas se organizan en una columna¹². La vía de la barba a barril corteza tie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL syringe with needle	Becton, Dickinson and Company, USA	2020-10	0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil	Bruker, Ettlingen, Germany	T116344
7T Bruker Biospec system	Bruker, Ettlingen, Germany	70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device	custom made
Atipamezole	Vétoquinol, S.A., France	V8335602	Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask	custom made
Eye ointment	TVM laboratoire, France	40365	Ocry gel 10 g
Induction chamber	custom made		30x17x15 cm
Inlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3	Surgivet, Harvard Apparatus	WWV90TT	from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation	Vertflurane, Virbac, France	QN01AB06	1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump	KD sientific, Holliston, USA	Legato 110
LCModel software	LCModel Inc., Ontario, Canada	6.2
Medetomidine hydrochloride	Vétoquinol, S.A., France	QN05CM91	Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI912
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI925
Monitoring system of physiologic parameter	SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA	Model 1025
NaCl	Fresenius Kabi, Germany	B05XA03	0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software	Bruker, Ettlingen, Germany	6.0.1
Peripheral intravenous catheter	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SP500930S	22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil	Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution	Choai, Sanofi, Paris, France	B01AB01	5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting	Burkert, Germany	3099939	Model type 6013
Terumo 2 ml syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SY243	with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	05SE1
Wistar RJ-Han rats	Janvier Laboratories, France