Funcionais de ressonância magnética espectroscopia em 7 T no córtex de barril de rato durante a ativação dos whiskers

Resumo

Após a verificação pelo sangue-oxigénio-dependente de nível funcional de ressonância magnética (fMRI bold (realce)) que a área correspondente do córtex campo barril somatossensorial (chamada S1BF) corretamente é ativado, o principal objetivo deste estudo é quantificar o teor de lactato flutuações nos cérebros rato ativado por espectroscopia de ressonância magnética de prótons localizados (¹H-MRS) em 7 T.

Resumo

Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) oferece a oportunidade de medir metabólito cerebral conteúdo em vivo e de forma não invasiva. Graças a evolução tecnológica ao longo da última década e o aumento da intensidade do campo magnético, é agora possível obter boa resolução espectros na vivo no cérebro de ratos. Neuroenergetics (ou seja, o estudo do metabolismo cerebral) e, especialmente, metabólicas interações entre os diferentes tipos de células têm atraído cada vez mais interesse nos últimos anos. Entre estas interações metabólicas, a existência de um serviço de transporte de lactato entre neurônios e astrócitos ainda é debatida. É, assim, de grande interesse para realizar espectroscopia de ressonância magnética funcional próton (¹H-MRS) em um modelo do rato de lactato de monitor e ativação do cérebro. No entanto, o pico de lactato de metila sobrepõe-se picos de ressonância de lipídios e é difícil de quantificar. O protocolo descrito abaixo permite metabólico e lactato flutuações para ser monitorado em uma área do cérebro ativada. Ativação cerebral é obtida pela estimulação dos whiskers e ¹H-MRS é executada no córtex ativado barril correspondente, cuja área é detectada usando sangue-oxigénio-dependente de nível ressonância magnética funcional (fMRI bold (realce)). Todas as etapas são descritas: a escolha dos anestésicos, bobinas e sequências, alcançar a estimulação eficiente whisker diretamente no ímã e processamento de dados.

Introdução

O cérebro possui mecanismos intrínsecos que permitem a regulação do seu principal substrato (ou seja, glicose), tanto por sua contribuição e sua utilização, dependendo de variações na atividade cerebral local. Embora a glicose é o substrato principal energia para o cérebro, experimentos realizados nos últimos anos têm mostrado que lactato, que é produzido pelos astrócitos, poderia ser um substrato de energia eficiente para os neurônios. Isto levanta a hipótese de uma nave de lactato entre astrócitos e neurônios¹. Conhecido como ANLS, para transporte de lactato neurônio astrocyte², a teoria é ainda altamente controversa, mas levou a proposta a glicose, ao invés de ir diretamente para os neurônios, podem entrar os astrócitos, onde é metabolizado em lactato, um metabólito que é , em seguida, transferido para os neurônios, que usá-lo como substrato de energia eficiente. Se um serviço de transporte existe na vivo, ele teria várias consequências importantes, tanto para a compreensão das técnicas básicas em funcionais de imagem cerebral (tomografia por emissão de pósitrons [PET]) e para decifrar as alterações metabólicas observadas em patologias do cérebro.

Para estudar o metabolismo cerebral e, particularmente, metabólicas interações entre neurônios e astrócitos, quatro principais técnicas estão disponíveis (não incluindo micro-/ nanosensors): autoradiografia, PET, microscopia confocal fluorescente de dois fotões e MRS. Autoradiografia foi um dos primeiros métodos propostos e fornece imagens da acumulação regional de radioactivo ¹⁴C-2-deoxyglucose em fatias do cérebro, enquanto PET rendimentos na vivo imagens de captação regional de radioativo ¹⁸ F-deoxyglucose. Ambos têm a desvantagem de usar as moléculas ao produzir imagens de baixa-resolução. Microscopia de dois fotões fornece celular resolução de sondas fluorescentes, mas espalhamento de luz por tecido limita a profundidade de imagem. Estas três técnicas foram usadas anteriormente para estudar neuroenergetics em roedores durante estimulação Suiça^3,4,5,de⁶. Na vivo MRS tem a dupla vantagem de ser não-invasiva e nonradioactive, e qualquer estrutura cerebral pode ser explorada. Além disso, a MRS pode ser executada durante a ativação neuronal, uma técnica chamada MRS funcional (fMRS), que tem sido desenvolvido muito recentemente em roedores⁷. Portanto, propõe-se um protocolo para monitorar o metabolismo do cérebro durante a atividade cerebral por ¹H-MRS na vivo e de forma não invasiva. O procedimento é descrito em ratos adultos saudáveis com ativação cerebral obtida por uma estimulação de whisker ar-sopro executada diretamente em uma imagem de ressonância magnética (RM) T 7, mas pode ser adaptado em animais geneticamente modificados, assim como em qualquer condição patológica .

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Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes de Experimentação Animal da Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). O protocolo conheceu as diretrizes éticas do Ministério francês de agricultura e florestas e foi aprovado pelas comissões de ética locais (Comitê d 'éthique pour l'' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).

Nota: Durante as medições do senhor, um nível adequado de anestesia e monitorização fisiológica (temperatura corporal, frequência respiratória) são requisitos indispensáveis.

1. os animais

1. Use ratos Wistar machos, pesando entre 350 e 450 g.
2. Mantê-los em um 12:12 h luz: escuro ciclo e providenciar comida e água ad libitum.

2. anestesia

1. Preparar o equipamento necessário para anestesia (figura 1A, B, consulte Tabela de materiais): uma seringa de 5 mL contendo medetomidina em solução salina fisiológica (240 µ g/kg/h, com uma taxa de perfusão de 20 µ l/min), contendo uma seringa de 0,5 mL atipamezole (20 μL, em 0,5 mL de solução salina) e pomada.
   Nota: Manter todos os equipamentos sob o exaustor, exceto a seringa de 5 mL contendo medetomidina, que é colocada na bomba de seringa perto o ímã para anestesia durante aquisições do senhor.
2. Colocar o rato na câmara de indução, iniciar a anestesia, entregando a 4% de isoflurano e ajustar a taxa de fluxo de oxigênio a 1,5 L/min.
3. Avalie a profundidade da anestesia, avaliando a retirada da pata reflexos.
4. Quando o rato não responde à estimulação, tirá-lo da caixa de anestesia, colocá-lo no banco com seu nariz da máscara de isoflurano e manter anestesia entregando 2,5% em oxigênio a 1,5 L/min.
5. Suavemente a cauda de massagem e coloque o torniquete (Figura 1).
   Nota: A massagem pode ser executada em água morna, com uma temperatura entre 38 e 42 ° C, para obter melhor vasodilatação das veias.
6. Inserir o cateter intravenoso periférico (22 G), anteriormente heparinizado, na veia de cauda esquerda ou direita. Observe que um retorno venoso é observado (uma gota de sangue é visível na parte distal da agulha) quando o cateter está correctamente inserido (Figura 1).
7. Apague quaisquer bolhas de ar presentes no volume de espaço morto cateter utilizando a seringa de 2 mL contendo heparina e soro fisiológico.
8. Aplicar a pomada e preparar a seringa contendo atipamezole (17 µ g/mL) para despertar o rato no final do experimento.

3. rato colocação em ímã para estimulação dos whiskers

1. Coloque um sensor de respiração na cama ímã e depois transferir o rato do banco para a cama do ímã. Coloque-a na posição de bruços com seu nariz da máscara de isoflurano, com o sensor de respiração, localizado entre as costelas e a cama do ímã.
   Nota: Todos os equipamentos que entra no quarto de MRI devem ser MRI-seguro.
2. Diminuir o isoflurano (de 4% a 1,5%-2%) durante a colocação do rato e alternar a anestesia para medetomidina no final deste procedimento. Certifique-se de que os bigodes são livres, ter cortado a borda direita na frente do rato cama MRI previamente para permitir o movimento dos bigodes.
3. Mantenha o rato em posição com fita e monitorar sua respiração, que deve estar entre 60 e 80 respirações por minuto.
4. Fazer uma vela que intercepta bigodes bem a fita de papel (Figura 2). Alinhe o tubo de saída flexível do sistema de sopro de ar ao longo do rato cama de MRI para que a parte, saindo do tubo perpendicular e em cerca de 1,5 cm da vela. Corrigi-lo com fita de papel.

4. whisker estimulação

1. Conecte a tubulação de entrada flexível de uma fonte de ar comprimido (1 bar) para uma entrada de válvula de controle do solenoide e o tubo de saída para a saída de válvula de controle do solenoide (Figura 3). Certifique-se de que a válvula de controle do solenoide permanece fora da sala de ímã.
2. Ligue o dispositivo de pulsação na válvula de solenoide e do ímã usando a lógica transistor-transistor (TTL)-port. Configurá-lo para que a frequência de pulsação = 8 Hz, tempo de pulsante = 20 s e o tempo de descanso = 10 s.
   Nota: Estes parâmetros, visualizados no cristal líquido pequeno visor (LCD), são ajustável através os três potenciômetros analógicos dedicados. O dispositivo eletrônico de pulsação, que controla o paradigma, deve ser composto de componentes eletrônicos de alta qualidade para evitar qualquer desvio em parâmetros de tempo (de pós-processamento correto).

5. BOLD fMRI aquisição

1. Coloque o cérebro de rato, para que fique em uma posição ereta e use as barras de orelha para mantê-la. Coloque a bobina de matriz de volume acima da cabeça do rato (Figura 4A) e fixe-o com a fita. Verificar que a vela está se movendo corretamente (movimento ântero-posterior, sem rotação e sem atrito da vela) quando o sistema de ar-sopro é ativada em; em seguida, desligá-lo.
2. Insira a bobina e a cama no centro do ímã. Verifique se a vela está ainda em movimento corretamente uma vez que a cama está no interior do íman, quando o sistema de ar-sopro é em; em seguida, desligá-lo. Mudar completamente de isoflurano a medetomidina (taxa de perfusão: 20 µ l/min).
3. Verifique que o rato está bem localizado usando uma sequência de localização (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; média = 1; repetição = 1; fatia = 1 mm; tamanho da imagem = 256 x 256; campo de visão (FOV) = 50 x 50 mm; tempo de varredura = 12 s 800 ms). Arraste a guia sequência de localizador para o nome de instrução e clique em continuar.
4. Arraste a guia sequência de T2_Star_FID_EPI para o nome da instrução, centro o FOV no meio do cérebro e clique na guia de plataforma de ajuste para abrir a instrução de varredura editado. Gravar o mapa B₀ e avançar para um calço de varredura.
   Nota: Para um mapa de₀ B, use os seguintes parâmetros: primeira vez Eco = 1,65 ms; TR = 20 ms, médias = 1; ângulo da aleta = 30°; espaçamento de eco = 3,805 ms; fatia = 58 mm; tamanho da imagem = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; tempo de varredura = 1 m 24 s 920 MS. para digitalizar shim, use os seguintes parâmetros: excitação seletiva voxel = pulso gaussiano de vapor; TE = 5 ms; tempo de mistura = 10 ms; duração de aquisição = 204,8 ms; largura de banda = 10.000 Hz; tempo de interrupção = 50 μs).
5. Iniciar a sequência de Star_FID_EPI T2 (TE = 16,096 ms; TR = 500 ms; média = 1; repetição = 600; fatia = 1 mm; quatro fatias consecutivas; tamanho da imagem = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; largura de banda = 333.333,3 Hz; tempo de varredura = 5 min 00 s).
   Nota: Devido a porta TTL, um sinal do disparador externo iniciará o sistema de ar-puff ao mesmo tempo. O paradigma = [20 s ativação + 10 resto s] x 10, para a duração total dos 600 exames, 500 ms por varredura. As fatias são centradas no meio da área de campo de barril.
6. Adquira outra sequência de localização (igual o um passo descrito em 5.3) para comparar com o primeiro e verifique se o rato foi movido durante a sequência de T2_Star_FID_EPI.
7. Trazer a cama para a posição inicial, retire a bobina de matriz de volume e conectar a bobina de superfície.

6. processamento de negrito

1. Abra o arquivo Star_FID_EPI T2 e ler a imagem de Star_FID_EPI T2 na Exibição de imagens. Abra a janela de start-up do controlador funcional, chamada FunController.
2. Nesta guia de processamento , selecione a janela da imagem latente funcional e definir o protocolo de estimulação (duração e alternância de On/Off períodos, correspondentes ao paradigma usado).
3. Selecione a janela de protocolo (dataset com 600 frames) e inserir o valor de 40 na aba No período e 20 na guia período clique na guia Atribuição de inverter e arraste o controle deslizante de Estados de estimulação para a esquerda para selecionar o valor 1.
4. Na janela de pré-processamento, clique no filtro de mediana no avião para pré-processamento e no filtro de mediana (2D, 3D) para pós-processamento.
5. Clique na aba executar e arraste o cursor para ajustar a tabela de pesquisa de sobreposição. Visualize a área cerebral ativada (Figura 4B).

7. protão MRS aquisições

1. Para posicionar corretamente a bobina de superfície, modifica a posição da cabeça do rato. Gire a cabeça (cerca de 30° no sentido horário) para que a bobina de superfície (Figura 5A) pode ser colocada logo acima do córtex esquerdo barril sendo horizontal e localizado no centro de ímã, quando no interior do íman.
2. Coloque a bobina de superfície, corrigi-lo em cérebro de ratos utilizando fita (Figura 5B) e verificar que a vela está se movendo corretamente (movimento ântero-posterior, sem rotação e sem atrito da vela) quando o sistema de ar-sopro é ativada em; em seguida, desligue o interruptor principal.
3. Verifique se a vela está se movendo corretamente uma vez que a cama está no interior do íman quando o sistema de ar-sopro é em. Em seguida, desligá-lo.
4. Verifique se que o rato está posicionado corretamente, usando uma sequência de localização. Definir parâmetros da seguinte forma: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; média = 1; repetição = 1; fatia = 1 mm; tamanho da imagem = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm; tempo de varredura = 12 s 800 ms.
   1. Arraste a guia sequência de localizador para a janela de nome de instrução e clique em continuar para executar o programa de digitalização.
5. Quando a localização do cérebro está correta, arraste a aba de sequência de T2_TurboRARE na janela nome da instrução e clique em continuar para executar o programa de digitalização. Estas imagens anatômicas, juntamente com a aquisição de BOLD fMRI anterior, permitirá a localização correta do voxel no S1BF para a Sra.
   Nota: Os parâmetros de T2_TurboRARE são 14 fatias, 2 mm por fatia, FOV = 2.5 x 2.5 cm, TE = 100 ms, TR = 5.000 ms, matriz = 128 x 128, tempo de sequência = 2 min 40 s.
6. Arraste a guia sequência LASER para a janela de nome de instrução , coloque o voxel (2 mm de altura, 2,5 mm de comprimento, 3 mm de profundidade) no centro da área de S1BF.
   1. Use um atlas de cérebro de rato e o reforço de fMRI bold (realce) para localizar a zona nas imagens T2 (Figura 6). Clique na guia de plataforma de ajuste para abrir a instrução de varredura editado. Clique na guia Wobble e alterar a impedância (carregamento electrónico) da bobina de recebimento ligeiramente para ajustá-lo. Clique na guia aplicar quando o ajuste é concluído para fechar o editor de instrução e aplicar as alterações na instrução editada.
7. Gravar o mapa B₀ e proceder a varredura shim e, em seguida, executar uma correção local.
   Nota: Para ver o mapa de₀ B, use os seguintes parâmetros: primeira vez Eco = 1,65 ms; TR = 20 ms, médias = 1; ângulo da aleta = 30°; espaçamento de eco = 3,805 ms; fatia = 58 mm; tamanho da imagem = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; tempo de varredura = 1 m 24 s 920 MS. para a correção de varredura, use os seguintes parâmetros: voxel excitação seletiva vapor Gaussian o pulso; TE = 5 ms; tempo de mistura = 10 ms; duração de aquisição = 204,8 ms; largura de banda = 10.000 Hz; tempo de interrupção = 50 μs. Para a correção de local, use os seguintes parâmetros: supressão de água, VAPOR de duração de aquisição = 1.363,15 ms; pontos = 4.096; largura de banda em Hz = 3.004,81 Hz; largura de banda em ppm = 10 ppm; tempo de interrupção = 166,40 μs; resolução espectral = 0,37 Hz/pontos. Os parâmetros do LASER são: tempo de eco = ms 19,26; TR = 2.500 ms; média = 128 ou 32; tempo de varredura = 5 min 20 s ou 1 min 20 s; pontos de aquisição = 4.096.
8. Execute ¹H-Sra.
   1. Iniciar a ¹H-MRS aquisição primeiro durante um período de descanso (varreduras LASER 4 x 32 + 128 LASER scans; 2.500 ms por varredura).
   2. Adquira outra sequência de localização (igual o um passo descrito em 5.3) para comparar com o primeiro gravado e certifique-se de que o rato não mudou durante a aquisição de LASER.
   3. Executar ¹H-MRS durante a ativação dos whiskers, usando a sequência LASER (varreduras LASER 4 x 32 + 128 LASER scans; 2.500 ms por varredura) com o sistema de ar-sopro (paradigma = 20 s de ativação e 10 s de descanso).
   4. Mais uma vez, execute uma sequência de localização para verificar se o rato foi movido.
      Nota: O número de varreduras e períodos de repouso/ativado pode ser adaptado e modificado, mas certifique-se sempre que o rato não está se movendo, regularmente, realizando uma sequência de localização.
9. Trazer a cama para a posição inicial, retire a bobina de superfície e mover o rato de volta para o banco. Atipamezole Injete uma prega de pele em volta do rato para inverter a anestesia e despertá-lo.

8. protão MRS processamento

1. Abra o software LCModel e clique na guia apropriado para selecionar o tipo de dados corretos (arquivo de Decaimento livre de indução ) e escolher o arquivo certo. Clique na guia Okey , quando isso é feito.
2. Otimize os parâmetros de controle de quantificação passo a passo.
   1. Na seção de título , manualmente Insira um título e definir um intervalo adequado ppm (por exemplo, 0,2 a 4.0 ppm) digitando manualmente o valor necessário nos respectivos campos.
   2. Na seção de arquivo de base , selecionar e baixar o arquivo necessário para ajustar a linha de base da macromolécula corretamente (pode ser fornecida pelo provedor do software).
   3. Definir e carregar os parâmetros de controle de entrada. Preparar a salvar processo de antemão todos os tipos de arquivo útil (tabela = quadros compacto; PS = necessária saída PostScript; CSV = formato para planilhas; COORD = coordenadas para parcelas). Clique na guia RunLCModel para iniciar a quantificação de LCModel.
3. Defina metabolitos selecionados para gerar estatísticas.
   Nota: LCModel fornece quantificação metabólito e estimativas de erros por um valor denominado limite inferior de Cramér-Rao (nenhuma). Um valor com uma casa < 15 é considerado como uma quantificação ideal. Uma casa > 25 indica um valor não-confiável.

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Resultados

Este protocolo permite a quantificação das flutuações do metabólito durante a ativação cerebral, que é obtida pela estimulação dos whiskers certo diretamente no imã.

Neste estudo, o objetivo geral de fMRI bold (realce) foi verificar que a estimulação dos whiskers era eficiente, para visualizar a área de S1BF registrada e para localizar corretamente o voxel para ¹H-fMRS. O dispositivo construído para ati...

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Discussão

O córtex de tambor, também chamado S1BF para o córtex somatossensorial ou barril de campo, é uma região dentro da camada cortical IV que pode ser observada usando o citocromo c oxidase coloração⁹, e sua organização é bem conhecida, uma vez que foi amplamente descrito ^10,11. Um vibrissa é conectado a um barril, no qual cerca de 19.000 neurônios organizam-se em uma coluna de¹². O caminho do córtex whisker...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL syringe with needle	Becton, Dickinson and Company, USA	2020-10	0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil	Bruker, Ettlingen, Germany	T116344
7T Bruker Biospec system	Bruker, Ettlingen, Germany	70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device	custom made
Atipamezole	Vétoquinol, S.A., France	V8335602	Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask	custom made
Eye ointment	TVM laboratoire, France	40365	Ocry gel 10 g
Induction chamber	custom made		30x17x15 cm
Inlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3	Surgivet, Harvard Apparatus	WWV90TT	from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation	Vertflurane, Virbac, France	QN01AB06	1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump	KD sientific, Holliston, USA	Legato 110
LCModel software	LCModel Inc., Ontario, Canada	6.2
Medetomidine hydrochloride	Vétoquinol, S.A., France	QN05CM91	Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI912
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI925
Monitoring system of physiologic parameter	SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA	Model 1025
NaCl	Fresenius Kabi, Germany	B05XA03	0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software	Bruker, Ettlingen, Germany	6.0.1
Peripheral intravenous catheter	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SP500930S	22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil	Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution	Choai, Sanofi, Paris, France	B01AB01	5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting	Burkert, Germany	3099939	Model type 6013
Terumo 2 ml syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SY243	with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	05SE1
Wistar RJ-Han rats	Janvier Laboratories, France