La spectroscopie par résonance magnétique fonctionnelle à 7 T dans le Cortex de baril de Rat pendant l’Activation de Whisker

Résumé

Après avoir vérifié par sang-oxygène-dépendante du niveau fonctionnel de l’imagerie par résonance magnétique (IRMf BOLD) que la superficie correspondante de cortex champ de baril somatosensoriel (appelée S1BF) est bien activée, le principal objectif de cette étude est de quantifier la teneur en lactates fluctuations dans le cerveau de rat activés par spectroscopie de résonance magnétique de proton localisé (¹H-MRS) à 7 T.

Résumé

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) offre la possibilité de mesurer le métabolite cérébral contenu in vivo et non invasive. Grâce aux développements technologiques au cours de la dernière décennie et l’augmentation de l’intensité du champ magnétique, il est maintenant possible d’obtenir bonne résolution spectres in vivo dans le cerveau de rat. Neuroenergetics (c'est-à-dire, l’étude du métabolisme cérébral) et, surtout, les interactions métaboliques entre les différents types de cellules ont suscité un intérêt de plus en plus ces dernières années. Parmi ces interactions métaboliques, l’existence d’une navette de lactate entre les neurones et les astrocytes est encore discutée. Il est, donc, d’un grand intérêt à effectuer la spectroscopie de résonance magnétique de proton fonctionnelle (¹H-MRS) dans un modèle de rat de lactate de moniteur et d’activation cérébrale. Toutefois, le pic de lactate de méthyle chevauche les pointes de résonance des lipides et est difficile à quantifier. Le protocole décrit ci-dessous permet métabolique et les fluctuations à surveiller dans une zone du cerveau activées du lactate. Activation cérébrale est obtenue par la stimulation de la moustache et ¹H-MRS est exécuté dans le cortex de baril activés correspondantes, dont la superficie est détectée à l’aide de l’oxygène-sang-dépendante du niveau fonctionnel résonance magnétique (IRMf BOLD). Toutes les étapes sont décrites en détail : le choix des anesthésiques, bobines et séquences, réaliser une stimulation efficace whisker directement dans l’aimant et le traitement des données.

Introduction

Le cerveau possède des mécanismes intrinsèques qui permettent la régulation de son principal substrat (c.-à-d., glucose), tant pour sa contribution et son utilisation, selon les variations de l’activité cérébrale locale. Bien que le glucose est le substrat de l’énergie principale pour le cerveau, les expériences réalisées ces dernières années ont montré que lactate, qui est produite par les astrocytes, pourrait être un substrat d’efficacité énergétique pour les neurones. Cela soulève l’hypothèse d’une navette de lactate entre les neurones et les astrocytes¹. Connu comme ANLS, astrocyte-neurone lactate navette², la théorie est encore très débattue mais a conduit à proposer ce glucose, plutôt que d’entrer directement dans les neurones, peut entrer les astrocytes, où il est métabolisé en lactate, un métabolite qui est , puis, transférée aux neurones, qui sert de substrat énergétique efficace. Si telle une navette existe en vivo, cela aurait plusieurs conséquences importantes, tant pour la compréhension des techniques de base en imagerie cérébrale fonctionnelle (tomographie par émission de positons [PET]) que pour déchiffrer les altérations métaboliques observées dans les pathologies cérébrales.

Pour étudier le métabolisme cérébral et, particulièrement, les interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes, les quatre principales techniques sont disponibles (non compris les micro / nano-capteurs) : autoradiographie, PET, microscopie confocal fluorescence biphotonique et Mme. Autoradiographie était l’une des premières méthodes proposées et fournit des images de l’accumulation régionale de radioactif ¹⁴C-2-désoxyglucose dans des tranches de cerveau, tout en PET rendements in vivo des images de la capture régionale de radioactifs ¹⁸ F-désoxyglucose. Les deux ont l’inconvénient de l’utilisation de molécules irradiative tout en produisant des images à résolution spatiale faible. Microscopie biphotonique offre une résolution cellulaire des sondes fluorescentes, mais la diffusion de la lumière par le tissu limite la profondeur d’imagerie. Ces trois techniques ont servi auparavant à étudier les neuroenergetics chez les rongeurs pendant whisker stimulation^3,4,5,6. In vivo MRS a le double avantage d’être non invasive et non radioactif, et toute la structure du cerveau peut être explorée. En outre, MRS peut être effectuée au cours de l’activation neuronale, une technique appelée MRS fonctionnelle (rapports de gestion financière), qui a été développé très récemment dans les rongeurs⁷. Par conséquent, un protocole pour contrôler le métabolisme cérébral au cours de l’activité cérébrale par ¹H-MRS in vivo et de façon non invasive est proposé. La procédure est décrite chez des rats adultes en bonne santé avec activation du cerveau obtenue par une stimulation de moustaches air-pouf effectuée directement dans un imageur par résonance magnétique (RM) de T à l’adresse 7 mais peut être adaptée chez les animaux génétiquement modifiés, ainsi que dans un état pathologique .

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux directives expérimentation animale européenne communautés la directive du Conseil du 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Le protocole a rencontré les directives éthiques du Ministère Français de l’Agriculture et des forêts et a été approuvé par les comités d’éthique locaux (Comité d « éthique versez L » expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).

NOTE : Lors de la mesure de Monsieur, un niveau adéquat d’anesthésie et en surveillance physiologique (température corporelle, la fréquence respiratoire) sont des exigences indispensables.

1. les animaux

1. Utiliser des rats Wistar mâles pesant entre 350 et 450 g.
2. Conservez-les sur un 12:12 h de lumière : obscurité cycle et fournir de la nourriture et l’eau ad libitum.

2. anesthésie

1. Préparer le matériel nécessaire pour l’anesthésie (Figure 1 a, B, voir la Table des matières) : une seringue de 5 mL contenant médétomidine en solution saline physiologique (240 µg/kg/h, avec un taux de perfusion de 20 µL/min), une seringue de 0,5 mL contenant atipamézole (20 μL, dans 0,5 mL de solution saline) et pommade ophtalmique.
   Remarque : Conservez tout le matériel sous la hotte aspirante, sauf la seringue de 5 mL contenant médétomidine, qui est placé dans le pousse-seringue autour de l’aimant pour l’anesthésie au cours de l’acquisition de Monsieur.
2. Placez le rat dans la chambre de l’induction, démarrer l’anesthésie en livrant 4 % isoflurane et régler le débit d’oxygène à 1,5 L/min.
3. Évaluer la profondeur de l’anesthésie en évaluant le retrait des réflexes de la patte.
4. Lorsque le rat ne répond pas à la stimulation, sortir de la boîte de l’anesthésie, placez-le sur le banc avec son nez dans le masque de l’isoflurane et maintenir l’anesthésie en livrant de 2,5 % dans l’oxygène à 1,5 L/min.
5. Doucement masser la queue et placer le tourniquet (Figure 1).
   NOTE : Le massage peut être effectué dans l’eau tiède, avec une température entre 38 et 42 ° C, pour obtenir une meilleure vasodilatation des veines.
6. Insérer le cathéter intraveineux périphérique (22 G), précédemment hépariné, dans la veine caudale gauche ou à droite. Notez qu’on observe un retour veineux (une goutte de sang est visible à la partie distale de l’aiguille) lorsque le cathéter est correctement inséré (Figure 1).
7. Souffler les bulles d’air présentes dans le volume d’espace mort de cathéter à l’aide de la seringue de 2 mL contenant de l’héparine et solution de sérum physiologique.
8. Appliquer la pommade oculaire et préparer la seringue contenant atipamézole (17 µg/mL) pour réveiller le rat à la fin de l’expérience.

3. rat Placement dans Magnet pour la Stimulation Whisker

1. Placer un capteur de respiration sur le lit de l’aimant et ensuite transférer le rat sur le banc pour le lit de l’aimant. Placez-le en position couchée avec son nez dans le masque de l’isoflurane, avec le capteur de respiration situé entre la cage thoracique et le lit de l’aimant.
   Remarque : Tout le matériel qui entre dans la salle de MRI devrait être MRI-safe.
2. Diminuer l’isoflurane (de 4 % à 1,5 %-2 %) pendant le placement de rat et basculez l’anesthésie médétomidine à la fin de cette procédure. Veiller à ce que les moustaches de droite sont libres, ayant coupé le bord droit à l’avant du rat lit MRI au préalable pour permettre le mouvement des moustaches.
3. Tenez le rat en place avec du ruban adhésif et surveiller sa respiration qui doit être comprise entre 60 et 80 respirations / minute.
4. Faire une voile qui intercepte les moustaches tout droits dans la bande de papier (Figure 2). Aligner le tuyau d’évacuation flexible du système air-souffle le long de la rat lit MRI afin que la partie sortant du tube est perpendiculaire et à environ 1,5 cm de la voile. Fixez-le avec du ruban de papier.

4. whisker Stimulation

1. Connectez le tuyau flexible d’arrivée d’une source d’air comprimé (1 bar) à une entrée de soupape de commande de solénoïde et le tuyau d’évacuation à la sortie de vanne de contrôle solénoïde (Figure 3). S’assurer que l’électrovanne de contrôle reste à l’extérieur de la salle de l’aimant.
2. Branchez le périphérique "pulsé" de l’électrovanne et à l’aimant à l’aide de la logique de transistor-transistor (TTL)-port. Configurez-le afin que la fréquence de pulsation = 8 Hz, le temps de "pulsé" = 20 s et le temps de repos = 10 s.
   Remarque : Ces paramètres, visualisées sur le petit cristaux liquides (LCD) écran de visualisation, sont réglable via les potentiomètres analogiques dédiés trois. Le dispositif électronique "pulsé", qui contrôle le paradigme, doit être composé de composants électroniques de haute qualité afin d’éviter toute dérive dans les paramètres de temps (pour le post-traitement correcte).

5. "BOLD" IRMf Acquisition

1. Placer le cerveau du rat pour qu’il soit en position verticale et utilisez les barres de l’oreille de le pour entretenir. Placer la bobine de tableau volume dessus de tête de rat (Figure 4 a) et fixez-le à l’aide de ruban adhésif. Vérifier que la voile se déplace correctement (mouvement antéro-postérieur, sans rotation et sans frottement de voile) lorsque le système air-puff est tourné sur; puis, éteignez-le.
2. Insérer le lit et la bobine dans le centre de l’aimant. Vérifier que la voile se déplace encore correctement une fois que le lit est à l’intérieur de l’aimant lorsque le système air-puff est sur; puis, éteignez-le. Passer complètement d’isoflurane à médétomidine (taux de perfusion : 20 µL/min).
3. Vérifiez que le rat est bien situé à l’aide d’une séquence de localisation (TE = 2,5 ms ; TR = 100 ms ; moyenne = 1 ; répétition = 1 ; tranche = 1 mm ; taille de l’image = 256 x 256 ; champ de vision (FOV) = 50 x 50 mm ; temps de scan = 12 s 800 ms). Faites glisser l’onglet de séquence d’alignement de piste dans le nom de l’Instruction et cliquez sur continuer.
4. Faites glisser l’onglet séquence de T2_Star_FID_EPI dans le nom de l’Instruction, centre du champ de vision sur le milieu du cerveau et cliquez sur l’onglet de la plate-forme d’ajustement pour ouvrir l’instruction scan édité. Enregistrer une carte de₀ B et procéder à un balayage de cale.
   Remarque : Pour une carte de₀ B, utilisez les paramètres suivants : première fois écho = 1,65 ms ; TR = 20 ms, moyennes = 1 ; Flip angle = 30° ; écho d’espacement = 3,805 ms ; tranche = 58 mm ; taille de l’image = 64 x 64 x 64 ; FOV = 58 x 58 x 58 mm ; temps de scan = 1 m 24 s 920 Mme pour scan shim, utilisez les paramètres suivants : voxel excitation sélective = impulsion gaussienne de vapeur ; TE = 5 ms ; temps de mélange = 10 ms ; durée d’acquisition = 204,8 ms ; bande passante maximale = 10 000 Hz ; temps de pause = 50 μs).
5. Démarrer la séquence T2 Star_FID_EPI (TE = 16,096 ms ; TR = 500 ms ; moyenne = 1 ; répétition = 600 ; tranche = 1 mm ; quatre coupes consécutives ; taille de l’image = 128 x 128 ; FOV = 20 x 20 mm ; bande passante maximale = 333 333,3 Hz ; temps de scan = 5 min 00 s).
   Remarque : En raison du port TTL, déclenchant un signal extérieur démarre le système air-pouf en même temps. Le paradigme = [20 s activation + 10 reste s] x 10, pour toute la durée des 600 scannes, 500 ms par balayage. Les tranches sont centrées sur le milieu de la zone de champ de baril.
6. Acquérir une autre séquence de localisation (identique à l’étape décrite dans un 5.3) permettant de comparer avec le premier et vérifiez si le rat se déplace au cours de la séquence T2_Star_FID_EPI.
7. Mettre le lit dans sa position initiale, retirer la bobine de tableau de volume et raccorder la bobine de surface.

6. "BOLD" traitement

1. Ouvrez le fichier Star_FID_EPI T2 et lire l’image T2 Star_FID_EPI dans l’Affichage des images. Ouvrez la fenêtre de démarrage du contrôleur fonctionnel, appelé FunController.
2. Dans cet onglet traitement , sélectionnez la fenêtre d’imagerie fonctionnelle et de définir le protocole de stimulation (durée et alternance de On/Off périodes, correspondant au paradigme utilisé).
3. Sélectionnez la fenêtre protocole (dataset à l’aide de 600 cadres) et insérer la valeur de 40 dans l’onglet Sur la période et 20 dans l’onglet période , cliquez sur l’onglet Attribution d’inverser et faites glisser le curseur de Stimulation États vers la gauche pour sélectionner le valeur 1.
4. Dans la fenêtre de prétraitement, cliquez sur le filtre médian dans l’avion pour le prétraitement et le filtre médian (2D, 3D) pour le post-traitement.
5. Cliquez sur l’onglet Execute et faites glisser les curseurs pour ajuster la table de choix de superposition. Visualiser la zone du cerveau activées (Figure 4 b).

7. proton Mme Acquisitions

1. Positionner correctement la bobine de surface, modifier la position de la tête de rat. Rotation de la tête (dans le sens horaire d’environ 30°) pour que la bobine de surface (Figure 5 a) peut être placée juste au-dessus du cortex de baril gauche tout en étant horizontale et située au centre aimant quand à l’intérieur de l’aimant.
2. Placer la bobine de surface, fixez-le sur le cerveau du rat à l’aide de ruban adhésif (Figure 5 b) et vérifier que la voile se déplace correctement (mouvement antéro-postérieur, sans rotation et sans frottement de la voile) lorsque le système air-puff est tourné sur; ensuite, il éteindre à l’interrupteur principal.
3. Vérifier que la voile se déplace correctement une fois que le lit est à l’intérieur de l’aimant lorsque le système air-pouf est activé. Puis, éteignez-le.
4. Vérifier que le rat est positionné correctement en utilisant une séquence de localisation. Réglez les paramètres comme suit : TE = 2,5 ms ; TR = 100 ms ; moyenne = 1 ; répétition = 1 ; tranche = 1 mm ; taille de l’image = 256 x 256 ; FOV = 50 x 50 mm ; temps de scan = 12 s 800 ms.
   1. Faites glisser l’onglet de séquence d’alignement de piste dans la fenêtre nom d’Instruction et cliquez sur l’onglet de continuer d’exécuter le programme de numérisation.
5. Lorsque la localisation cérébrale est correcte, faites glisser l’onglet de séquence T2_TurboRARE dans la fenêtre nom d’Instruction et cliquez sur continuer pour exécuter le programme de numérisation. Ces images anatomiques, ainsi que de l’acquisition d’IRMf BOLD précédente, permettra la localisation correcte du voxel dans la S1BF profit de Mme.
   Remarque : Les paramètres T2_TurboRARE sont 14 tranches, 2 mm par tranche, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5 000 ms, matrice = 128 x 128, temps de séquence = 2 min 40 s.
6. Faites glisser l’onglet séquence LASER dans la fenêtre nom d’Instruction , placer le voxel (hauteur 2 mm, 2,5 mm de long, 3 mm de profondeur) au centre de la zone de S1BF.
   1. Utiliser un atlas de cerveau de rat et de l’amélioration de l’IRMf BOLD pour localiser la zone sur des images de T2 (Figure 6). Cliquez sur l’onglet de la plate-forme d’ajustement pour ouvrir l’instruction scan édité. Cliquez sur l’onglet Wobble et changement de l’impédance (chargement électronique) de la bobine de réception légèrement à tune. Cliquez sur l’onglet appliquer lorsque le réglage est terminé pour fermer l’éditeur de l’enseignement et appliquer les modifications dans l’instruction de modification.
7. Enregistrer une carte de₀ B et procéder au balayage shim et, ensuite, effectuer une cale locale.
   Remarque : Pour consulter la carte de₀ B, utilisez les paramètres suivants : première fois écho = 1,65 ms ; TR = 20 ms, moyennes = 1 ; Flip angle = 30° ; écho d’espacement = 3,805 ms ; tranche = 58 mm ; taille de l’image = 64 x 64 x 64 ; FOV = 58 x 58 x 58 mm ; temps de scan = 1 m 24 s 920 Mme pour la cale de balayage, utilisez les paramètres suivants : voxel pulsion gaussienne de le vapeur d’excitation sélective ; TE = 5 ms ; temps de mélange = 10 ms ; durée d’acquisition = 204,8 ms ; bande passante maximale = 10 000 Hz ; temps de pause = 50 μs. Pour la cale locale, utilisez les paramètres suivants : suppression de l’eau, durée d’acquisition de vapeur = 1 363,15 ms ; points = 4 096 ; bande passante en Hz = 3 004,81 Hz ; bande passante en ppm = 10 ppm ; temps de pause = 166,40 μs ; résolution spectrale = 0,37 Hz/points. Les paramètres LASER sont : temps d’écho = 19,26 ms ; TR = 2 500 ms ; moyenne = 128 ou 32 ; temps de scan = 5 min 20 s ou 1 min 20 s ; points d’achat = 4 096.
8. Effectuer ¹H-MRS.
   1. Le départ de la ¹H-MRS acquisition tout d’abord pendant une période de repos (scans LASER 4 x 32 + LASER 128 scans ; 2 500 ms par scan).
   2. Acquérir une autre séquence de localisation (identique à l’étape décrite dans un 5.3) pour comparer avec le premier enregistré et veiller à ce que le rat n’a pas bougé lors de l’acquisition du LASER.
   3. Effectuer ¹H-MRS lors de l’activation de moustaches à l’aide de la séquence LASER (scans LASER 4 x 32 + LASER 128 scans ; 2 500 ms par scan) avec le système air-pouf (paradigme = 20 s d’activation et 10 s de repos).
   4. Encore une fois, exécuter une séquence de localisation pour vérifier si le rat a déménagé.
      Remarque : Le nombre de scans et de périodes de repos/activé peut être adapté et modifié, mais toujours veiller à ce que le rat n’est pas en mouvement en effectuant régulièrement une séquence de localisation.
9. Mettre le lit dans sa position initiale, retirer la bobine de surface et reculer le rat à la magistrature. Injecter atipamézole dans un pli de peau fait en arrière du rat pour inverser l’anesthésie et réveiller il.

8. proton Mme traitement

1. Ouvrez le logiciel LCModel et cliquez sur l’onglet approprié pour sélectionner le type de données appropriée (fichier Free Induction Decay ) et sélectionnez le fichier. Cliquez sur l’onglet OK quand ce sera fait.
2. Optimiser les paramètres de contrôle de quantification étape par étape.
   1. Dans la section titre , entrez un titre et manuellement définir une gamme adéquate ppm (p. ex., 0,2 à 4,0 ppm) en tapant manuellement la valeur nécessaire dans leurs champs respectifs.
   2. Dans la section du fichier de base , sélectionnez et téléchargez le fichier requis pour s’adapter correctement à la base de la macromolécule (elle peut être fournie par le fournisseur du logiciel).
   3. Définir et charger les paramètres de contrôle d’entrée. Préparer l’enregistrement de tous les types de fichiers utiles au préalable (TABLE = tables compactes ; PS = nécessaire sortie PostScript ; CSV = format de feuilles de calcul ; COORD = coordonnées des emplacements). Cliquez sur l’onglet RunLCModel pour commencer la quantification LCModel.
3. Définir des métabolites sélectionnés pour produire des statistiques.
   NOTE : LCModel permet la quantification de métabolite et estimations des erreurs par une valeur appelée (CRLB) de Cramér-Rao lower bound. Une valeur avec un CRLB < 15 est considéré comme une quantification optimale. Un CRLB > 25 indique une valeur non fiable.

Résultats

Ce protocole permet la quantification des fluctuations de métabolite lors de l’activation cérébrale, qui est obtenue par la stimulation de la moustache droite directement dans l’aimant.

Dans cette étude, l’objectif global de l’IRMf BOLD était de vérifier que la stimulation de la moustache était efficace, pour visualiser la zone de S1BF activée et localiser correctement le voxel pour ¹H-rapports de gest...

Discussion

Le cortex de baril, également appelé S1BF pour le cortex somatosensoriel ou champ de canon, est une région au sein de la couche corticale IV que l'on peut observer à l’aide de la cytochrome c oxydase coloration⁹, et son organisation est bien connue car elle a été largement décrit ^10,11. Un vibrissa est connecté à un tonneau, dans lequel environ 19 000 neurones sont organisés en une colonne¹². La voie de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL syringe with needle	Becton, Dickinson and Company, USA	2020-10	0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil	Bruker, Ettlingen, Germany	T116344
7T Bruker Biospec system	Bruker, Ettlingen, Germany	70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device	custom made
Atipamezole	Vétoquinol, S.A., France	V8335602	Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask	custom made
Eye ointment	TVM laboratoire, France	40365	Ocry gel 10 g
Induction chamber	custom made		30x17x15 cm
Inlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3	Surgivet, Harvard Apparatus	WWV90TT	from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation	Vertflurane, Virbac, France	QN01AB06	1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump	KD sientific, Holliston, USA	Legato 110
LCModel software	LCModel Inc., Ontario, Canada	6.2
Medetomidine hydrochloride	Vétoquinol, S.A., France	QN05CM91	Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI912
Micropore roll of adhesive plaster	3M micropore, Minnesota, United States	MI925
Monitoring system of physiologic parameter	SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA	Model 1025
NaCl	Fresenius Kabi, Germany	B05XA03	0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe	Gardena, Germany	1348-20	4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software	Bruker, Ettlingen, Germany	6.0.1
Peripheral intravenous catheter	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SP500930S	22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil	Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution	Choai, Sanofi, Paris, France	B01AB01	5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting	Burkert, Germany	3099939	Model type 6013
Terumo 2 ml syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	SY243	with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe	Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon	05SE1
Wistar RJ-Han rats	Janvier Laboratories, France