Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Resumen

Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Resumen

La capacidad de aislar los tejidos embrionarios fue un paso esencial para establecer el sistema de pollo de codorniz quimera, que a su vez ha proporcionado contribuciones indiscutibles a develar procesos clave en la biología del desarrollo.

Es en este documento se describe un método optimizado para aislar los tejidos embrionarios de codornices y pollos por microcirugía y digestión enzimática conservando sus propiedades biológicas. Después de aislamiento, los tejidos de ambas especies se asocian en un ensayo in vitro organotypic de 48 h. de codorniz y los tejidos de pollo pueden ser discriminados por las características nucleares distintas y marcadores moleculares, lo que permite el estudio de la diafonía celular entre heteroespecíficas Asociación de tejidos. Este enfoque es, por lo tanto, una herramienta útil para el estudio de las interacciones de tejido complejo en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas, tales como ésos que ocurren durante la morfogénesis faríngea y la formación del foregut órganos derivados del endodermo. Este enfoque experimental primero fue desarrollado para estudiar las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación del timo. En este sentido, el rudimento tímico potencial derivados del endodermo y mesodermo derivado mesenchyme, fueron aislados de embriones de codorniz y de pollo, respectivamente.

La capacidad de los tejidos asociados para generar órganos puede probarse más por injerto sobre la membranas corioalantoideas (CAM) de un embrión de pollo. El CAM proporciona nutrientes y permite intercambios de gases a los tejidos explanted. Después de 10 días de desarrollo de ovo, los órganos quiméricos pueden ser analizados en los explantes cosechados por los métodos morfológicos convencionales. Este procedimiento también permite estudiar las contribuciones específicas de tejido durante la formación de órganos, desde su desarrollo inicial (desarrollo in vitro) la fase final de la organogénesis (en desarrollo de ovo).

Por último, el método de aislamiento mejorado también proporciona tridimensionalmente (3D) conserva los tejidos embrionarios, que también pueden utilizarse para el análisis topográfico de alta resolución de los patrones de expresión génica específica de tejido.

Introducción

En la década de 1970, un sistema elegante de codorniz-gallina de quimera fue desarrollado por Le Douarin, abriendo nuevas vías para entender el papel de la migración celular y las interacciones celulares durante el desarrollo^1,2. El modelo fue ideado en la premisa de que del intercambio entre las dos especies no molestaría considerablemente embriogénesis, confirmado más adelante cuando se utiliza para el estudio de numerosos procesos de desarrollo, incluyendo la formación de nervioso y las hematopoyéticas sistemas¹. Tomando este último como un ejemplo, las ondas cíclicas de progenitores hematopoyéticos colonizando el rudimento epitelial tímica se observó por primera vez utilizando el sistema quimera de codorniz-gallina de³. Para ello, el territorio prospectivo del timo, el endodermo de las bolsas de tercer y cuarto faríngeos (3/4PP), era mecánica y enzimáticamente aislado de embriones de codorniz (q) en 15 - 30 etapa somite [día embrionario (E) 1.5-E2.5]. Estas etapas corresponden a pollo Hamburger y Hamilton⁴ (HH) - 12-17. Los procedimientos de aislamiento comenzaron con el uso de la tripsina enzimáticamente disociar el endodermo de la mesénquima adjunto. El endodermo aislado se injertó en la región de la somatopleura de un embrión de pollo (c) de host en el E3-E3.5 (HH-etapas 20-21). Este mesénquima heteróloga consideró "permisivo" para el desarrollo de epitelio tímico, contribuyendo también a la formación de órganos³. Después, sucesivas oleadas de las células del progenitor transmitidas por la sangre del huésped pollo se infiltraron en la codorniz donantes tímicas epiteliales contraparte contribuyendo a la formación del timo en el embrión huésped del³.

Más recientemente, una versión modificada de este método fue demostrada para ser importante para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo⁵. En este sentido, los tejidos involucrados en la formación del timo ectópico en embriones quiméricos³ fueron aislados de embriones de donante y huésped y asociados ex vivo. Se utilizó un protocolo mejorado para aislar el endodermo 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) y el mesodermo de la somatopleura de pollo (E2.5-E3). Brevemente, los tejidos embrionarios se aislaron por microcirugía y digestión in vitro pancreatina. Además, las condiciones de digestión enzimática, temperatura y tiempo de incubación fueron optimizadas según el tipo de tejido y etapa de desarrollo (tabla 1).

A continuación, los tejidos aislados se asociaron en un organotypic sistema vitro durante 48 h, como previamente divulgados^5,6. La Asociación in vitro de tejidos imita las interacciones locales de celulares en el embrión, superando algunas limitaciones de la manipulación en vivo. Este sistema es particularmente útil para el estudio de las interacciones celulares en complejos eventos morfogénicos, como el desarrollo del aparato faríngeo.

La contribución de cada tejido en la histogénesis del timo, así como la capacidad de la Asociación heteroespecíficas para generar un timo puede ser más explorado utilizando la metodología de CAM, anteriormente detallada^5,7,8. Sucintamente, los tejidos cultivados fueron injertados en la leva de embriones cE8 y permitió desarrollar en ovo por 10 días. Entonces, formación de timo fue evaluada mediante análisis morfológico de los explantes cosechados. Como en la clásica de codorniz-gallina de estudios³, el epitelio tímico de codorniz fue colonizado por las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs) derivadas del embrión de pollo, que fue demostrado más adelante para contribuir al desarrollo de órgano^9,10 . Los HPCs emigraron del embrión a timo ectópico quimérico a la altamente vascularizado CAM^5,7,8. Codorniz derivada epitelio tímico puede identificarse por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, QCPN - MAb codorniz PeriNuclear), superación de la necesidad de marcadores moleculares específicos de tejido.

Este método experimental, como el enfoque de dos pasos registrado en la anterior publicación⁸, permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos in vitro y en el desarrollo de ovo. También, los explantes se pueden cosechar en cualquier momento del curso del experimento⁸.

Por último, el protocolo de aislamiento aquí detallado permite la preservación de las propiedades naturales y 3D-arquitectura de los tejidos embrionarios, particularmente útiles para detallar patrones de expresión génica en situ de territorios embrionarios de lo contrario inaccesibles por métodos convencionales. Además, enfoques de análisis del transcriptoma, incluyendo RNA-seq o microarrays, pueden también aplicarse en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos mientras que proporciona un análisis de alto rendimiento de tejidos específicos "ómicas".

Protocolo

Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. incubación de huevo de codorniz y pollo de fertilizan

1. Lugar fertilizado huevos de codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) en una incubadora humidificada de 38 ° C durante 3 días. Incubar los huevos (extremo romo del huevo) hacia arriba en la cámara de aire.
   Nota: El ambiente humidificado se logra colocando un recipiente de agua en la parte inferior de la incubadora.
2. Incubar huevos fertilizados del pollo (Gallus gallus) 2,5 días en una incubadora humidificada de 38 ° C. Incubar los huevos en posición horizontal y marque la parte superior usando un pedazo de carbón para identificar la ubicación del embrión.
   Nota: Comience con huevos de codorniz 40 y 60 huevos de gallina al establecer este experimento.

2. aislamiento del endodermo de la codorniz que contiene el dominio prospectivo de rudimento tímico

Nota: Use una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales para los procedimientos de manipulación del huevo en condiciones estériles.

1. Quitar la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico, la región faríngea de arco que contiene el^rd de 3 y 4^th arcos (3/4PAR), como se describe^7,8.
   1. Llene un recipiente grande de vidrio borosilicato (100 x 50 mm, 100 cm³) con 60 mL de frío con tampón fosfato salino (PBS).
   2. Con la ayuda de tijeras curvas, toque y corte un orificio circular en la cáscara de una codorniz huevo que ha sido incubada durante 3 días. Hacer el agujero en el lado opuesto del huevo Romo y transferencia de la yema (con embrión) a la taza con PBS frío.
   3. Retire el embrión de la yema cortando la membrana vitelina externamente a los vasos extra embrionarios con tijeras curvas.
   4. Con la ayuda de Pinzas finas, transferencia del embrión a un recipiente pequeño (60 mm x 30 mm; 15 cm³) llena con 10 mL de PBS frío.
   5. Con una espumadera, pasar el embrión a una placa de Petri con una base negra de 100 mm (véase Tabla de materiales) que contienen 10 mL de PBS frío y colocarlo bajo un estereomicroscopio.
   6. Diseccionar el 3/4PAR, como se describió previamente⁸.
   7. Aspirado el 3/4PAR y transfiéralo a un plato de cristal tres cuartas partes llenaron de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
2. Aislar el endodermo que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico (el endodermo 3/4PP) por digestión enzimática con pancreatina.
   1. Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, 3/4PAR transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de frío pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).
   2. Incubar durante 1 h en el hielo para la digestión enzimática.
      Nota: El tiempo de digestión enzimática depende de la etapa del desarrollo (tabla 1).
   3. Coloque el plato de vidrio bajo el estereomicroscopio (aumento de x-60 x 40) para aislar el endodermo de la 3/4PAR.
      Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 15 min). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada.
   4. Para aislar el endodermo de los tejidos circundantes, utilice dos microscalpels de acero inoxidable en los titulares de pin.
      Nota: Utilice microscalpels con un diámetro entre 0,1 mm y 0,2 mm y níquel pasador titulares con un diámetro de abertura de quijada de 0 mm a 1 mm.
      1. Primero retire el tubo neural y mesodermo unido a la superficie dorsal del endodermo faríngeo.
      2. Con el lado dorsal hacia arriba, con cuidado separar y quitar el mesénquima entre los arcos faríngeos y exponer las bolsas faríngeas. Realizar este procedimiento en ambos lados de la 3/4PAR.
      3. Retire el tubo del corazón y el mesénquima que rodea las bolsas anteriores.
      4. Con la parte ventral hacia arriba, corte del ectodermo de la 2^º y 3^rd arcos faríngeos y retire con cuidado el mesénquima a las bolsas. Repita este procedimiento en el otro lado de la 3/4PAR. En esta etapa el rudimento de la tiroides debe ser visible.
      5. Retire cualquier restantes células mesenquimales que atado al endodermo faríngeo con el dos microscalpels.
      6. Hacer un corte transversal entre el 2^y y 3^rd PP, disociando el endodermo faríngeo que contiene el^rd de 3 y 4 bolsas del^th de la parte anterior del endodermo que el rudimento de la tiroides y 2^nd bolsa faríngea.
      7. Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia el endodermo 3/4PP aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de suero bovino fetal (FBS) de frío de 100%.
3. Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Alternativamente, pueden preservarse tridimensionalmente los tejidos aislados y analizados in situ para la expresión génica.

3. aislamiento de mesodermo somatopleura de pollo

Nota: Ejecutar el huevo procedimientos de manipulación en condiciones estériles, utilizando una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales.

1. Quitar el territorio embrionario que contiene el mesodermo de la somatopleura del nivel de los somitas 19-24 (ss19-24).
   1. Retirar el huevo del pollo de la incubadora después de 2,5 días de incubación.
   2. Con tijeras curvas, abra un pequeño agujero en la cáscara. Inserte una aguja y aspirar 2 mL de albúmina con una jeringa de 10 mL para bajar volumen de albúmina dentro del huevo y evitar daños del embrión (ubicado debajo de la región marcada de la cáscara). Deseche la albúmina aspirada.
   3. Corte circular (hasta dos tercios de la superficie superior) del agujero en la región marcada del caparazón con unas tijeras curvas.
   4. Cortar la membrana vitelina externamente a los vasos extraembrionarias mientras sostiene el embrión con pinzas finas.
   5. Bajo un estereomicroscopio, colocar el embrión en una placa de Petri de 100 mm con una base negra que contiene 10 mL de PBS frío.
      Nota: Use un estereomicroscopio de aquí en adelante para un aumento progresivo de los procedimientos de microcirugía.
   6. Use cuatro pernos insectos delgados para mantener el embrión en la parte inferior de la placa. Coloque los pernos en la región extraembrionarias formando un cuadrado.
   7. Realizar dos cortes entre las somitas 19 y 24 transversalmente en el eje embrionario y cruzar todo el territorio embrión, utilizando tijeras de ojo de wecker.
   8. Liberar la sección embrión, ss19-24, por marginal embrionaria bordes de corte.
   9. Los tejidos aspirados ss19-24 y transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes llenan de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
2. Aislar el mesoderm lateral de la región de la somatopleura (ss19-24) por digestión enzimática con pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).
   1. Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia de los tejidos ss19-24 a un vaso plato tres cuartos llenados con solución fría de pancreatina.
   2. Incubar durante 30 min en hielo para la digestión enzimática.
   3. Bajo el estereomicroscopio, aislar el mesodermo de los tejidos circundantes con dos microscalpels en un soporte.
      Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 10 min.). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada.
   4. Durante el aislamiento del mesodermo, primero retire el ectodermo en la superficie, seguida por la separación cuidadosa de los tejidos splancnopleura situado ventralmente.
   5. Suelte el mesodermo lateral derecho de la somatopleura cortando en un movimiento paralelo al tubo neural.
   6. Repita la separación del mesodermo del lado izquierdo del embrión.
      Nota: Hacer lentos movimientos de microscalpel durante este procedimiento. Las proteínas de la matriz extracelular expuesta se pegan a los tejidos e instrumentos de prevención de movimientos fluidos.
   7. Con la ayuda de una espátula y pinzas finas transferencia el mesodermo aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de equipos frío.
3. Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro.

4. In vitro organotypic ensayo: heteroespecíficas Asociación de endodermo 3/4PP de codorniz y pollo somatopleura mesodermo

1. Preparar el medio de cultivo con Medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS y 1% pluma/Strep^3,5.
2. Colocar una rejilla metálica en una placa de Petri con 5 mL de medio de cultivo de 35 mm.
   Nota: Retire el exceso de líquido a nivel de la superficie del medio con la parte superior de la rejilla.
3. Con la ayuda de Pinzas finas, un filtro de membrana de la inmersión en el medio de cultivo y colocarla en la parte superior de la cuadrícula para tener una superficie de contacto con el aire.
   Nota: Un cuarto de la superficie de la membrana (con 13 mm de diámetro) es adecuado para la Asociación de tejidos.
4. Bajo el estereomicroscopio, asociar los tejidos aislados en la parte superior del filtro de membrana. Primero transferir el endodermo 3/4PP (paso 2) desde el plato de vidrio suave deslizamiento con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Repita este procedimiento para el mesodermo aislado (paso 3).
   Nota: Con la ayuda de un microscalpel, mezcla de los tejidos para maximizar su asociación.
5. Coloque cuidadosamente los tejidos asociados en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO₂ para tejidos cultivados 48 h. pueden ser injertados en la membranas corioalantoideas (CAM).
   Nota: La formación ectópica de órgano en la leva fue anteriormente detallada⁸.

Resultados

El protocolo detalla un método para aislar los tejidos embrionarios aviares a utilizarse en varios métodos técnicas de biología celular y del desarrollo. Este método fue empleado anteriormente para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo⁵. Aquí, nuevos resultados se muestran en la figura 1 y figura 2, usando métodos similares.

Discusión

El procedimiento de aislamiento de tejido embrionario detallado aquí fue mejorado de las técnicas anteriores para producir embriones quiméricos pollo codorniz en contextos biológicos^3,5,6.

Este enfoque es adecuado para aislar los tejidos embrionarios puros sin necesidad de manipulación genética o el uso de marcadores específicos de tejido, que son a menudo indeterminado, limitar el uso de model...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80